La thérapie cellulaire CAR-T a connu un succès sans précédent dans le traitement de certains cancers pathologiques. Dans cette étude, nous avons introduit une approche non virale à intégration longue pour générer des cellules CAR-T transitoires et fourni des procédures ciblées pour évaluer la fonction des cellules CAR-T. Notre recherche vise à générer des cellules CAR-T sûres et efficaces dans le cadre d’une approche plus rentable.
Les cellules CAR-T sont généralement générées par transduction virale. Les rétrovirus et les antivirus sont les vecteurs viraux les plus courants pour l’administration du gène CAR. La fabrication de vecteurs viraux est complexe et coûteuse, et la transduction virale induit l’intégration aléatoire et permanente de l’ADN codant pour les CAR dans le génome des lymphocytes T, ce qui peut poser des problèmes de sécurité.
Notre protocole propose une approche non virale pour générer des cellules CAR-T qui n’expriment que transitivement les CAR. Cette méthode utilise l’ARNm pour l’expression des CAR et utilise l’électroporation pour délivrer l’ARNm dans les lymphocytes T. Il n’y a pas d’intégration génétique dans le génome des lymphocytes T, et les procédures de fabrication sont plus simples et plus rentables.
Pour commencer, linéarisez l’ADN plasmidique CAR avec l’enzyme de restriction BGL2 et effectuez la procédure d’extraction de l’ADN phénol chloroforme isoamylique. Après avoir purifié l’ADN linéarisé, vérifiez la taille et l’intégrité de la matrice par électrophorèse sur gel d’agarose. Pour la transcription in vitro, mélangez les composants de la réaction et incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures.
Après la transcription, ajoutez deux microlitres de ribonucléase III, DNase I à la réaction. Mélangez doucement et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius pour dégrader l’ADN matrice. Purifiez l’ARNm CAR transcrit avec un kit de nettoyage de l’ARN et diluez-le dans de l’eau sans nucléases.
Mesurez la concentration d’ARNm à l’aide d’un spectrophotomètre avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius. Décongeler l’échantillon d’ARNm de voiture transcrit et purifié in vitro sur de la glace. Suspendre une fois 10 à la puissance de six cellules mononucléées de sang périphérique humain cryopréservées dans un millilitre de milieu CAR T.
Pour activer les lymphocytes T, ajoutez un nombre égal de billes CD3/CD28 d’activateur T humain prélavées. Cultivez et élargissez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant plusieurs jours. Ajouter un millilitre de milieu CAR T par puits à deux puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pour l’équilibre.
Maintenant, transférez cinq fois 10 à la puissance six cellules T dans un tube stérile. Pour retirer les billes de CD3/CD28, placez le tube sur un support magnétique et pipetez soigneusement la suspension cellulaire dans un nouveau tube. Centrifugez le tube à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS stérile. Centrifugez à nouveau le tube et mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de tampon Neon T.Mélangez cinq microgrammes de CAR MNA dilués dans le tampon Neon T et 100 microlitres de cellules dans un volume total de 125 microlitres. Ajoutez 25 microlitres de tampon Neon T aux 100 microlitres de cellules restants, qui sert de contrôle négatif.
Réglez le système d’électroporation Neon sur 1 800 volts, 10 millisecondes et une seule impulsion. À l’aide de la pipette Neon, aspirez le mélange d’ARNm CAR des lymphocytes T dans un embout Neon de 100 microlitres et électroporatez les cellules. Transférez immédiatement les cellules électroporées dans le milieu de culture équilibré dans la plaque à 12 puits et renvoyez la plaque dans l’incubateur pour dilater les cellules jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
Récupérer les lymphocytes T transfectés avec l’ARNm CAR pour une analyse cytométrique en flux dès six heures après l’électroporation. Mélangez les cellules CAR-T plusieurs fois à l’aide d’une pipette et transférez-les au moins une fois 10 à la puissance cinq cellules dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres, ou FACS. Ajoutez trois millilitres de tampon de lavage à froid dans le tube et centrifugez le tube à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de tampon de lavage. Ajoutez deux microlitres d’anticorps de détection marqué par fluorescence et sept colorants de viabilité AAD aux cellules en suspension. Mélangez l’échantillon et incubez-le sur de la glace pendant 30 minutes, en évitant l’exposition à la lumière, puis lavez les cellules avec trois millilitres de tampon de lavage à froid et centrifugez à nouveau le tube à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage et analysez immédiatement les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux. Retirez le milieu des cellules tumorales exprimant l’antigène CAR à la surface de la cellule. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, incubez-les avec un millilitre de solution EDTA de trypsine à 0,05 % pendant une minute à 37 degrés Celsius, puis préparez une suspension unicellulaire dans le milieu de culture approprié à une densité de un à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de milieu de culture de cellules tumorales préchauffé à la plaque E et placez-le dans une analyse cellulaire en temps réel, ou un instrument RTCA, pour mesurer l’impédance de fond, puis ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules tumorales dans chaque puits et équilibrez la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Replacez la plaque E dans l’instrument RTCA et surveillez l’indice cellulaire pendant 24 heures, avec des mesures prises toutes les cinq à 15 minutes. Le lendemain, préparez la suspension de cellules CAR-T.
Mettez en pause l’enregistrement de l’index des cellules et retirez la plaque E de l’instrument RTCA. Inclinez légèrement la plaque et retirez soigneusement 50 microlitres de milieu de culture de chaque puits sans perturber les cellules tumorales, puis ajoutez 100 microlitres de cellules CAR T ou de cellules T de contrôle dans chaque puits. Remettez la plaque E dans l’instrument RTCA et reprenez la surveillance de l’indice cellulaire pendant au moins 24 heures, avec des balayages effectués toutes les cinq à 15 minutes.
Arrêtez la surveillance de l’indice cellulaire et analysez le résultat de la cytotoxicité. Pour l’analyse de la sécrétion de cytokines, transférez le surnageant de chaque puits dans un fond rond ou une plaque en forme de V à 96 puits. Centrifugez la plaque à 96 puits à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante et transférez soigneusement les surnageants dans une nouvelle plaque à 96 puits.
Enfin, mesurez les niveaux de cytokines dans les surnageants à l’aide de kits ELISA commerciaux. La séquence d’ARNm CAR a été validée comme étant d’environ deux kilobases par électrophorèse sur gel. Plus de 50 % des lymphocytes T activés exprimaient le CAR le premier jour après l’électroporation, augmentant à plus de 70 % le deuxième jour avant de diminuer à environ 10 % le cinquième jour.
Les cellules CAR-T ont montré une cytotoxicité significative contre les cellules tumorales SK-OV-3 HER2 positives, indiquée par une forte réduction de l’impédance tumorale, tandis que les cellules T témoins ont montré un effet minimal. Des niveaux élevés de sécrétion d’interféron gamma ont été détectés dans le milieu de culture de cellules CAR-T, mais pas dans le groupe témoin.
