Ce travail a été soutenu par le ministère État de New York de la Santé (C026878). MS était à New York Stem Cell Foundation Fellow Druckenmiller. Soutenu en partie par subvention de recherche n ° 5 FY11-571 de la Mars of Dimes Foundation.

1. Préparation de cellules nourricières Notez que tous les réactifs décrits ci-dessous doivent être préparés de manière stérile (voir les tableaux 1 et 2). Ce protocole utilise la lignée cellulaire JK1 (Cell Biolabs, Inc, catalogue # ABC-315) que les mangeoires qui est un dérivé de transformer des cellules adultes de souris somatiques testiculaires et a été décrit ailleurs 3. Notez également que toutes les procédures sur les animaux doit être effectuée conformément aux directives et règlements institutionnels. <ol><li> JK1 cellules peuvent être maintenues en culture et utilisées avec succès comme dispositifs d&#39;alimentation à passage 39. Culture JK1 cellules dans une boîte de 100 mm de culture cellulaire (BD Falcon, catalogue n ° 353003) avec 10 ml de milieu de croissance d&#39;alimentation stérilisée par filtration (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques). Lorsque la culture atteint la confluence de 95%, divisez les cellules 1:06 -1:10 rapport. </li><li> Éliminer le milieu de confluence JK1 mono cellules nourricièrescouche. </li><li> Laver couche de cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium. </li><li> Ajouter préchauffé trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM d&#39;EDTA; Cellgro Corning, catalogue n ° 25-051-CI), et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min. </li><li> Inactiver la trypsine avec un volume égal de milieu de croissance chargeur. Recueillir des cellules et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance chargeur. </li><li> Pré-manteau plaques multi-puits culture cellulaire en ajoutant suffisamment de 0,4% solution de gélatine pour couvrir le puits et retirer au bout de 5 min à température ambiante. </li><li> Plaque ~ 250 cellules par mm 2 de gélatine revêtu plaque de culture cellulaire (par exemple le format 48-puits ou 6-puits). Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 à 24 heures. </li><li> Retirer milieu de culture à partir de puits. ATTENTION: Pour désactiver la croissance des cellules, ajouter une nouvelle solution de mitomycine C à 10 pg / ml dilué dans du DMEM à chaque puits (par exemple, 200 pl / puits d&#39;une plaque de 48 puits). Mitomycine C est toxique. Manipulez et jetez-le avec soin. Incuber à37 ° C pendant 4 h. </li><li> Retirer la mitomycine C solution de cellules. Laver 3 fois avec du DMEM avant des cellules souches de placage. </li><li> Retirer du DMEM à partir de cellules nourricières puits et ajouter suffisamment de support de cellules souches (100 pl / puits d&#39;une plaque 48 puits, voir le tableau 3) pour éviter la dessiccation des mangeoires au cours de passages. Ajouter SSC Le même jour, tel que décrit ci-dessous dans les sections 3.1 ou 3.4, avec des tailles indiquées de puits contenant des mangeoires. </li></ol> 2. Dissociation de la souris testicule tissu pour obtenir des cellules germinales des bailleurs de fonds <ol><li> Testicules de souris adultes récolte de façon stérile et stocker temporairement les testicules dans un plat recouvert de Petri (sans ajout de liquide). Le plat doit immédiatement placé sur la glace pour empêcher la dessication et de maintenir la viabilité des cellules. </li><li> En utilisant une pince fine stériles et un ciseau bien dans une hotte de culture cellulaire, faire une incision transversale dans la tunique albuginée sans complètement sectionnant le testicule (c.-à-cut ~ ½ - ¾ à distance through) et utiliser une pince pour faire sortir les tubes séminifères dans un coin de la plaque; tunique de défausse et tissus ci-joint. Gardez la plaque sur la glace tout au long de garder les tissus réfrigérés, et sauvegardent ainsi leur intégrité et prévenir l&#39;évaporation. </li><li> Rapidement émincer tubules avec des ciseaux à ressort fines au moins 3 min par les testicules, tout en gardant la plaque sur la glace. </li><li> Ramassez les fragments de tubules dans un tube conique de 50 ml et laver à ~ 40 ml de sérum de veau glacée PBS / 1% d&#39;albumine. </li><li> Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les fragments de tubules de spermatozoïdes et de débris. Rejeter le surnageant. </li><li> Dans un tube de 15 ml conique, remettre en suspension le culot dans 3 ml par de testicule préchauffé tampon de dissociation (DMEM, la trypsine 0,05%, 0,03% collagénase de type I, 80% d&#39;U / ml de DNAse I et la sérum albumine bovine 0,5; Voir Tableau 2 pour des détails plus spécifiques de tampon de dissociation). </li><li> Placer le tube conique horizontalement dans un support en un ensemble agitateur à 150 tours par minute à 37 ° C pendant 15 min afin de maximiser unegitation. </li><li> Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les cellules individuelles de morceaux non dissociées. </li><li> Enregistrer les morceaux culot contenant jusqu&#39;à l&#39;étape suivante. Recueillir le surnageant de l&#39;étape 2.8 et ajouter 3 ml DMEM/10% de sérum de veau foetal à neutraliser tampon de dissociation. Placer le tube sur la glace temporairement. </li><li> Répétez l&#39;étape 2,6 à 2,7 avec le culot de l&#39;étape sauvé 2,9 à re-digérer les morceaux restants après l&#39;étape 2.8. </li><li> Ajouter un volume égal de DMEM/10% de FBS pour neutraliser tampon de dissociation. </li><li> Suspension de l&#39;étape recombinent avec suspension cellulaire 2,11 sauvegardé à l&#39;étape 2.9. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Resuspendre le culot dans un milieu de cellules souches dans un volume de 16 ml par paire de testicules (voir le tableau 3). </li></ol> 3. Placage de suspension de cellules testiculaires <ol><li> Planche 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des cellules de 6 puits plaque d&#39;alimentation contenant mitotiquement-inactivé par la mitomycine C et placer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ans &amp;deg; C dans 5% de CO 2. </li><li> Après 48 heures, moyen aspiration, ajouter 2 ml de milieu frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Après 48 heures, on ajoute 0,5 ml de milieu frais de cellules souches dans chaque puits et retourner à l&#39;incubateur. </li><li> Après 48 heures, puis nourrir les cellules trois fois par semaine par la suite jusqu&#39;à ce que suit grandes colonies discrètes (&gt; 50 cellules) semble (dans les 7 à 21 jours). Pour la première et la deuxième nourrir chaque semaine (par exemple le lundi et le mercredi) supprimer ~ 50% de la moyenne et rajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l&#39;alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Cette approche est basée sur l&#39;idée que l&#39;évitement des changements de milieu complet minimise les fluctuations dans les concentrations de signaux paracrines qui sont sécrétées dans le milieu de culture 9. </li></ol> 4. Cueillette colonie de Premier Passage <ol><li> Retirer moyen de puits contenant des colonies à être repiquées et ajouter du milieu frais sur les cellules souches. </li><li> Identifier les colonies en utilisant un objectif 10x. Avec le microscope légèrement défocalisé, les colonies SSC au bord du puits apparaît comme homogènes amas brillants, composées de nombreuses cellules 11-12 pm de diamètre, dans laquelle il est difficile, voire impossible, de discerner les bordures des cellules individuelles, puisque les cellules apparaissent fusionnés (figure 1A). Non-SSC colonies peuvent apparaître plus foncées, plus granulaire, ou moins homogène, avec des frontières discernables (figure 1A, en médaillon). </li><li> En utilisant une pointe de pipette 200 ul, avec l&#39;ensemble pipetteman à 50 pi, tout d&#39;abord prendre moyennes du puits et expulser pour mouiller la pointe. Ensuite, pousser gentiment la colonie avec la pointe avant de retirer rapidement 50 ul de milieu de déloger la colonie par aspiration dans la pointe (figure 1B). </li><li> Expulser le milieu contenant la colonie dans un puits d&#39;une plaque à 48 puits contenant des cellules nourricières inactivées avec 100 ul de milieu de cellules souches (figure 1C). </li><li> Répétez l&#39;étape4.3 et ajouter jusqu&#39;à 8 colonies au même puits sans excéder 500 pi par puits. </li><li> Répétez les étapes 4,3 à 4,5 pour préparer d&#39;autres puits de la plaque de 48 puits avec des colonies de passage SSC un. </li><li> Wells sera prêt à diviser en 7-14 jours ou après de grosses touffes de jusqu&#39;à 500 cellules ont vu le jour (figure 1D). </li></ol> 5. L&#39;expansion ultérieure et repiquage des SSC par trituration <ol><li> Cellules à passage ne doit être repiquée sur mangeoires frais après un maximum de 14 jours à un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages, puis 01 heures 04-01:06 (tous les 7 jours) par la suite comme suit. Doucement triturer colonies hors d&#39;un puits semi-confluente (par exemple ~ 300.000 SSC / puits de 6-puits) avec une pointe de pipette 1 ml de milieu de lavage à travers les cellules. Les colonies peuvent être vus se détacher. Trop de force avec le courant de liquide pourrait causer des cellules nourricières indésirables à se détacher aussi. </li><li> Recueillir des cellules triturées dans un tube conique et centrifuger à 300 xg pendant5 min. Remarque: Une étape trypsination peuvent être ajoutés en toute sécurité ici si désiré par l&#39;investigateur. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de cellules souches frais en fond de pipetage de haut en bas de perturber les colonies. </li><li> SSC plaque sur des cellules nourricières inactivées fraîchement préparés avec de la mitomycine-C, comme décrit dans la section 1. </li><li> Nourrir les cellules trois fois par semaine comme suit. Pour l&#39;alimentation premier et le deuxième (par exemple le lundi et le mercredi) ajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l&#39;alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Plaques deviendra confluente dans les 7-10 jours. Les cultures doivent être composé de cellules germinales&gt; 98% (c.-à &lt;1% contaminants cellules somatiques) après des passages 5-7, basé sur immunomarquage (par exemple en utilisant la souris sur les cellules germinales marqueur GCNA) pour distinguer les cellules germinales à partir de cellules somatiques 10. Remarque: Ces méthodes ont été développées dans le respect des règlements et des exigences fixées par l&#39;institutionprotection des animaux et le Comité al utilisation au Weill Cornell Medical College. </li></ol>

<ol>
	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

MS reçoit des redevances d&#39;Weill Cornell Medical College grâce à une licence to Cell Biolabs, Inc pour distribuer JK1 cellules.

Cette méthode pour dériver SSC adultes utilisant des cellules nourricières testicule adulte dérivés est robuste et a réussi quand communs origines génétiques (par exemple FVB, C57BL6 et 129SV/C57Bl/6 mixte) et différentes souches mutantes ont été utilisées 2,3,7,14. En fait, le micro-environnement créé par le système de culture est suffisante pour surmonter certains des obstacles génétiques au maintien SSC adultes in vivo (par exemple dans le cas de PLZF <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluant pour tampon de dissociation </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de base de cellules souches (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Nécessite une complémentation selon Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Tige suppléments moyen de cellules </td><td> divers </td><td> voir le tableau 3 </td><td> Nécessite une complémentation selon Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 cellules </td><td> Cellule Biolabs, Inc </td><td> ABC-315 </td><td> Peuvent se substituer aux cellules stromales adultes testiculaires que par Seandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomycine-C (ATTENTION) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Toxique; manipuler avec précaution. </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Solution à 0,4% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> EVOS xl numérique microscope inversé </td><td> Groupe de microscopie avancée </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques. * Voir le tableau 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluant pour tampon de dissociation </td></tr><tr><td> trypsine (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,05% p / v </td></tr><tr><td> collagénase, de type I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,03% p / v </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigmun-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Tampon de dissociation: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> sérum albumine bovine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,5% p / v </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Tampon de dissociation </td></tr><tr><td> StemPro-34 GDF </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 supplément nutritif </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Des frais supplémentaires ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM vitamine solution </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> sérum albumine bovine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycotique Solution </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progestérone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> sérum de veau fœtal </td><td> variable </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> holo-transferrine bovine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 pg / ml </td></tr><tr><td> insuline </td><td> Gémeaux Bioproduits </td><td> 700-112P </td><td> 25 pg / ml </td></tr><tr><td> GDNF humain </td><td> Vie Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF humain </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF de souris </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescine </td><td> Biologique Recherche </td><td> 0778P </td><td> 60 uM </td></tr><tr><td> sélénite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> acide pyruvique </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 pg / ml </td></tr><tr><td> Acide DL-lactique </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 pg / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 pM </td></tr><tr><td> l&#39;acide ascorbique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 pM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 3. Tige milieu cellulaire </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Remarque: Ajoutez les suppléments ci-dessous avant d&#39;utiliser à moyen terme. Stériliser par filtration et le conserver à 4 ° C. Le milieu est stable pendant au moins 2 semaines. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Nous avons utilisé différents fabricants, les formulations, et / ou des numéros de lot de ces réactifs, sans effets délétères apparents. En général, les réactifs de culture de cellules de qualité doivent être employées. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l&#39;animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l&#39;auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l&#39;étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières 1-3. Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d&#39;obtenir des lignées de cellules adultes 4. Toutefois, le testicule continue d&#39;évoluer jusqu&#39;à environ 5 semaines d&#39;âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l&#39;architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d&#39;expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d&#39;équilibre. Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d&#39;abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l&#39;âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques 5,6. En outre, comme avec d&#39;autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l&#39;aide d&#39;une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres 7. Stratégies couramment utilisées comprennent l&#39;utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d&#39;un ratio plus élevé de cellules souches à d&#39;autres types cellulaires 8. Sur la base de l&#39;hypothèse que l&#39;élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l&#39;enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC 2,3. La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l&#39;adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d&#39;une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) 3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l&#39;enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d&#39;auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu&#39;il permet SSC pour rendre le passage difficile de l&#39;auto-renouvellement in vivo à long terme d&#39;auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.

L&#39;apparition de passage à zéro de type sauvage, adultes colonies SSC après 7 jours est illustré à la figure 1. Tridimensionnelles colonies sont constituées d&#39;une couche de cellules plates fixées à des dispositifs d&#39;alimentation ou de la matrice extracellulaire subalterne déposés par les dispositifs d&#39;alimentation avec des couches multiples de SSC croissance sur le dessus. Bien SSC sains sont brillamment réfringente et uniformément de 11 à 12 um de diamètre, les bordures de ...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines at JoVE.com

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.

Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

13.7K vues.  Weill Cornell Medical College. Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.

Vidéo: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Recherche

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...