Produit par Loredana Manfra de l&#39;Institut pour la protection de l&#39;environnement et de la recherche (ISPRA-ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement) et Federica Savorelli de l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement (Emilie-Romagne, Italie). Membres de référence pour le Groupe de travail sur les sous-le crustacé Artemia au sein du Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM (l&#39;institut de normalisation technique d&#39;exploitation dans le secteur de la chimie). Vidéographie et montage par Marco Pisapia de l&#39;ISPRA (Web de l&#39;Unité). Coordination de la production par Anna Maria Cicéron et Erika Magaletti de l&#39;ISPRA (ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement). Nous tenons à remercier l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement de l&#39;Emilie-Romagne, Ferrare Direction, le Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / saumâtreEau et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM et Luciana Migliore, l&#39;Université Tor Vergata (Rome) pour leur coopération; Rossella Boscolo et Massimo Gabellini de l&#39;ISPRA (Département de la prévention et l&#39;atténuation des impacts) pour leur soutien financier; Fabio Matassa et la London École de langues à Rome pour leur soutien linguistique.

1. La méthode standard Notre test consiste à exposer les larves d&#39;Artemia à un intervalle de concentrations de la substance ou un échantillon d&#39;essai pour la détermination des niveaux de concentration ou de dilution qui causent la mort de 50% des organismes (CL 50) exposés pendant 14 jours et répondant aux conditions définies par cette méthode. Si nécessaire et possible, celui-ci peut également être déterminée: a) le niveau de concentration qui provoque la mort de 20% des organismes exposés (LC 20); b) le niveau le plus élevé de concentration qui n&#39;a pas analysé de déterminer un taux de mortalité plus élevé que celui de le contrôle négatif (CSEO), le niveau plus faible concentration testée qui détermine, après 14 jours, soit un taux de mortalité plus élevé que celui du contrôle négatif (CMEO). 2. Testing Materials 2.1 oeufs d&#39;Artemia Pour effectuer des tests, Artemia franciscana </emLarves&gt; de moins de 48 heures anciennes (nauplii) sont tenus, au stade II ou III, obtenue à partir des œufs nouvellement écloses 5. Oeufs certifiés ou des kystes utilisés pour soutenir les essais sont disponibles dans le commerce, par exemple, de la Division de la recherche d&#39;Assurance Qualité, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, États-Unis ou du laboratoire de recherche biologique dans la pollution aquatique, Université de Gand, en Belgique. 2,2 dilution de l&#39;eau D&#39;eau salée synthétique peut être utilisé comme eau de dilution, préparée en dissolvant reconnus réactifs de qualité analytique ou une formulation disponible dans le commerce dans l&#39;eau distillée ou désionisée. Mélanges de sel pour la création de l&#39;eau salée idéale sont disponibles dans le commerce, par exemple, les mélanges Instant Ocean. Il est recommandé une eau de dilution à une salinité égale à 35 (± 2) ainsi que PSU une concentration en oxygène dissous supérieure à 80% de la valeur de saturation et une température de 25 (± 2) etdeg; C Après l&#39;aération pendant 48 heures et de filtration dans des filtres de porosité d&#39;au moins 0,45 m, la dilution peut être conservé pendant un maximum de 30 jours dans l&#39;obscurité à une température de 0-4 ° C. 2.3 Culture des algues Il est recommandé que les organismes d&#39;essai sont l&#39;alimentation sur la Dunaliella tertiolecta microalgues, qui se développent de façon exponentielle et atteignent des densités de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellules / ml. Les essais sur les échantillons de l&#39;environnement exige des cultures avec des densités supérieures à 2,0.10 6 cellules / ml 6. Il est suggéré que Dunaliella tertiolecta pousse dans un milieu de culture contenant l&#39;eau de mer (30 (± 2) et 20 PSU (± 1) ° C) avec l&#39;ajout de nutriments essentiels, des minéraux et des vitamines. Quelques indications sur la composition des algues médias et la préparation sont rapportés dans l&#39;annexe. La densité cellulaire initiale est suggéré à environ 10 5 cellules / ml. La culture d&#39;algues est maintenu dans unthermostat d&#39;ambiance à 20 (± 1) ° C, éclairé par des lampes fluorescentes 3000 (± 300) lx, avec un ratio photopériode de 16 heures de lumière à 8 heures d&#39;obscurité. Autres espèces de phytoplancton pourrait également être utilisé pour l&#39;alimentation, mais il serait nécessaire de faire des études comparatives avec ces espèces de phytoplancton pour trouver les «équivalent» à Dunaliella espèces tertiolecta, parce que les conditions expérimentales (par exemple des densités cellulaires initiales, l&#39;éclairage de lumière, température, composition de la milieux de culture et temps d&#39;exposition) varie selon les espèces de phytoplancton. Outre la tolérance de la micro-algues à différents polluants doit être pris en compte car les effets des polluants sur la croissance et le développement de l&#39;impact du phytoplancton aussi à l&#39;Artemia. 2,4 substance de référence La substance de référence dans ce test est le dodécylsulfate de sodium. 2.5 Verrerie de laboratoire <ol><li> Conteneurs d&#39;essais, y compris 100 ml béchers en verre de borosilicate (18 pour effectuer des tests et 18 pour le transfert de solutions). </li><li> Un flacon (flacon de 500 ml par exemple) pour préparer la solution standard. </li><li> Six flacons (par exemple 200 flacons ml) de préparer les solutions de test. </li><li> Verre ou polystyrène 5 cm de diamètre des boîtes de Pétri avec amovible couvre à être utilisé pour activer les kystes et transférer Artemia de l&#39;antenne d&#39;éclosion pour les récipients d&#39;essai. </li><li> Pipettes Pasteur en verre (avec des pointes arrondies par la flamme) pour transférer les nauplii. </li><li> Verre canules ou Pasteur 3 ml pipettes en plastique jetables (à couper) pour transférer Artemia. </li><li> Micropipettes et pipettes graduées pour préparer les solutions de test. </li><li> Six éprouvettes graduées (par exemple 50 ml cylindres) pour le transfert de solutions de test à partir des flacons à til tester les conteneurs. </li></ol> 3. Activation kyste 3,1. Boîtes de Pétri contenant des kystes + de verser de l&#39;eau Pour générer les organismes d&#39;essai, 20 mg de kystes sont placés dans une boîte de Pétri contenant 12 ml d&#39;eau de dilution de 48 heures avant le test. 3,2. L&#39;incubation à la lumière et dans l&#39;obscurité La boîte de Pétri est maintenue à 25 (± 2) ° C et à une 4000 (± 1000) lux (lumens par mètre carré) intensité de la lumière pendant une heure. 3,3. Remplacement de la moyenne à l&#39;aide du microscope Après 24 heures, les larves sont transférées dans l&#39;éclosion d&#39;un nouveau plat de Pétri remplie d&#39;eau artificielle. Le transfert est effectué à l&#39;aide du microscope, c&#39;est à dire en utilisant une source de lumière de telle sorte que l&#39;éclosion, les larves migrent vers phototropique le faisceau de lumière. Une pipette Pasteur en verre est utilisé pour effectuer le transfert, veiller à ce que seules les larves naissant are transférées et non les kystes ou les larves encore dans les membranes. 3,4. L&#39;incubation dans l&#39;obscurité Le plat contenant les larves est placé dans une chambre noire thermostatique pour 24 heures à 25 (± 2) ° C. 4. Préparation des solutions d&#39;essai 4,1. Pesant la substance + de transférer dans le ballon Il est recommandé que la solution standard pour la substance de test est préparée en dissolvant 0,5 g de la substance dans un flacon de 500 ml. Le ballon est rempli avec de l&#39;eau déminéralisée ou distillée et la solution est agitée jusqu&#39;à ce que la substance de test est complètement dissous. Des solutions doivent être préparés au moment de l&#39;utilisation, sauf si on ne sait pas si la substance est stable en solution. Dans ce cas, la solution standard peut être préparée jusqu&#39;à deux jours avant les tests. 4,2. Préparation du contrôle négatif, ajoutant de l&#39;eau de dilution et les algues wie la pipette de 10 ml Le contrôle négatif est préparée dans un flacon (par exemple le volume de 200 ml) en ajoutant une aliquote de la suspension d&#39;algues à l&#39;eau de dilution de telle sorte qu&#39;une densité de 10 5 cellules / ml est obtenue. 4,3. Préparation des solutions de test: ajouter de l&#39;eau de dilution, les algues et solution standard Il est suggéré que des solutions de test sont préparés dans cinq flacons 200 ml en ajoutant la solution standard pour l&#39;eau de dilution dans les quantités spécifiées de telle sorte que les concentrations souhaitées pour les tests est obtenu. Pour nourrir les organismes, des parties aliquotes d&#39;une suspension Dunaliella microalgues tertiolecta peuvent être utilisés et ajoutés à atteindre une densité de 10 5 cellules / mL lorsque des solutions de test sont préparés. L&#39;ordre de plus il est recommandé: l&#39;eau de dilution, la suspension d&#39;algues et de solution standard. Après la préparation de solutions de test, ils doivent être utilisés dans le test dès que possible. 4,4. Transfert des solutions à partir du ballon à des conteneurs de test, puis aux boîtes de Pétri Des quantités égales (50 ml) des solutions de test sont introduits dans les récipients d&#39;essai utilisant le cylindre gradué. Trois répliques pour chaque concentration sont faites. Pour chaque série de tests, un conteneur de contrôle est préparé avec une quantité d&#39;eau de dilution égal au volume des solutions de test. Des volumes égaux (environ 12 ml) des solutions de test sont introduits dans les boîtes de Pétri. Pour chaque série de tests, un plat de contrôle de Petri est utilisée. 5. Préparation pour les essais 5.1. Nauplii au stade II-III Quarante-huit heures après l&#39;activation du kyste, les nauplii atteindre le stade II-III des larves et sont ensuite utilisables pour les tests. 5,2. Transfert Nauplii dans les boîtes de Pétri à l&#39;aide du microscope La boîte de Petri utilisé pour un kyste<html> activation est retiré de la chambre thermostatique. Une petite quantité de larves sont transférées dans les boîtes de Pétri contenant le contrôle et les solutions de test. Cette tâche doit être effectuée avec le microscope en utilisant une pipette de diamètre suffisamment large afin que les organismes ne soient pas endommagés. Dans cette phase de l&#39;essai, le transfert peut être effectué avec une pipette Pasteur en verre (avec bout arrondi par une flamme) et une source de lumière positionnée latéralement qui encourage l&#39;Artemia à l&#39;agrégation. 5,3. Transfert Nauplii des boîtes de Pétri dans les récipients d&#39;essai avec le microscope Dix larves sont transférées à partir des plats de test solutions de Pétri aux récipients d&#39;essai. De plus, cette opération doit être effectuée en utilisant la pipette Pasteur et le microscope. Il est recommandé que le volume n&#39;excède pas 1 ml est transféré lors du passage des larves de ne pas affecter le volume global du système d&#39;essai. e_step &quot;&gt; 5.4. Les conteneurs pleins recouverts de parafilm Les béchers essais sont couverts avec du parafilm (en laissant un espace pour le passage de l&#39;air), et maintenu à une température de 25 (± 2) ° C pendant toute la durée de l&#39;essai et à un éclairement de 900 (± 100) lx avec une photopériode ratio de 14 heures de lumière à 10 heures d&#39;obscurité. 6. Remplacement du Supplément de moyen et de l&#39;Alimentation 6,1. Le taux de survie de contrôle Deux jours après le test a commencé, et puis après quelques jours 5, 7, 9 et 12, l&#39;Artemia est observée au microscope afin de vérifier le taux de survie et de remplacer le support et le complément alimentaire. Nombre d&#39;organismes vivants est compté dans chaque récipient d&#39;essai. Après observation au microscope et une légère stimulation mécanique (par exemple de toucher les larves avec une pipette Pasteur en verre) les organismes qui ne présentent pas un mouvement pendant environ 10 secondes devrait être considérée comme morte. 6,2. Préparation d&#39;une solution de test montrant l&#39;échantillonnage d&#39;algues avec une pipette de 10 ml et d&#39;échantillonnage de la substance à tester avec une micropipette. Transfert des solutions du ballon aux récipients d&#39;essai Alors que les essais, les solutions d&#39;essai doivent être remplacés périodiquement, et préparé dans la même journée car ils doivent être utilisés. Les solutions d&#39;essai sont fabriqués à partir de la solution standard préalablement préparé. 6.3. Transfert Artemia, en utilisant une coupe pipette Pasteur, à partir des récipients d&#39;essai de vieux aux trois nouveaux conteneurs Le transfert de l&#39;Artemia est effectuée en utilisant une pipette d&#39;un diamètre suffisamment large pour ne pas endommager les organismes. Pendant cette phase, de 3 ml en plastique pipette Pasteur (à couper) peuvent être utilisés. 6,4. Les larves dans un bécher contenant soit vivant ou mort Artemia Après 1<html> 4 jours d&#39;exposition à la fin de l&#39;essai, le nombre de larves survivantes est compté et enregistré sur la feuille de calcul. CL 50 et / ou LC 20, CSEO et la CMEO de 14 jours, sont calculées et enregistrées, ainsi que les limites de confiance à 95% lorsque des méthodes appropriées, et le calcul. 7. Les résultats représentatifs À la fin de l&#39;essai (14 jours), calculer le pourcentage de mortalité à chaque concentration, selon la formule suivante: (M s / N) * 100 Où: M s est le nombre moyen de personnes sont mortes dans l&#39;échantillon analysé N est le nombre total de personnes exposées Le tableau 1 présente un exemple de données d&#39;un test (14d) avec Artemia exposés à dodécyl sulfate de sodium. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrations (mg / L) </td>&quot;&gt; Nombre de personnes sont mortes dans chaque réplique </td><td> Mortalité (%) </td></tr><tr><td></td><td> Je </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Contrôle négatif </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> En outre, de déterminer laCL 50 par un complot graphique gaussien logarithmique soit en utilisant des méthodes statistiques appropriées (par exemple de Spearman-Karber ou la méthode Probit). Le calcul de la CL 50 pour les données du tableau 1 est de 8,18 (de 7,15 à 9,37) mg / l. Si la concentration maximale testée a provoqué une baisse du taux de mortalité de 50%, vous ne devriez pas procéder au calcul de la valeur CL 50 qui serait alors peu fiables, voire non-calculable. Dans ce cas, cependant, serait approprié de répéter le test en étendant la gamme des concentrations testées. Alternativement, la valeur CL 50 est plus correctement exprimée comme supérieure à la plus forte concentration testée, indiquant peut-être le pourcentage de mortalité à la plus forte concentration testée et la plus forte concentration correspondant à un effet non. Les résultats sont considérés comme valides si à la fin de tester les conditions suivantes sont réunies: <ol class="lalpha"><li> le contrôle de taux de mortalité moyenest ≤ 20%; </li><li> où utilisant dodécylsulfate de sodium, le LC 50 à 14 jours est comprise dans l&#39;8,0 (± 5) mg / l intervalle. </li></ol> Si les conditions ci-dessus n&#39;ont pas été respectées, toutes les données obtenues avec le même lot d&#39;organismes devraient être considérés comme nuls et des tests répétés.

<ol>
	<li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii.">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li><li>Persoone, G., Wells, P. G., Sorgeloos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemia+in+aquatic+toxicology:+a+review.">Artemia in aquatic toxicology: a review.</a> Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. , 259-275 (1987).</li><li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing.">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li><li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).</li><li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. e. m. i. c. h. e. -. V. a. n. D. e. r., Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+â€“+a+critical+analysis.">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li><li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica.">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li><li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp,+Artemia+franciscana.">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li><li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake,+Utah,+USA.">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualit&#225;+dell'acqua+-+Determinazione+della+tossicit&#225;+letale+a+14+giorni+con+Artemia+franciscana+(Crustacea:+Anostraca).">Qualit&#225; dell'acqua - Determinazione della tossicit&#225; letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca).</a> Commissione UNICHIM "Qualit&#225; dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , (2010).</li><li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica.">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Artemia est l&#39;un des organismes d&#39;essai les plus précieuses disponibles pour des essais d&#39;écotoxicité et de la recherche fait jusqu&#39;ici nous permet d&#39;affirmer qu&#39;il est possible de maintenir plusieurs options relatives à l&#39;utilisation d&#39;Artemia en toxicologie et écotoxicologie. Les caractéristiques qui font de cette organisme dans une espèce appropriée pour des essais biologiques sont les suivants: une répartition géographique large, une grande adaptabilité au...

Produit par Loredana Manfra de l&#39;Institut pour la protection de l&#39;environnement et de la recherche (ISPRA-ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement) et Federica Savorelli de l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement (Emilie-Romagne, Italie). Membres de référence pour le Groupe de travail sur les sous-le crustacé Artemia au sein du Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM (l&#39;institut de normalisation technique d&#39;exploitation dans le secteur de la chimie). Vidéographie et montage par Marco Pisapia de l&#39;ISPRA (scientifique consultatif et services de documentation). Coordination de la production par Anna Maria Cicéron et Erika Magaletti de l&#39;ISPRA (ministère de la surveillance de la qualité de l&#39;environnement). Nous tenons à remercier l&#39;Agence régionale pour la protection de l&#39;environnement de l&#39;Emilie-Romagne, Ferrare et la Direction générale de BiologiCal Groupe Méthodes - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l&#39;eau UNICHIM de leur coopération; Rossella Boscolo et Massimo Gabellini de l&#39;ISPRA (Département de la prévention et l&#39;atténuation des impacts) pour leur soutien financier, et la London School of Languages ​​à Rome pour leur soutien linguistique. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de l&#39;article </td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Appendice La algues médias doit être préparé en utilisant des réactifs de qualité analytique. Un litre de solution nutritive est préparée en dissolvant 300 g de NaNO 3, 30 g de KH 2 PO 4 g et 20 de NH 4 Cl dans l&#39;eau distillée. Quatre solutions de départ (A, B, C, D) De minéraux sont préparés comme suit: <ul><li> Un litre de solution &quot;A&quot; contenant 30 g de ZnSO 4 H 2 O, 25 g de CuSO 4 5 H 2 O, 30 g de CoSO 4 7 H 2 O et 20 g de MnSO 4 H 2 O dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;B&quot; contenant 50 g de FeCl 3 • 6 H 2 O dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution de &quot;C&quot; contenant 25 g de Na 2 MoO 4 • H 2 O 2 dans de l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution de &quot;D&quot; contenant 50 g de Na 2 EDTA di • H 2 O 2 dans de l&#39;eau distillée. </li></ul> Un litre d&#39;une solution définitive de minéraux (solution &quot;E&quot;) est obtenu en ajoutant des aliquotes des solutions mentionnées ci-dessus à l&#39;eau distillée. L&#39;ordre de plus il est recommandé: 100 ml de solution &quot;D&quot;, 10 ml de solution «C», 10 ml de solution «B» et 10 ml de solution «A». Trois initiativessolutions L (F, G, H) de vitamines sont préparés comme suit: <ul><li> Un litre de solution de «F», contenant 100 mg de biotine dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;G&quot; contenant 10 g de thiamine dans l&#39;eau distillée; </li><li> Un litre de solution &quot;H&quot; contenant 100 mg de cobalamine dans l&#39;eau distillée. </li></ul> Un litre d&#39;une solution définitive de vitamines (solution «I») est obtenu en ajoutant 10 ml des trois solutions initiales à l&#39;eau distillée. Un litre de l&#39;algue des médias est préparée par dissolution de 1 ml de la solution nutritive, 1 ml de la solution finale minérale (solution «E») et 1 ml de la solution finale en vitamine (solution «I») dans l&#39;eau de mer. Ce dernier peut être obtenue par dissolution reconnus réactifs de qualité analytique ou une formulation disponible dans le commerce dans l&#39;eau distillée ou désionisée. Mélanges de sel pour la création de l&#39;eau salée idéale sont disponibles dans le commerce, par exemple, les mélanges Instant Ocean. Il est recommanDed l&#39;aide d&#39;une eau de mer dont la salinité est de 30 (± 2) PSU et de la température de 20 (± 1) ° C.

long-term lethal toxicity test with the crustacean artemia franciscana

Nos activités de recherche cibler l&#39;utilisation de méthodes biologiques pour l&#39;évaluation de la qualité de l&#39;environnement, avec une référence particulière à l&#39;eau salée / eau saumâtre et les sédiments. Le choix des indicateurs biologiques doivent être fondées sur des connaissances scientifiques fiables et, éventuellement, de la disponibilité des procédures normalisées. Dans cet article, nous présentons un protocole standardisé qui a utilisé la crustacés marins Artemia pour évaluer la toxicité des produits chimiques et / ou de marins matrices environnementales. Des scientifiques proposent que la crevette de saumure (Artemia) est un candidat approprié pour le développement d&#39;un bio-essai standard pour l&#39;utilisation dans le monde entier. Un certain nombre de documents ont été publiés sur les effets toxiques des produits chimiques divers et des substances toxiques sur la crevette de saumure (Artemia). L&#39;avantage majeur de ce crustacé pour les études de toxicité est la disponibilité globale des kystes secs; ceux-ci peuvent être immédiatement utilisés dans les essais et la culture difficile n&#39;est pas exigé <sup&gt; 1,2. Essais de toxicité Cyst-base ne coûtent pas cher, disponible en permanence, simple et fiable et sont donc une réponse importante aux besoins de routine de dépistage de la toxicité, pour les besoins de surveillance industriels ou à des fins réglementaires 3. La méthode proposée consiste à la mortalité comme critère d&#39;évaluation. Les chiffres de survivants ont été comptés et le pourcentage de décès ont été calculés. Les larves ont été considérés comme morts si elles ne présentent pas de tout mouvement interne ou externe pendant plusieurs secondes d&#39;observation 4. Cette procédure était de tests normalisés d&#39;une substance de référence (dodécyl sulfate de sodium); certains résultats sont rapportés dans ce travail. Cet article accompagne une vidéo qui décrit les performances des tests de toxicité de la procédure, montrant toutes les étapes liées au protocole.

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Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Cette étude concerne le développement et la standardisation d&#39;un protocole méthodologique précieux pour déterminer à long terme (14 jours) toxicité létale exercée par des substances chimiques, les eaux usées industrielles ou des eaux usées et liquides des échantillons environnementaux sur le crustacé d&#39;eau salée,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

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Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

19.4K vues.  Institute for Environmental Protection and Research. Cette étude concerne le développement et la standardisation d'un protocole méthodologique précieux pour déterminer à long terme (14 jours) toxicité létale exercée par des substances chimiques, les eaux usées industrielles ou des eaux usées et liquides des échantillons environnementaux sur le crustacé d'eau salée, Artemia franciscana.

Vidéo: Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, une méthode pour monter la larve de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Application du mouvement passif de la tête pour générer des accélérations définies à la tête des rongeurs

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Collecte et entretien à long terme des fourmis coupeuses de feuilles (Atta) dans des conditions de laboratoire

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...