La recherche publiée dans la présente publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous R01CA174385 Nombre Award. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l&#39;HEPES et de la solution. </li><li> Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l&#39;addition. </li><li> Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles. </li><li> Fabrication des tableaux de nanowells dans PDMS: Le maître de silicium est fabriqué en utilisant la photolithographie essentiellement comme décrit précédemment 10. Bien mélanger le Sylgard 184 kit de base élastomère et le durcisseur 10:1 poids dans un gobelet jetable en utilisant un couteau en plastique. Dégazer le mélange dans une chambre à vide pendant 1 heure. Verser le mélange sur le tableau nanowell, sceller avec une lame de verre et laissez-le reposer pendant 30 min. Transfert de l&#39;ensemble dans un four réglé à 80 ° C pendant 2 heures et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. L&#39;élastomère sera actue au cours de cette période et la volonté de se lier à la lame de verre. La lame de verre contenant le réseau PDMS nanowell est soigneusement décollé le maître silicium, recouvert avec du scotch et stocké jusqu&#39;à son utilisation future. </li></ol> 2. Cellule cible (T) Marquage <ol><li> Compter 5 millions de cellules de culture de cellules cibles à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et sédimenter les cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. La culture de cellules est divisé le jour précédent dans 5 ml de volume total (densité = 1 millions / ml) et cultivées en flacon T-25 (VWR). Protocoles pour le comptage des cellules à l&#39;aide hémocytomètre ont été décrits en détail antérieurement 11 </li><li> Aspirer les supports en excès, laissant derrière d&#39;environ 50 pi de médias. </li><li> Préparer une solution de travail de la cellule Tracker Rouge (CTR) en mélangeant 0,5 ul de stock CTR (1 mM) à 150 ul de RPMI-PLGH (concentration finale 2,5 uM). Ajouter 150 ul de la solution de travail aux cellules cibles et bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une pipette P200.Alternativement, PKH 26 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min. </li></ol> 3. Marquage cellulaire effectrice (E) <ol><li> Compter 5 millions de cellules effectrices de culture de cellules à l&#39;aide d&#39;un hématimètre et le culot des cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer les supports en excès </li><li> Préparer une solution de travail de Vybrant solution Stain DyeCycleViolet en ajoutant 1 pl de 5 stock Violet mM Vybrant à 1 ml de R10 médias (concentration finale de 5 uM). Ajouter la solution de travail à l&#39;aide de cellules et remettre en suspension P200 pipette. Alternativement, PKH 67 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. Si PKH 67 est utilisé, alors SYTOX vert ne doit pas être utilisés car ils sont dans le même canal de fluorescence. L&#39;énumération des objectifs de apoptotiques se fait exclusivement en utilisant uncoloration nnexinV dans ce cas. Remarque: Si vous effectuez time-lapse et les mesures de point final non, colorants UV comme Violet Vybrant doit être évitée. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min. </li></ol> 4. Séparation des cellules vivantes et mortes par gradient de densité <ol><li> Ajouter 6,8 ml et 6,0 ml de RPMI-PLGH à la cible et les cellules effectrices, respectivement, et mélanger par pipetage de haut en bas doucement. </li><li> Couche de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus à fond de chaque tube conique contenant la cible et les cellules effectrices. La couche FICOLL lentement pour assurer une bonne formation de couches entre FICOLL et des médias. </li><li> Centrifuger les deux tubes à 340 xg pendant 30 min. sans frein et d&#39;accélération. </li><li> Lors de la centrifugation, transférer 7 ml de PBS préchauffé à une plaque 4-bien. Préparer ensemble nanowell (fabriqué en PDMS): pour nettoyer le fond de la lame de verre avec de l&#39;éthanol et de l&#39;oxydation du PDMS au réglage élevé RF à l&#39;aide d&#39;oxydation plasma pendant 1 min. Cette étape va sterilize la matrice, tout en rendant nanowell le PDMS hydrophile. Immédiatement déplacer la baie nanowell dans la plaque contenant du PBS. </li><li> Placer la plaque d&#39;une enceinte de biosécurité et aspirer excès de PBS. Faire 10 ml 1% de gélose noble par addition de 100 mg de poudre d&#39;agar 10 ml d&#39;eau déminéralisée, puis au micro-ondes pendant 30-45 sec. Appliquer réchauffer 1% d&#39;agar noble sur le bord supérieur et inférieur de lame de verre qui contient le tableau nanowell pour immobiliser le réseau et attendre 10 minutes pour solidifier la gélose à. Ajouter 3 ml de PBS et aspirée agar excès. </li><li> Ajouter 3 ml de R10 sur le haut de gamme nanowell et le laisser s&#39;équilibrer pendant environ 10 min. </li><li> Après la centrifugation sur Ficoll, aspirer 5 ml de milieu de la couche supérieure de chaque tube. Attention de ne pas aspirer la couche contenant les cellules. </li><li> Récolter les cellules (couche blanche) en récupérant 1-2 ml de la couche entre FICOLL et les médias avec P1, 000 pipette et passage à de nouveaux tubes coniques stériles. Répétez cette opération pour les deux ensembles de cellules tout en veillant à ce que vous maximeiser les cellules de récupération. </li><li> Ajouter 3 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH dans chaque tube, mélanger par pipetage et par centrifugation à 340 g pendant 5 min à pleine accélération et de freinage. </li><li> Aspirer les supports en excès, ajouter 5 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH à chaque tube et répétez centrifugation à 340 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les supports en excès et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pl de R10. </li><li> Compter les cellules vivantes en utilisant la méthode d&#39;exclusion du bleu trypan sur un hématimètre. </li></ol> 5. Chargement en cours cellule sur tableau Nanowell <ol><li> Aspirer les supports en excès gamme nanowell et ajouter 2 ml de R10 frais à travers le réseau. Aspirer à nouveau tout en s&#39;assurant que le haut de gamme nanowell n&#39;est pas trop humide / sec car il aura une incidence sur la distribution des cellules. </li><li> Des dépôts 1 x 10 5 cellules effectrices dans 200 pl de R10 sur une surface large nanowell (densité = 5 x 10 5 cellules / ml). </li><li> Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour ens&#39;assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire. </li><li> Dépôt de garantie 1 x 10 5 cellules cibles dans 200 ul R10 sur nanowell surface de réseau (densité = 5 x 10 5 cellules / ml). </li><li> Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour s&#39;assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire. </li><li> Rincer soigneusement à l&#39;ensemble nanowell 2 ml R10 et aspirer les supports en excès. </li><li> Préparer 3 ml préchauffé R10 dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 3 pi de 0,5 mM SYTOX vert Nucleic Acid Stain (concentration finale de 0,5 uM) et 60 pl de l&#39;annexine V-Alexa Fluor 647 pour préparer la solution de travail. Ajouter la solution de travail sur la plaque 4-bien attentivement tout en s&#39;assurant que les cellules ne sont pas déplacés dans les puits. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 15 min. </li></ol> 6. Image 1 <ol><li> Acquérir des images de la matrice en utilisant une encre magnétique nanowell fluorescenceoscope: Dans cet exemple, nous utilisons un observateur ZEISS Z-1 microscope équipé d&#39;une platine motorisée et Lambda-DG4. </li><li> Initialiser le logiciel et le microscope et vérifier l&#39;intensité du signal de la lumière transmise et les autres canaux fluorescents. Dans l&#39;ensemble, il y aura cinq canaux correspondant à: la lumière transmise, l&#39;annexine V-647 (Cy5 filtre), CTR (DsRed filtre), SYTOX vert (filtre FITC), et Vybrant Violet (DAPI filtre). Assurez-vous que le microscope il configuré pour assurer un signal au bruit maximal tout en évitant la saturation. </li><li> Réglez la position X et Y de la matrice nanowell. Début du processus de réglage de la position zéro et initialiser l&#39;accent sur le centre de 7 x 7 Bloc de réseau nanowell sur le coin supérieur gauche de la matrice nanowell timbre. Réglez les positions X, Y pour les faire coïncider avec le centre de chaque bloc et la valeur z pour refléter fidèlement l&#39;accent sur chaque bloc. </li><li> Une fois la position et l&#39;orientation constituent tous ensemble, assurez-vous de régler l&#39;acquisition d&#39;images en mode linéaire et acquérir des images. <strong&gt; Remarque: Si nécessaire, à son tour sur l&#39;incubateur et du CO 2 sur le microscope au moins 30 min avant l&#39;expérience. </li></ol> 7. Post-imagerie Placer la plaque 4-puits contenant le tableau nanowell dans un incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant 6 heures. 8. Imagerie 2 Acquérir les images à la seconde fois, le point comme il est indiqué à l&#39;étape 6. 9. Analyse d&#39;images <ol><li> L&#39;occupation des cellules dans la nanowells est déterminée par l&#39;utilisation de programmes appropriés de segmentation d&#39;image (par exemple ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ), essentiellement comme décrit précédemment 9,12. </li><li> Analyse de la première série d&#39;images de microscope (t = 0 h, t 0) est utilisée pour générer une base de données des nanowells individuels contenant exactement une cellule cible en temps réel (identifiéspar CellTracker rouge, rouge) et pas de cellules mortes (identifié par l&#39;annexine V coloration, vert) [T1T 0 nanowells]. </li><li> Analyse du second ensemble d&#39;images de microscope (t = 6 h, t 6) est utilisé pour déterminer de manière indépendante une seconde base de données contenant des nanowells 1 cellule cible (rouge) [6 T1T nanowells]. Un contrôle d&#39;intégrité (requête de base de données) est mis en œuvre pour s&#39;assurer que toutes les cibles vivantes à t 0 sont adaptés aux objectifs à t 6 pour produire un ensemble final de cibles appariées (mis en œuvre nanowells qui ont T1T 0 = T1T 6, désigné comme T1match) </li><li> Le nombre de cellules effectrices dans nanowells est déterminée en utilisant une coloration violette Vybrant à l&#39;instant t 0 [nanowells E1] </li><li> Une requête de base de données est mis en œuvre pour identifier nanowells contenant effecteurs simples co-incubées avec des objectifs simples (définie comme nanowells qui ont du match E1 et T1, désignés comme E1T1) </li><li> Effecteur l&#39;apoptose induite est marqué par i<html> DENTIFIER cibles qui sont annexine V négatif à l&#39;instant t 0 et l&#39;annexine V positif à l&#39;instant t 4 (E1T1 avec coloration annexine V cible à l&#39;instant t 6). </li></ol> 10. En option imagerie time-lapse de l&#39;abattage Utilisation de Nikon BioStation IM <ol><li> Prenez une boîte de Pétri à fond la lamelle et couper un petit morceau de la puce de réseau nanowell (préparé à l&#39;étape 5) qui s&#39;adaptent exactement sur la lamelle. Assurez-vous que la puce reste humide pendant la coupe. </li><li> Mélanger 1 x 10 6 cibles et 1 x 10 6 cellules T dans 100 ul de médias, et il pipette sur la lamelle. </li><li> Prévoyez environ 15-30 minutes pour laisser les cellules se déposent. </li><li> Rapidement inverser la puce petit tableau nanowell et le placer sur la lamelle. </li><li> Afin de s&#39;assurer que la puce ne sera pas capable de se déplacer pendant l&#39;imagerie, le lieu d&#39;une ou deux lamelles 20mm x 20mm sur la partie supérieure de la puce. Appliquer une pression pour pousser doucement la puce au fond de la cuvette. </li></ol>tente &quot;&gt; Remarque: Le fond de la puce de réseau nanowell est trop épais pour l&#39;imagerie haute résolution et doit donc être renversé Pendant ce temps, la plupart des cellules sont lavées Puisque cela peut ne pas être facilement contrôlées, le nombre de cellules à l&#39;étape 9.2.. et le temps d&#39;incubation de l&#39;étape 9.3 doivent être optimisés.

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	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d&#39;essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d&#39;un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l&#39;ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l&#39;utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 15 à 040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10.000 UI de pénicilline 10000 ug / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 005-CI </td><td> Solution 200 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot testé </td></tr><tr><td> Cellule Tracker tache rouge </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Acide nucléique SYTOX tache verte </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexine V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Bleu trypan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% de liquide, on filtre stérile </td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Ligne claire </td></tr><tr><td> 4-plaque à puits </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Basic nettoyeur à plasma </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Microscope à fluorescence (fonctionne avec les trois parties ci-dessous) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> Contrôleur de filtre </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​longueur d&#39;onde de commutation </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD de la caméra </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> Microscope caméra CCD </td></tr><tr><td> 15 ml tube conique </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tube conique </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Europe BV </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture à fond de verre </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm boîte de Petri de 10 mm micropuits </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

L&#39;immunothérapie du cancer permet d&#39;exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d&#39;antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques 1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR + lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l&#39;hôte, et enfin à induire l&#39;apoptose de CAR + Les cellules T dans le cas de 5 toxicité hôte. La délimitation des fonctions optimales de CAR + lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l&#39;imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l&#39;étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo 6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d&#39;une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles 8. Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l&#39;espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes 9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d&#39;effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d&#39;imagerie d&#39;un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d&#39;une seule cellule qui peut être largement appliquée à l&#39;étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Un exemple de l&#39;application de l&#39;analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR + cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d&#39;un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l&#39;occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6)...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu&#39;ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l&#39;espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l&#39;apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

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14.9K vues.  University of Houston. Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose ...

Vidéo: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...