La génération de sphéroïdes hépatiques humains à l’aide de sources autologues peut contribuer à divers domaines de recherche tels que la toxicologie, le cancer et la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est d’utiliser des hépatocytes humains dérivés du BDPC pour concevoir des sphéroïdes hépatiques humains, en contournant la pénurie d’hépatocytes humains primaires ou PHH. Les sphéroïdes humains autologues peuvent être étendus à la médecine et à la thérapie régénératives, en particulier chez les patients atteints d’insuffisance hépatique aiguë.
La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Anne-Katherin Schott, chef de projet dans mon laboratoire. Commencez par préparer 500 millilitres de diméthylsulfoxyde de diméthyle de remplacement du sérum KnockOut ou de milieu DMSO KSR et milieu de maturation des hépatocytes. Aliquote du milieu du stock et ajouter le facteur de croissance des hépatocytes frais ou HGF et l’oncostatine M ou OCM à des concentrations finales de 10 ou 20 nanogrammes par millilitre pour chaque changement de milieu.
Transférer trois fois 10 à la cinquième cellule souche pluripotente dérivée du sang ou cellules BD-PSCs dans une plaque à quatre puits recouverte de biolaminine et incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Pour soutenir la différenciation endodermique, cultiver les cellules pendant cinq jours dans un milieu hépatoblast de KSR DMSO et changer le milieu toutes les 48 heures. Le cinquième jour, ajouter le milieu de maturation des hépatocytes et cultiver les cellules pendant sept à 10 jours supplémentaires dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en assurant le changement du milieu toutes les 48 heures.
Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et centrifuger la suspension cellulaire dédifférenciée BD à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension les cellules dédifférenciées BD dans le milieu DMSO KSR à deux fois 10 des six cellules par millilitre de concentration. Après avoir assuré la suspension unicellulaire, enlevez tout débris supplémentaire en faisant passer les cellules à travers une crépine à cellules de 40 micromètres.
Encore une fois, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et préparez un volume suffisant de chaque densité d’ensemencement cellulaire pour distribuer le volume requis par puits. Préparez un gradient avec un ensemencement supérieur d’un million de cellules jusqu’à une faible densité d’ensemencement de 4 000 cellules. Ensuite, distribuez 100 microlitres de milieu DMSO KSR dans des plaques de fixation basses à 96 puits et ajoutez 100 microlitres de dilution d’ensemencement cellulaire.
Incuber la plaque de fixation basse pendant cinq jours. Changez 50% du milieu le troisième ou le quatrième jour après l’ensemencement lorsque les sphéroïdes sont suffisamment compacts. Le cinquième jour, changez le milieu en milieu de maturation hépatocytes et cultivez les cellules qu’il contient pendant sept à 10 jours supplémentaires, en changeant le milieu toutes les 48 heures.
Après avoir cultivé les cellules pendant 4, 8, 15 et 24 jours en utilisant la méthode de différenciation décrite précédemment, retirez le milieu. Incuber les cellules avec des fixateurs préchauffés contenant 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 minutes. Ensuite, jetez le fixateur et lavez les cellules avec du PBS deux fois pendant cinq minutes chacune.
Ajouter immédiatement la solution de Triton X-100 à 0,1% et perméabiliser les cellules pendant cinq minutes avant deux lavages de PBS. Ajouter une solution de blocage à base de PBS et d’albumine sérique bovine à 5% ou BSA avant de placer les cellules sur une plaque à bascule pendant une heure à température ambiante. Diluer les anticorps primaires dans un tampon de dilution à 1% de PBS BSA et ajouter 50 microlitres de dilution d’anticorps par puits.
Jeter la solution d’anticorps après une incubation d’une heure à température ambiante et donner trois lavages de cinq minutes chacun en utilisant du PBS. Ajouter 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans un tampon de dilution dans chaque puits et incuber les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, montez les lamelles de couverture avec un support de montage contenant du DAPI pour une analyse microscopique.
Jeter soigneusement les milieux de culture sans toucher les sphéroïdes et ajouter du PBS fraîchement préparé avec une solution de Triton X-100 à 0,1% et incuber pendant cinq minutes pour perméabiliser les cellules. Lavez les sphéroïdes deux fois avec le milieu en pipetant lentement le milieu. Ensuite, incuber les sphéroïdes avec 50 microlitres d’anticorps primaires pendant une heure.
Une fois cela fait, retirez soigneusement l’excès de solution d’anticorps et donnez trois lavages de moyen. Préparez les anticorps secondaires correspondants comme l’IgG Cy3 anti-souris de chèvre, l’IgG 488 anti-souris de chèvre et l’IgG Texas Red anti-poulet de lapin dans du PBS avec 1% de BSA et ajoutez 50 microlitres de dilution d’anticorps par puits avant 20 minutes d’incubation dans l’incubateur de dioxyde de carbone. Encore une fois, laver trois fois avec le milieu avant 30 minutes d’incubation dans l’incubateur.
Allumez la source lumineuse à fluorescence 10 minutes avant utilisation. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’imagerie. Utilisez l’objectif d’agrandissement 4X en cliquant sur le bouton 4X dans la barre d’outils pour sélectionner la barre d’échelle appropriée.
Placez ensuite la plaque de 96 puits sur la plaque centrale de la scène. Allumez la source lumineuse LED, utilisez le filtre en fond clair et positionnez la plaque sur le puits d’intérêt à l’aide du bouton de réglage de la platine de l’axe XY. Passez au chemin lumineux de la caméra et cliquez sur le bouton en direct dans le logiciel d’imagerie pour visualiser l’image à l’écran.
Assurez-vous que le sphéroïde est centré à l’aide des boutons de l’axe XY et faites la mise au point à l’aide du bouton de mise au point grossier ou fin. Ensuite, choisissez la méthode d’observation en fond clair dans la barre d’outils, définissez les paramètres d’exposition sur automatique, puis cliquez sur le bouton d’instantané dans le panneau de configuration de l’appareil photo pour prendre une photo. Enregistrez ensuite l’image en tant que fichier vsi en utilisant le nom approprié dans le dossier qui vous intéresse.
Placez la plaque de blindage de la lumière ambiante pour éteindre la lumière LED et changer le filtre pour l’excitation B. Choisissez ensuite la méthode d’observation 488. Ouvrez l’obturateur, prenez une photo en cliquant sur le bouton snapshot et fermez l’obturateur et enregistrez le fichier en tant que vsi.
Répétez le processus avec un filtre pour l’excitation G afin de réitérer le processus pour chaque puits d’intérêt. Les changements morphologiques au cours du processus de différenciation hépatique ont montré que les CSP-BD se différenciaient en hépatocytes en trois étapes. La première étape représentait la différenciation en cellules endodermiques.
La deuxième différenciation en cellules progénitrices hépatiques présentant une morphologie polygonale typique. Et le troisième, la maturation en hépatocytes. L’analyse par immunofluorescence a montré la forte expression de marqueurs progéniteurs hépatiques humains de l’endoderme tels que l’alpha fœtoprotéine ou APF et la transthyrétine ou TTR dans les cellules au premier stade du processus de différenciation hépatique au jour L4 à L8.
Cependant, leur expression a diminué à L15 jours. L’expression de l’albumine ou ALB et du facteur nucléaire quatre alpha des hépatocytes ou HNF4 alpha est apparue d’abord à L4, a augmenté tout au long du temps de différenciation L4 à L15, et a atteint une expression forte et stable pendant le temps de maturation L15 à L24. L’agrégation spontanée des cellules a été observée dans des plaques de fixation faibles contenant une induction hépatocytes ou une formation de sphéroïdes initiée par un milieu de maturation.
Une corrélation constante a été observée entre le stéroïde sphéroïde et le nombre variable de cellules. Les sphéroïdes formés et différenciés à L14 et vivants colorés avec des anticorps ont révélé l’activité fonctionnelle hépatique potentielle des sphéroïdes dérivés des BD-PSC. La préparation des cellules mononucléaires pour la reprogrammation est l’étape la plus importante de cette procédure.
La génération de sphéroïdes hépatiques humains est la première étape pour créer des organoïdes version simplifiée in vitro de l’organe en 3D avec une micro anatomie similaire à celle in vivo. Les organoïdes créés en laboratoire sont utilisés pour étudier l’organogenèse, le développement de maladies et les nutriments.
