Notre protocole peut être utilisé pour tester rapidement et facilement le rôle de n’importe quel gène candidat dans la colonisation et la croissance métastatiques. Le protocole permet également une surveillance en temps réel de la métastase, de la formation et de la croissance, ainsi que la quantification du nombre et de la taille des métastases chez les mêmes animaux sans avoir besoin de résection ou de coloration histologique. Plaque quatre cellules T1 à 150 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits dans un média de croissance complet.
Incuber à 37 degrés Celsius 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le média de croissance des cellules. Ajoutez 500 microlitres de supernatant viral de luciferase et 500 microlitres de supernatant viral de protéine fluorescente pour infecter simultanément les cellules avec les supernatants viraux de luciferase et de protéine fluorescente.
Ajoutez ensuite un microlitre de huit milligrammes par bromure d’hexadiméthrine millilitre et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Essayez les quatre cellules T1 avec 500 microlitres de trypsine. Après deux à cinq minutes, transférer toutes les cellules dans un plat de six centimètres en quatre millilitres de média de sélection, étancheant ainsi la trypsine.
Une fois la sélection terminée, confirmez que les quatre cellules T1 infectées expriment la protéine fluorescente ZsGreen à l’aide d’un microscope fluorescent inversé à 50 à 100 fois grossissement. Confirmez également que les quatre cellules T1 infectées expriment la luciferase à l’aide d’un kit d’activité de luciferase disponible dans le commerce. Procéder à l’optimisation de la conception expérimentale in vivo tel que décrit dans le protocole de texte.
Aspirer le média et rincer les plaques cellulaires avec 1X PBS. Essayez les cellules avec cinq millilitres de trypsine par plaque de 15 centimètres pendant deux à cinq minutes et transférez toutes les cellules dans un tube conique. Lavez les cellules restantes du plat de culture tissulaire avec suffisamment de supports de croissance complets pour étancher la trypsine.
Ajouter le lavage au même tube conique. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé pour déterminer le nombre total de cellules. Ensuite, centrifuger les cellules à 122 fois G pendant trois minutes, et aspirer le supernatant.
Suspendre à nouveau les cellules en 1X PBS à la concentration désirée. Ici, 25 000 cellules sont injectées dans chaque souris et 100 microlitres de PBS. Donc les cellules re-suspendues sont à 250 000 cellules par millilitre.
Garder les suspensions cellulaires sur la glace jusqu’à l’injection. En travaillant dans une hotte à l’installation animale, mélangez doucement mais soigneusement les cellules en inversant le tube ou en utilisant une seringue d’un millilitre pour s’assurer qu’elles sont uniformément re-suspendues. Maintenant, chargez une seringue Luer Lock d’un millilitre avec la suspension cellulaire et expulsez les bulles d’air excédentaires.
Placez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 sur la seringue avec le biseau vers le haut et expulser les bulles d’air. Placez doucement la souris dans un restrainer de rongeur. La veine latérale de la queue doit être visible et dilaté.
Sinon, pincez doucement la base de la queue et trempez la queue dans l’eau chaude du robinet pour dilater les veines. Utilisez un lingette à alcool pour nettoyer la queue, puis insérez l’aiguille dans la veine de la queue, biseauté vers le haut, et injectez 100 microlitres de suspension cellulaire. Si l’aiguille est insérée correctement dans la veine, elle doit facilement glisser légèrement vers l’avant et vers l’arrière, et il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé.
Les injections réussies devraient également entraîner une bouffée d’eau dans laquelle la couleur bleue de la veine devient blanche pendant quelques secondes après l’injection. Retirez lentement l’aiguille et utilisez une gaze stérile, appliquez une pression sur le site d’injection pour arrêter tout saignement. Remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer un rétablissement complet.
Allumez le dispositif d’imagerie animale en direct in vivo, ouvrez le logiciel d’image et connectez-vous. Cliquez sur le bouton initialiser et attendez que la machine para paraize. Modifiez le champ de vision en D.Pour la première fois, modifiez les paramètres d’exposition en cliquant sur modifier, préférences, acquisition et exposition automatique.
Modifiez le temps d’exposition maximum de la valeur par défaut de 60 secondes à 300 secondes et cliquez bien. Chargez une seringue d’un millilitre avec de la d-luciferine, puis ajoutez une aiguille de calibre 30 d’un demi-pouce à la seringue et expulsez les bulles d’air. Mesurer et enregistrer la masse d’une souris anesthésiée.
Retenez la souris en pinçant le scruff du cou à l’aide du pouce et des doigts pointants et en saisissant la queue entre le doigt rose et la base de la main. Inverser la souris à un angle de 45 degrés avec sa tête pointant vers le bas. Insérez l’aiguille, côté biseauté vers le haut, dans l’espace IP côté gauche de la souris.
Confirmez l’entrée dans l’espace IP en reculant un petit volume. Il ne doit pas y avoir de couleur à la base de l’aiguille lors du recul dans l’espace IP. Injecter le volume approprié de D-luciferin pour une dose de 150 milligrammes par kilogramme.
Immédiatement après l’administration de D-luciferin, démarrez une insurité. Placez la souris à plat sur le dos dans le dispositif d’imagerie avec son nez dans le cône avant, et assurez-vous que la moitié à deux pour cent et demi isoflurane est administré. Cliquez sur les boîtes luminescentes et photographiques.
Modifiez le temps d’exposition à l’automobile, puis cliquez sur acquérir dans le panneau de contrôle d’acquisition. Après l’imagerie, remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète. Après l’euthanasie, tel que décrit dans le protocole textuel, isoler et enlever les poumons de chaque souris et rincer en 1X PBS pour éliminer l’excès de sang.
Acquérir des images de métastases ZsGreen dans les lobes à 10X à Brightfield et la fluorescence à l’aide d’un stéréoscope fluorescent avec un filtre à large bande GFP. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour quantifier la taille et le nombre de métastases à partir des images. Pour traiter et analyser les données des images acquises avec le dispositif d’imagerie animale en direct in vivo, ouvrez tous les fichiers d’image pour chaque souris dans le logiciel d’image.
Assurez-vous que les unités sont en radiance pour les données bioluminescentes et l’efficacité des données fluorescentes en cliquant sur la flèche en haut à gauche de la fenêtre d’image et en la changeant à l’unité appropriée. Utilisez l’image depuis le dernier point de temps pour créer une région d’intérêt, ou roi, en cliquant d’abord sur les outils roi dans la fenêtre de palette d’outils. Ensuite, insérez un retour sur investissement en cliquant sur la flèche et en sélectionnant une.
Cliquez sur la bordure du roi et déplacez-le sur la poitrine de la souris. Ajustez la taille du roi de sorte qu’il couvre la poitrine de la souris et n’exclut pas le signal. Ensuite, cliquez sur mesurer les ROM et copier ou taper le numéro brut dans une feuille Excel.
Tracez et analysez les données telles que décrites dans le protocole texte. Cliquez à droite dans le fichier d’image pour copier le retour sur investissement, puis le coller dans les fichiers d’image des autres points de temps et cliquez sur mesurer les ROM. Le vecteur rétroviral exprimant des shARN à base de miR-30 en tandem ciblant à la fois le YAP et le TAZ réduit l’expression des protéines YAP et fiscales et l’activité transcriptionnelle dans quatre cellules T1.
Quatre cellules de luciferase T1 ont été habilement transduced avec une version d’expression de ZsGreen de ce vecteur de shRNA de YAP/TAZ de tandem ou un shRNA miR-30-basé commandé. Les images bioluminescentes montrent que la vitesse à laquelle la charge métastatique a augmenté était significativement plus rapide chez les souris injectées avec des cellules témoins par rapport aux souris injectées avec des cellules de knockdown YAP/TAZ. Une parcelle du signal de luciferase transformé log10 mesurée pour chaque souris au cours de l’expérience montre également que le taux était plus rapide chez les souris injectées avec les cellules témoins par rapport aux souris injectées avec des cellules de knockdown YAP/TAZ.
Significativement moins de métastases formées chez les souris injectées avec les cellules de knockdown YAP/TAZ par rapport aux souris avec des cellules témoins lorsqu’elles sont comptées manuellement. La même tendance a été observée lors de l’utilisation du logiciel d’analyse d’images. Non seulement beaucoup plus de métastases se sont forment chez les souris témoins, mais elles étaient généralement plus grandes.
Uniformément, la charge métastatique dans les poumons a également été considérablement réduite par le renversement de YAP/TAZ. L’injection réussie d’un nombre égal de cellules saines dans chaque souris est essentielle pour assurer des données de haute qualité. N’oubliez pas de faire preuve de prudence et de suivre les directives de sécurité lorsque vous travaillez avec des rétrovirus infectieux et des lentivirus, en particulier si les virus sont infectieux pour l’homme.
Cette technique nous a permis d’illustrer les rôles des gènes candidats et la colonisation et la croissance métastatiques, fournissant un moyen d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la maladie métastatique. Après cette procédure, les métastases contenant des poumons peuvent être analysées plus en détail par coloration immunofluorescente ou histologique pour étudier comment le gène altéré influence les métastases et identifier d’autres protéines qui peuvent être impliquées.
