Ce projet a été financé par le NIH (R21EB013717) et IUPUI TRCVPB (RSFG). L&#39;auteur remercie Mme Han Shih pour son assistance technique.

A. Macromère et Peptide Synthesis <ol><li> Synthétiser 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) et arylphosphanate Lithium photoinitiateur (LAP) en utilisant des protocoles établis. 18,19 </li><li> Synthétiser les bis-cystéine contenant chymotrypsine sensible peptide C CGGY ↓ (flèche indique le site clivage par la chymotrypsine) en utilisant la norme de synthèse peptidique en phase solide dans un synthétiseur de peptides à micro-ondes (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Calculer la quantité de résine (Rink-amide résine MBHA) nécessaire en fonction du taux de substitution de la résine et de l&#39;échelle de synthèse. Gonfler la résine dans le diméthylformamide (DMF) dans un récipient de réaction (RV) pendant 15 min. </li><li> Enlever groupe protecteur Fmoc de la résine à l&#39;aide d&#39;une solution de déprotection contenant 20% de pipéridine et 0,1 M dans le DMF HOBt. Utilisez les paramètres répertoriés dans le tableau ci-dessous pour micro-ondes assistée par déprotection Fmoc-(pour tous les acides aminés Fmoc-): <table border="1"><tbody><tr><td> Échelle de synthèse </strong&gt; </td><td> 0,1 mmole </td><td> 0,2 mmole </td></tr><tr><td> Puissance </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Température </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Temps </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Après déprotection, laver la résine avec du DMF et effectuer un test à la ninhydrine pour confirmer la suppression de Fmoc (exposition d&#39;amine N-terminal). Résine doit virer au bleu au bout de 2 min à 95 ° C. </li><li> Après déprotection, le premier couple de succès Fmoc-aminoacide à l&#39;extrémité C-terminale (C va de synthèse à extrémité N-terminale) dans une solution de base activateur (0,28 M diisopropyléthylamine (DIEA) dans du DMF) avec les paramètres indiqués dans le tableau ci-dessous . <table border="1"><tbody><tr><td> Échelle de synthèse </td><td> 0,1 mmole </td><td> 0,2 mmole </td&gt; </tr><tr><td> Puissance </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> * Température </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> * Temps </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Pour les kystes et Son, utilisez 50 ° C et 10 min pour réduire la racémisation. </li><li> Rincer la résine et effectuer un test à la ninhydrine qualitativement confirmer la fin de l&#39;accouplement (disparition de amine N-terminal). Résine doit être clair au bout de 5 min à 95 ° C. Répétez l&#39;étape d&#39;accouplement (A.2.d) si le test à la ninhydrine renvoie un résultat positif (couleur bleue). </li><li> Déprotection de répétition (étape A.2.b) et le couplage (étape A.2.d) pour d&#39;autres acides aminés dans la séquence se terminant par une étape de déprotection finale. </li><li> Égoutter le RV, rincer la résine avec 25 ml de dichlorométhane (DCM). Cette étape a pour rincer le DMF, qui est une base et empêchera clivage du peptide. </li><li> Préparer cocktail de clivage en mélangeant 250 mphénol dans 4,75 ml d&#39;acide trifluoroacétique (TFA), 0,125 ml triisopropylsilane (TIS) et 0,125 ml ddH 2 O. g </li><li> Ajouter la solution de clivage dans le RV et s&#39;attachera pendant 30 min dans le synthétiseur de peptides à micro-ondes (puissance = 20 W; Température = 38 ° C). </li><li> Recueillir la solution de peptide dans un tube à centrifuger de 50 ml à l&#39;aide distributeur de vide. </li><li> Peptide précipité clivée dans 40 ml d&#39;éther, vortex le tube et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 5 minutes pour recueillir le peptide. </li><li> Vider le surnageant et répéter A.2.k étape deux fois. </li><li> Recueillir et sécher peptide dans le vide. </li><li> Purifier le peptide par HPLC et le caractériser par spectrométrie de masse. </li></ol></li></ol> Préparation et stérilisation Matériel B. <ol><li> Préparer une solution à 20% en poids dans du PBS PEG4NB, vortex le mélange jusqu&#39;à ce que le macromère se dissout complètement, et la stérilisation de la solution de macromère à l&#39;aide d&#39;un filtre seringue. Conserver la solution stérilisée à -20 ° C (préparer des aliquotespour stockage à long terme). </li><li> Préparer et stériliser 2% en poids de photo-initiateur (LAP) en solution dans du PBS. Conserver la solution stérilisée à la température ambiante abri de la lumière. </li><li> Dissoudre le peptide (CGGYC) dans du PBS, vortex le mélange et la seringue, filtrer la solution pour la stérilisation. Aliquote de la solution de peptide et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation (éviter les cycles gel-dégel). </li><li> Déterminer thiol (-SH) de concentration dans la solution de peptide préparé en utilisant le réactif d&#39;Ellman (suivre le protocole du fabricant). Cette étape donne une concentration peptidique exacte (c&#39;est-[SH] / 2) qui est nécessaire pour le calcul de la quantité de peptide à utiliser dans thiol-ène-clic réactions photo. </li><li> Préparer les moules de gélification en coupant la partie supérieure hors de seringues de 1 ml stériles jetables en utilisant une lame de rasoir (bout ouvert pour le retrait gel). Stériliser les seringues moules par autoclave. </li><li> Sur la base de la formulation de gel désirée (thiol ratio ène = 1) et les concentrations de compagnon de stockriaux, calculer le volume nécessaire de polymère, un agent de réticulation peptide, photo-initiateur, et des solutions tampons nécessaires. </li></ol> Préparation des cellules C. <ol><li> Equilibrer milieu de culture cellulaire (taux élevé de glucose DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal; antibiotique-antimycotique avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 250 ng / ml Fungizone, et 50 uM β-mercaptoéthanol), solution saline équilibrée de Hank ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + libre) et de trypsine-EDTA à 37 ° C. </li><li> Retirer flacons contenant min6 β-cellules de CO 2 incubateur et placer les fioles dans la hotte à flux laminaire. </li><li> Aspirer milieux de culture cellulaire à partir des flacons et rincer la cellule avec du HBSS. </li><li> Trypsiniser les cellules en utilisant 3 ml de 2X (0,1%) de trypsine-EDTA et incuber les flacons de 4 min à 37 ° C et 5% de CO 2. <ul><li> Remarque: Utilisez une solution de trypsine 2X permet la dissociation complète des min6 β-cellules en suspension cellulaire unique. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Après incubation, appuyez sur les flacons sont placés sur la surface du capot doucement pour détacher complètement les cellules. Confirmer le détachement et la dissociation des cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope. </li><li> Ajouter un volume égal de milieu de culture cellulaire pour neutraliser la trypsine. Mélanger la solution ainsi par pipetage doux, puis transférer le mélange dans un tube canonique et centrifugation pendant 5 min à 1.000 rpm. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules de 4 à 5 ml de milieu de culture. </li><li> Déterminer la densité cellulaire en utilisant 50% de bleu trypan tampon dans un hémocytomètre. </li></ol> Fabrication d&#39;hydrogel et D. Encapsulation Cellulaire <ol><li> Une fois que les cellules sont prêtes, mélanger (basé sur un thiol 1:1 à taux ène) les volumes nécessaires de PEG4NB, CGGYC, LAP, la solution de la cellule, et HBSS dans un tube à centrifuger. </li><li> Mélanger doucement la solution à l&#39;aide d&#39;une pipette pour obtenir un mélange homogène et ajouter 25 ul de la solution obtenue dans un moule seringue. Exposer la seringue à la lumière UV (365nm, 5 mW / cm 2) pendant 2 min. </li><li> Photopolymérisation suivant, gels plonger dans une solution stérile de 24 puits plaque de milieu de culture cellulaire contenant et laisser incuber les hydrogels à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les hydrogels cellules chargées dans un milieu de culture cellulaire pendant 30 min à rincer les cellules faiblement attachées et non-réticulés macromères. Transférez les gels dans un milieu frais. </li><li> Actualiser les médias de culture cellulaire tous les 2 à 3 jours. </li></ol> Essai E. Viabilité cellulaire La morphologie des cellules encapsulées peuvent être observés à l&#39;aide microscope optique (depuis les hydrogels synthétisés sont transparentes). La viabilité des cellules peut être visualisée et mesurée qualitativement en utilisant Live / Dead coloration et quantitativement en utilisant le réactif alamarBlue. E.1. Live / Dead coloration <ol><li> Décongeler réactifs de coloration Live / Dead à la température ambiante. </li><li> Dans un tube canonique ajouter PBS en fonction du nombre d&#39;échantillons (n) à teindre: <strong&gt; volume total de PBS = n × 500 pi </li><li> Pipeter 0,25 ul de calcéine AM et 2 pi de EthD-1 par 1 ml de PBS au tube canonique contenant du PBS. Vortex de la solution pour mélanger les composants. </li><li> Incuber les cellules chargées des hydrogels dans une solution de coloration Live / Dead (0,5 ml / échantillon) pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur, enlever la solution de colorant et rincer l&#39;échantillon deux fois avec du PBS. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur une lamelle ou lame de verre. Observer et cellules d&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. </li></ol> E.2. AlamarBlue Assay <ol><li> Préparer 10 v / v% alamarBlue solution dans un milieu de culture cellulaire. </li><li> Supprimer les hydrogels de l&#39;incubateur et aspirer le support sur chaque puits sans aucun contact avec l&#39;hydrogel. </li><li> Incuber les cellules chargées des hydrogels et un vide (témoin négatif) puits dans 500 ul d&#39;une solution alamarBlue 10% pendant 16 heures. </li><li> Après l&#39;incubation, pipette 200 ulde la solution alamarBlue dans une plaque de 96 puits et la fluorescence mesure en utilisant un lecteur de microplaques (excitation: 560 nm, émission: 590 nm). <ul><li> L&#39;activité métabolique cellulaire plus élevé réduit le colorant de donner plus de lecture de fluorescence. </li><li> Assurez-vous d&#39;inclure au moins deux puits de solution alamarBlue 10% de blancs. En analysant les données, il faut soustraire la valeur à blanc de fluorescence moyenne de la lecture de la fluorescence des échantillons. </li></ul></li></ol> F. chymotrypsine Médiation érosion du gel et de récupération Sphéroïde <ol><li> Préparez 1 mg / ml de trypsine sans α-chymotrypsine solution dans HBBS et filtre stérile la solution. </li><li> Incuber hydrogels en solution chymotrypsine (500 ul pour chaque gel) à température ambiante sous agitation lente jusqu&#39;à ce que l&#39;érosion gel complet est réalisé. <ul><li> Pour un gel 25 pi, le temps d&#39;érosion complète est d&#39;environ 5 min. </li></ul></li><li> Placer la plaque sur la glace pendant quelques minutes pour réduire l&#39;activité dechymotrypsine. </li><li> Transférer la solution de cellules dans 1 ml tube et centrifuger à 300 rpm, 4 ° C pendant 2 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette pâturages et doucement remettre en suspension les sphéroïdes dans du HBSS. </li><li> Transférer la solution récupérée sphéroïde à une plaque de 24 puits et placer la plaque sur la glace pour permettre aux sphéroïdes de s&#39;installer. </li><li> Pour l&#39;analyse de la taille, d&#39;acquérir des images à contraste de phase des sphéroïdes installés à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Mesure récupéré diamètres sphéroïdes aide de logiciels comme élément du logiciel Nikon ou ImageJ. </li></ol> G. Essai fonctionnel des sphéroïdes récupérés G.1. Sécrétion d&#39;insuline stimulée par le glucose dans les cellules sphéroïdes récupérés <ol><li> Dans une plaque 24 puits, incuber les gels dans 500 ul de 2 mM de glucose bas Bordures tampon Ringer (KRB) pendant 1 heure. </li><li> Erode le gel et récupérer sphéroïdes de cellules en utilisant les étapes F.1 à F.6. </li><li> Aspirer le surnageant attentivement sans faire aucuncontact avec les sphéroïdes de cellules et remettre en suspension les sphéroïdes dans 500 ul de 2 mM de glucose KRB bas. </li><li> Transférer 100 ul de cellules sphéroïdes solution dans un tube de 0,6 ml et le placer sur la glace pour l&#39;ATP intracellulaire quantification. </li><li> Diviser la solution restante de la pile sphéroïde en deux (dans deux tubes à centrifuger) et centrifuger pendant 2 min à 300 rpm et 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant (presque jusqu&#39;au fond) et remettre en suspension la première moitié de sphéroïdes de cellules dans 1 ml de 25 mM de glucose à haute KRB et la seconde moitié dans 1 ml de 2 mM de glucose KRB bas. </li><li> Doucement pipette et transférer la solution contenant des sphéroïdes de cellules récupérées sur une plaque de 24 puits. Incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après l&#39;incubation, transférer la solution dans un tube à centrifuger et centrifuger 2 min à 1000 rpm et 4 ° C. </li><li> Transférer 500 pl du surnageant du tube centrifugé à un autre microtube et conserver à 4 ° C pour l&#39;insulineELISA. </li><li> Effectuer protocole d&#39;insuline ELISA constructeur suivante. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Assay <ol><li> Normes ATP: Préparer une solution 10 uM d&#39;ATP et d&#39;effectuer des dilutions en série pour obtenir une série de 8 solutions standard. </li><li> Pour un blanc plaque de 96 puits, ajouter 50 ul de solution sphéroïde cellule (de l&#39;étape G.1.6) et les normes. </li><li> Pour chacun des échantillons contenant bien et les normes, ajouter 50 ul de réactif CellTiter Glo et incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Après l&#39;incubation, le nombre de luminescence mesure des échantillons et des étalons en utilisant un lecteur de microplaques et calibrer l&#39;échantillon concentrations d&#39;ATP en utilisant une courbe de régression linéaire générée par les normes ATP. </li><li> Déterminer la concentration totale d&#39;ATP dans l&#39;échantillon et multiplier par le facteur de dilution de l&#39;échantillon pour obtenir la concentration intracellulaire d&#39;ATP dans une cellule chargée de l&#39;hydrogel. </li></ol> G.3. Déterminer la sécrétion d&#39;insuline <ol><li> Calculer l&#39;amount d&#39;insuline sécrétée à partir des sphéroïdes récupérés en prenant le rapport de la quantité d&#39;insuline sécrétée dans le milieu de glucose élevé de la quantité d&#39;insuline sécrétée dans le milieu de glucose faible. </li><li> Normaliser la teneur en insuline quantifiés de sphéroïdes de cellules avec une quantité correspondante d&#39;ATP intracellulaire des sphéroïdes de cellules récupérées. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole décrit présente des détails sur l&#39;encapsulation de cellules dans facile thiol-ène hydrogels formés par l&#39;étape de croissance de photopolymérisation. Alors qu&#39;un rapport stoechiométrique de 1:1 de norbornène à fonctions thiols a été utilisé dans ce protocole, le ratio peut être ajusté en fonction des expériences. En plus d&#39;une formulation correcte, il est important de maintenir l&#39;homogénéité de la solution de pré-polymère. En particulier, utiliser un léger pipetage p...

Les hydrogels sont des polymères hydrophiles réticulés avec un potentiel exceptionnel en tant que matériaux d&#39;échafaudage pour la réparation et la régénération des tissus. 1-3 La forte teneur en eau des hydrogels permet une diffusion facile d&#39;oxygène et d&#39;échange de nutriments et de produits cellulaires métaboliques, qui sont tous essentiels au maintien de la viabilité cellulaire. En outre, les hydrogels sont porteurs d&#39;excellents pour la libération contrôlée de cellules et la livraison en raison de leur grande accordabilité. 2 hydrogels synthétiques tels que ceux préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont de plus en plus utilisés dans les applications d&#39;ingénierie tissulaire, en grande partie en raison de leur cytocompatibilité, tissus comme l&#39;élasticité, et l&#39;accordabilité élevé en matière des propriétés physiques et mécaniques 4-6. Même si une plate-forme d&#39;hydrogel couramment utilisés, des études ont montré que le PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels formés par la chaîne de croissance photopolymérisations ont tendance à endommager les cellules encapsulées Duriréticulation du réseau ng et dans l&#39;encapsulation cellulaire in situ. 7 Le dommage cellulaire a été largement attribuable à des espèces radicalaires générées par les molécules photo-initiateurs, qui se propagent à travers les groupes vinyle sur PEGDA de réticulation des chaînes de polymères dans des hydrogels. Malheureusement, ces espèces radicalaires également provoquer des contraintes et des dommages cellulaires au cours de l&#39;encapsulation de cellules, en particulier pour les cellules sensibles radical tel que β-cellules pancréatiques. 8-10 Afin d&#39;obtenir une plus grande taille de maille pour une meilleure diffusion et la survie des cellules, des poids moléculaires supérieurs PEGDA sont souvent utilisés pour l&#39;encapsulation cellulaire. Ceci, cependant, compromet cinétique de polymérisation et provoque propriétés de gel sous-optimales biophysiques. 7,11,12 En plus des inconvénients mentionnés ci-dessus, il est très difficile de récupérer les structures cellulaires à partir d&#39;hydrogels PEGDA raison de la nature hétérogène et non-dégradable les réseaux réticulés. Alors que la protéase sensibles peptides peuvent être incorporésdans macromère PEG squelette de rendre inertes les hydrogels autrement PEGDA sensibles à un clivage enzymatique, la conjugaison utilise souvent des réactifs coûteux et les réseaux résultants contiennent encore des haut degré d&#39;hétérogénéité due à la nature de la chaîne de croissance de polymérisation. 13-15 Récemment, le PEG-peptide hydrogels formés par l&#39;étape de croissance de thiol-ène photopolymérisation a été démontré que présentent des propriétés préférentiels pour l&#39;encapsulation de cellules plus hydrogels formés par la chaîne de croissance de photopolymérisation. 7 Les cinétiques de gélification supérieures de thiol-ène hydrogels est attribué au clic » «la nature de la réaction entre un thiol et fonctionnalités ène. Par rapport à la croissance de la chaîne de polymérisation de PEGDA, thiol-ène réaction est inhibée moins d&#39;oxygène qui en résulte rythme plus rapide gélification. 16,17 thiol-ène hydrogels ont aussi une plus grande efficacité de polymérisation et les propriétés biophysiques de meilleures gel par rapport à la chaîne de croissance PEGDA hydrogels, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt; qui se traduit par des dommages cellulaires causés par les espèces peu radicales au cours de photopolymérisation. Auparavant, thiol-ène hydrogels formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et bis-cystéine peptidiques contenant des agents de réticulation, tels que les protéases sensibles peptides ont été utilisés pour l&#39;encapsulation cellulaire. 7,18 accordabilité haut de réseaux d&#39;hydrogel de PEG offre une flexible et contrôlable microenvironnement 3D pour étudier la survie cellulaire et l&#39;activité, tandis que l&#39;utilisation de la protéase sensible séquence peptidique fournit un moyen doux pour la récupération des constructions cellulaires formés naturellement au sein des hydrogels. Dans ce protocole, nous utilisons l&#39;étape de croissance photopolymérisée thiol-ène hydrogels fabriqués en utilisant 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) et un agent de réticulation sensible à la chymotrypsine peptide (CGGY ↓ C) pour l&#39;encapsulation de cellules β min6. Ce protocole élabore systématiquement des techniques pour étudier la formation de survie, la prolifération et l&#39;ellipsoïde de min6β-cellules dans thiol-ène hydrogels. Nous avons en outre fournir une méthode pour β-cellule de récupération sphéroïde et la caractérisation biologique des sphéroïdes récupérés.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 4-bras PEG (20 kDa) </td><td> Jenkem Technology USA </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-aminoacides </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead kit viabilité cellulaire </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Comprend calcéine AM et éthidium homodimère-1 </td></tr><tr><td> Réactif alamarBlue </td><td> AbD Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo réactif </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Sans Ca +2 et Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> SansCa +2 et Mg +2 </td></tr><tr><td> Glycémie élevée DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycotique </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine sans α-chymotrypsine </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Souris Inusin kit ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Seringue jetable </td><td> BD biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Hydrogels sont les polymères réticulés hydrophiles qui fournissent un micro-environnement en trois dimensions avec des tissus en forme de l&#39;élasticité et de perméabilité élevée pour la culture de cellules ou de tissus thérapeutiquement pertinents. Les hydrogels préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont dérivés de plus en plus utilisé pour une variété d&#39;applications d&#39;ingénierie tissulaire, en partie en raison de leurs propriétés accordables et cytocompatible. Dans ce protocole, nous avons utilisé thiol-ène-étape de croissance photopolymérisations pour fabriquer des hydrogels de PEG-peptide pour l&#39;encapsulation du pancréas min6 cellules B. Les gels ont été formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et un agent de réticulation peptide chymotrypsine-sensible (CGGYC). Le caractère hydrophile et non encrassement du PEG offre un microenvironnement cytocompatible pour la survie et la prolifération cellulaire en 3D, tandis que l&#39;utilisation de la séquence peptidique chymotrypsine-sensible (C GGY ↓ C, flèche indique le site de clivage enzymatique, kyste terminal pendanteine résidus ont été ajoutés pour thiol-ène réticulation) permet la récupération rapide des constructions cellulaires formant au sein de l&#39;hydrogel. Le protocole suivant développe des techniques pour: (1) L&#39;encapsulation des cellules β min6 de thiol-ène hydrogels, (2) qualitatifs et quantitatifs des tests de viabilité cellulaire pour déterminer la survie et la prolifération cellulaire; (3) Recouvrement de sphéroïdes de cellules utilisant la chymotrypsine médiation gel l&#39;érosion, et (4) l&#39;analyse structurale et fonctionnelle des sphéroïdes récupérés.

<html> Les figures 1-4 montrent des résultats représentatifs pour l&#39;encapsulation, la survie, la prolifération, la formation sphéroïde, et la récupération sphéroïde dans thiol-ène hydrogels. Figure 1 montre le schéma de réaction (1) étape de croissance de thiol-ène photopolymérisation utilisant PEG4NB et CGGYC, et ( 2) L&#39;érosion chymotrypsine gel de médiation qui suit un mécanisme de l&#39;érosion de surface. figures 2 et 3 pr?...

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Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Le protocole suivant fournit des techniques d&#39;encapsulation du pancréas β-cellules à l&#39;étape de croissance PEG-peptide hydrogels formés par thiol-ène photo-cliquez réactions. Cette plate-forme matérielle offre non seulement un micro-cytocompatible pour l&#39;encapsulation de cellules, mais permet également contrôlé par l&#39;utilisateur récupération rapide des structures cellulaires formés dans les hydrogels.

Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l&#39;étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K vues.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. Le protocole suivant fournit des techniques d'encapsulation du pancréas β-cellules à l'étape de croissance PEG-peptide hydrogels formés par thiol-ène photo-cliquez réactions. Cette plate-forme matérielle offre non seulement un micro-cytocompatible pour l'encapsulation de cellules, mais permet également contrôlé par l'utilisateur récupération rapide des structures cellulaires formés dans les hydrogels.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Les hydrogels d&#39;alginate de culture d&#39;organe en trois dimensions des ovaires et des trompes

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentation d’hydrogels en vrac et transformation en hydrogels granulaires pour des applications biomédicales

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Génération, criblage à haut débit et biobanque de sphéroïdes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes d’origine humaine

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...