Les auteurs tiennent à remercier L. Belluscio de matériel de tournage chirurgie, D. Kwon pour le tournage d&#39;assistance, K. Liu pour le montage vidéo assistance, et K. MacLeod pour toute la musique de fond. KW reconnaît le soutien généreux de la Division des programmes de recherche NIMH intra-muros et les gènes, Cognition et Psychosis Program. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros NIMH (VC, YY, SMKW) et la Division NIAAA du programme de recherche intra-muros clinique et biologique (VC, RMC, DML).

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par l&#39;Institut national de la santé mentale et des animaux comité sur l&#39;utilisation et sont conformes aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation pré-opératoire <ol><li> Nettoyer tous les outils dans un stérilisateur à billes à chaud avant la chirurgie aseptique, nettoyer le site de la chirurgie avec de l&#39;éthanol à 70%, et posa toiles propres. Porter des gants stériles. Anesthésier l&#39;animal avec une solution fraîchement préparée avertin 1,2%, donnée à 0,02 ml / g, intrapéritonéale. En variante, l&#39;isoflurane avec du gaz anesthésier à travers un cône de nez, 5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance, avec un circuit accepteur passive. Vérifier le niveau d&#39;anesthésie utilisant pincées de queue ou de l&#39;orteil pour assurer une sédation complète. </li><li> Couvrir les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique stérile et injecter la dexaméthasone fraîchement préparée (0,2 mg / kg) et le carprofène (5 mg / kg) subcutaneously pour prévenir l&#39;enflure et l&#39;inflammation du cerveau 11. Se raser les cheveux sur le crâne entre les oreilles, et stériliser la peau avec gommage bétadine et trois tampons en alternance de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Montez l&#39;animal à un stade chirurgie stéréotaxique avec earbars, avec un coussin chauffant à circulation d&#39;eau ci-dessous l&#39;ensemble des animaux à 37 ° C. Vérifiez régulièrement les niveaux d&#39;anesthésie de l&#39;animal, et compléter la dose initiale anesthésie si nécessaire. </li><li> Injecter 200 pi de Marcaïne 0,5% sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la région. Inciser la peau et retirer le lambeau de peau sur le crâne. Retirez le périoste et sécher la zone avec des cotons-tiges propres. </li></ol> 2. Chronique chirurgie crânienne fenêtre <ol><li> Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec une fraise de 0,5 mm à décrire un cercle délicatement 3-5 mm de diamètre sur la région du cerveau d&#39;intérêt. Périodiquement, mouiller avec le site de forage stérile poussière d&#39;os saline à 0,9% et claire loin avec des cotons-tiges propres. Si les saignements osseux, utilisez gelfoam préalablement trempés avec une solution saline stérile pour effacer la purge et attendre que ça s&#39;arrête. </li><li> Lorsque la couche d&#39;os dernière est atteinte, soulever et retirer l&#39;île os avec pointe fine pince. Dura pièces jointes à l&#39;étagère inférieure de l&#39;os peut se produire si la fenêtre traverse une suture osseuse. Ceux-ci devraient être éliminées en douceur comme le volet osseux est levée. </li><li> Rouleau mousse de gel humide doucement sur ​​la dure-mère exposée à nettoyer sa surface et attendre que le saignement dure-mère d&#39;arrêter étape critique:. Ne commencera pas avant que tout saignement s&#39;est arrêté dural. Sang qui se retrouve piégé à l&#39;intérieur de la fenêtre crânienne conduit généralement à une fenêtre opaque. </li><li> Si la région d&#39;intérêt est sous un emplacement où la durée est particulièrement épais, enlever la dure-mère ci-dessus, il peut être nécessaire. Si c&#39;est le cas, séparez doucement la durée de la pie-dessous avec des pinces très fines, faire une petite incision dans la levée dure-mère avec une autre paire de pinces fines, puis saisissez les bords coupés et doucementdiviser la dure-mère. La dure-mère est mince mais solide, donc soyez prudent de ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère. </li><li> Rincer la zone avec ACSF stérile ou une solution saline stérile. </li><li> Posez une lamelle de verre stérile (3-5 mm) au cours de la dure-mère ou pia étape critique:. Si les courbes du crâne entourant de manière significative, utilisez Kwiksil colle 12 pour remplir des espaces où la mère ou pia serait pas en contact étroit avec la lamelle dans les régions qui ne sera pas mis en image. </li><li> Utiliser un gel cyanoacrylate à couvrir l&#39;adhésif élastomère et les bords de la lamelle couvre-objet en verre. Couvrir l&#39;ensemble du crâne exposé au gel cyanoacrylate, ou un mélange de ciment et de soins dentaires krazyglue étape critique:. Ne laissez pas n&#39;importe quel gel cyanoacrylate de toucher la surface du cerveau. </li><li> Intégrer un bar sur mesure en métal tête de fixation à l&#39;extrémité opposée du crâne. </li><li> Le réexpédier vers une chambre de récupération à chaud, après une injection intrapéritonéale de kétoprofène, 5 mg / kg, fogestion de la douleur r. Continuer l&#39;analgésique deux jours de plus après l&#39;opération. </li><li> Après deux semaines de récupération post-opératoire, anesthésie de l&#39;animal à l&#39;isoflurane (5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance), le monter dans une platine de microscope sur mesure avec un châssis de tête de fixation et vérifiez la fenêtre crânienne pour plus de clarté optique sous illumination avec une lumière bleue. Surface des vaisseaux sanguins du cerveau clarté est très révélateur de la qualité de fenêtre crânienne. Si les bords des vaisseaux sanguins sont nettement définies, la fenêtre est susceptible d&#39;être utilisables. Le temps de deux semaines de récupération post-opératoire est recommandé de laisser suffisamment de temps pour que l&#39;animal récupérer de la chirurgie. Fenêtres crâniens généralement nettoyer et améliorer pendant ce temps, et restent optiquement transparent pendant des semaines à des mois supplémentaires avant que le regain du crâne ou un épaississement de la dure-mère dégrade la qualité de la fenêtre. </li></ol> 3. Protocole de comportement et à balayage laser microscopie à deux photons <ol><li> Les animaux atteints clair cranial fenêtres seront exposés à un stimulus environnemental ou soumis à une session de formation comportementale, puis imagée après au moment du maximum Arc-GFP expression. Avant de commencer un protocole de comportement, l&#39;animal doit être gardé dans un environnement cage cohérente afin de minimiser au jour le jour la variation des niveaux de référence d&#39;expression Arc-GFP. </li><li> Commencer la formation comportementale ou paradigmes de stimulation de l&#39;environnement, en fonction de la région cérébrale d&#39;intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels sur des jours consécutifs, et imager chaque jour après la stimulation visuelle pour identifier les stimulus-réponse spécifique dans le cortex visuel 10. </li><li> Arc-fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximum deux heures après la stimulation. Le calendrier expérimental peut être optimisée afin de faciliter la détection d&#39;Arc-GFP expression dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence de pointe. </li><li> Après une session de formation comportementale ou environnementastimulation l est terminée, anesthésier l&#39;animal avec de l&#39;isoflurane (5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance) et monter l&#39;animal dans la platine du microscope sur mesure avec tête de fixation cadre, sous le microscope à deux photons. </li><li> Position de la tête de l&#39;animal est fixé sur le cadre de tête de fixation qui se connecte directement à l&#39;étape, à l&#39;aide de la barre métallique implanté sur la boîte crânienne. L&#39;isoflurane et l&#39;oxygène sont fournis en continu à la souris par un cône de nez. La température du corps est maintenue à l&#39;aide d&#39;un coussin chauffant. </li><li> Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante en effectuant balayage laser à deux photons dans une pièce sombre. Utilisez un objectif 20x ou 25x eau (1,05 ouverture numérique) d&#39;immersion pour l&#39;imagerie. Tout d&#39;abord, sous l&#39;épifluorescence illumination, acquérir une image de motifs de surface du vaisseau sanguin dans le cerveau de la région d&#39;intérêt avec une caméra CCD pour l&#39;alignement d&#39;image future. </li><li> Commencer à deux photons laser à balayage pour acquérir une pile d&#39;images 3-D. Un FV1000 OlympusMPE multi-photon microscope est utilisé dans notre configuration. La longueur d&#39;onde d&#39;excitation du laser à deux photons est réglé à 920 nm, et la puissance du laser émise à partir de l&#39;objectif est fixé à environ 50 mW. Fluorescence émise est simultanément détectée dans les canaux vert et rouge (miroir dichroïque à 570 nm, des filtres barrières à 495-540 nm et 570-625 nm), en utilisant un canal externe de deux systèmes de détection photomutiplier placé à proximité du spécimen. Arc-fluorescence de la GFP apparaît uniquement dans le canal vert, tandis que le tissu auto-fluorescence apparaît dans les deux canaux 13, 14. </li><li> Piles d&#39;images typiques ont des dimensions d&#39;environ 320x320x100 um (largeur x longueur x profondeur), une résolution horizontale de 0,5 um / pixel, et une résolution verticale de 3 um / pixel. </li><li> Après l&#39;acquisition de la pile d&#39;images, le retour de l&#39;animal à sa cage. Ne pas déranger l&#39;animal jusqu&#39;à la prochaine session de comportement et d&#39;imagerie. Répétez le comportement et la procédure d&#39;imagerie au fil des jours comme souhaitableed. Utilisez la surface préalablement acquis des vaisseaux sanguins du cerveau l&#39;image d&#39;orienter vers l&#39;emplacement d&#39;imagerie même. </li></ol>

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	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression.">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li><li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity.">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li><li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+growth+factor+and+activity-regulated+gene,+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites.">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li><li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity.">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li><li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+Arc,+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity.">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain.">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li><li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist:+a+review+journal+bringing+neurobiology.">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li><li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;imagerie in vivo méthode décrite ici permet l&#39;examen répété des changements d&#39;expression des gènes dans l&#39;arc les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours chez l&#39;animal vivant. Il s&#39;agit d&#39;une méthode efficace et polyvalent pour obtenir des informations sur la plasticité neuronales liées à la dynamique moléculaire dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales. Standard des méthodes histochimiques comme l&#39;hyb...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-photons microscope à balayage laser </td><td> Olympe </td><td> FV1000MPE </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Stade de la chirurgie stéréotaxique pour la souris </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> 20X 25X ou objectif immersion dans l&#39;eau </td><td> Olympe </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> La platine du microscope avec tête de fixation cadre </td><td> Sur mesure </td><td> N / A </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> Pinces fines </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Foret fraise dentaire </td><td> Outils Fine Science </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Imagerie </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

La capacité du cerveau de changer en réponse à l&#39;expérience est essentielle pour le fonctionnement sain du cerveau et des anomalies dans ce processus contribue à une variété de troubles neurologiques 1,2. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les circuits du cerveau réagissent à l&#39;expérience d&#39;un animal nécessite la capacité de surveiller les changements vécus par dépendantes moléculaires dans un ensemble donné de neurones, sur une période de temps prolongée, chez l&#39;animal vivant. Bien que l&#39;expérience et l&#39;activité neuronale associée est connu pour déclencher des changements d&#39;expression des gènes dans les neurones 1,2, la plupart des méthodes pour détecter ces changements ne permettent pas l&#39;observation répétée des mêmes neurones sur plusieurs jours ou qui n&#39;ont pas une résolution suffisante pour observer les neurones individuels 3 , 4. Nous décrivons ici une méthode qui combine in vivo microscopie à deux photons avec un journaliste codées génétiquement fluorescent pour suivre l&#39;expérience dépendant de changements d&#39;expression génétique dans les différents neurones corticaux au cours de la<html> cours de la journée-à-jour l&#39;expérience. L&#39;une des expériences bien établies qui dépendent gènes est régulée l&#39;activité protéine du cytosquelette associée (Arc) 5,6. La transcription d&#39;Arc est rapidement et fortement induite par l&#39;intensification de l&#39;activité neuronale 3, et son produit protéique régule l&#39;endocytose des récepteurs au glutamate et à long terme de plasticité synaptique 7. L&#39;expression d&#39;Arc a été largement utilisé comme un marqueur moléculaire pour cartographier les circuits neuronaux impliqués dans les comportements spécifiques 3. Dans la plupart de ces études, l&#39;expression Arc a été détecté par hybridation in situ ou immunohistochimie dans des coupes de cerveau fixes. Bien que ces méthodes ont révélé que l&#39;expression d&#39;Arc a été localisé à un sous-ensemble de neurones excitateurs après l&#39;expérience du comportement, la façon dont les modèles cellulaires d&#39;expression Arc pourrait changer avec de multiples épisodes d&#39;expériences répétées sur plusieurs jours ou distinctif n&#39;a pas été étudiée. ntent &quot;&gt; In vivo microscopie à deux photons offre un moyen puissant d&#39;examiner l&#39;expérience qui dépendent des changements cellulaires dans le cerveau 8,9 vivre. Afin de permettre l&#39;examen de l&#39;expression Arc de neurones vivants par microscopie à deux photons, nous avons déjà généré un knock- en ligne de la souris dans lequel un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur endogène d&#39;arc 10. Ce protocole décrit la préparation et procédures chirurgicales pour le suivi de l&#39;expérience d&#39;imagerie dépendant de profils d&#39;expression Arc-GFP dans des ensembles de neurones chez l&#39;animal vivant. Dans ce procédé , chroniques fenêtres crâniennes ont d&#39;abord été implanté à Arc-GFP souris sur les régions corticales d&#39;intérêt. Ces animaux ont ensuite été reprises imagée par microscopie à deux photons après souhaités paradigmes comportementaux au cours de plusieurs jours. Cette méthode peut être applicable aux animaux porteurs d&#39;autres reporters fluorescents d&#39;expérience dépendant de changements moléculaires 4.

<html> Ce protocole décrit une méthode pour suivre l&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les différents neurones corticaux dans les animaux vivants. Une fenêtre crânienne chronique est d&#39;abord créé sur une région corticale d&#39;intérêt dans une souris portant un rapporteur fluorescent de l&#39;expression génique. Microscopie à deux photons peut ensuite être couplé avec divers paradigmes comportementaux pour observer comportemental induit des changements moléculaires dans ...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s&#39;adapter en réponse à des problèmes de comportement. Un<em&gt; In vivo</emMéthode d&#39;imagerie&gt; à deux photons est décrit ici, qui permet le suivi de ces changements moléculaires dans les différents neurones corticaux par les journalistes génétiquement codés.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K vues.  National Institute of Mental Health. Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s'adapter en réponse à des problèmes de comportement. Un In vivo

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo</emImagerie> de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...