Nous remercions le Dr Harvey Hensley pour son support technique expert. Ce travail a bénéficié de l&#39;utilisation des éléments suivants Fox Chase Cancer Center (FCCC) des installations: Laboratoire de l&#39;animalerie et les petites installations d&#39;imagerie animale. Ce travail a été soutenu en partie par le cancer de l&#39;ovaire au SPORE FCCC / UPenn (P50 CA083638), la CCCC coeur de subvention (P30 CA006927) et le Fonds de recherche du cancer ovarien.

I. Préparation des cellules de tumeur ovarienne <ol><li> Cultivez des lignes cellulaires de cancer ovarien exprimant la luciférase dans la culture. Sources de la luciférase peut être Firefly, Renilla, ou d&#39;autres espèces. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent également être utilisés. Pour cette démonstration, nous utilisons une lignée de cellules du cancer ovarien, OVCAR5, exprimant la luciférase de luciole. </li><li> Récolte des cellules en utilisant la routine technique de culture cellulaire. </li><li> Gardez la suspension cellulaire (10.000 cellules / uL) en tampon phosphate salin (PBS) sur la glace jusqu&#39;au moment de l&#39;injection. </li></ol> II. Injection Intrabursal Cette procédure nécessite l&#39;assistance d&#39;un deuxième personne. Toutes les interventions chirurgicales sont effectuées dans des conditions aseptiques. Cela comprend en tenue chirurgicale et l&#39;utilisation des instruments chirurgicaux stériles, seringues et des aiguilles. <ol><li> Préparer la solution anesthésique en mélangeant 3 mL de chlorhydrate de kétamine (100 mg / ml), 1,6 ml de chlorhydrate de xylazine (100 mg / ml), 1,5 ml d&#39;acépromazine (10 mg / ml), et 20 ml de chlorure de sodium à 0,9%. </li><li> Vérifiez le numéro d&#39;identification de l&#39;animal et la santé observables. Anesthésier les animaux avec des prêts kétamine-xylazine-acépromazine l&#39;anesthésie par voie intrapéritonéale (IP) d&#39;injection avec un volume de dose de 8 ~ 9 poids corporel mL / kg (mc). </li><li> Confirmez que l&#39;animal est sous une plaine acceptable de l&#39;anesthésie en effectuant un pincement de l&#39;orteil avec une pince ou les doigts aux pattes arrières de l&#39;animal. S&#39;il ya pédale de réflexe, attendre une profonde plaine de l&#39;anesthésie jusqu&#39;à l&#39;animal ne répond pas à cette procédure. </li><li> Posez la face dorsale des animaux sur une compresse stérile avec sa tête tournée vers sa queue et en face de vous. Le point d&#39;incision est située à gauche ou à droite de la ligne médiane et au-dessus des ovaires. Se raser ou de la fourrure mouillée avec de l&#39;alcool à 70% au point d&#39;incision. </li><li> Soulever la peau humide en utilisant une pince et de faire une petite incision avec les ciseaux à la position dorsomédial et directement au-dessus du pavé de l&#39;ovaire graisse. Le coussinet adipeux de l&#39;ovaire doit être visible sous la surface de la paroi péritonéale. Coussinet adipeux est facilement reconnaissable par sa couleur blanche contraste avec le tissu rose foncé qui l&#39;entourent. </li><li> Soulevez doucement le revêtement mural péritonéale et faire une petite incision comme décrit ci-dessus (5). </li><li> Placez un tampon imbibé de gaze stériles salins sur la ligne médiane adjacente à l&#39;incision. Repérez le tampon de l&#39;ovaire de graisse et retirez-le doucement et il reste sur la gaze. Stabiliser l&#39;ovaire par serrage du coussinet adipeux avec une pince-notes. Sous un microscope, la position de la dissection de l&#39;ovaire que pour permettre l&#39;insertion de l&#39;aiguille (calibre 30, G) dans le virage tubule oviducte menant à la bourse. Lorsque l&#39;aiguille est insérée dans la bonne position, il devrait être visible sous la bourse. </li><li> Poussez doucement le piston de la seringue pour injecter 5 pi de suspension cellulaire entre la bourse et de l&#39;ovaire tandis que la seringue est positionnée au site d&#39;injection. Cette étape nécessite deux personnes. Une personne pousse le piston pendant que l&#39;autre maintient le positionnement de l&#39;aiguille. Retirer l&#39;aiguille rapidement pour sceller le site de ponction, mais doucement assez de ne pas déchirer la bourse et des tubules. La bourse ne doit apparaître comme légèrement distendu par injection. </li><li> Relâchez le coussinet adipeux de la pince-notes et doucement remplacer l&#39;appareil reproducteur et le dos du coussinet adipeux dans la cavité péritonéale. Fermez doucement la paroi du corps en tirant sur la paroi supérieure du péritoine sur le bas doublure. Fermer la peau avec des agrafes chirurgicales ou des clips plaie. </li><li> Placez l&#39;animal récupération de retour dans sa cage et fournir une source de chaleur sûre pour éviter l&#39;hypothermie et d&#39;accélérer la récupération. Surveiller le taux de respiration et de la facilité, le retour du tonus musculaire et la capacité à bouger volontairement. Ce sont tous de bons indicateurs de la progression vers la guérison. Agrafes ou blessure peut être retiré 7 ou plus après la chirurgie jours. </li></ol> III. Oral gavage <ol><li> Utilisez un 18 ~ 20 G aiguille gavage ou alimentation par sonde avec un bout arrondi. L&#39;aiguille de gavage ne devrait pas être plus long que la distance entre l&#39;extrémité de la tête de l&#39;animal à son dernière côte. </li><li> Vérifiez le numéro d&#39;identification de l&#39;animal et la santé observables. Doucement Scruff l&#39;animal en le saisissant par la peau sur les épaules avec le pouce et les doigts. La contention doit être juste assez ferme pour les membres antérieurs d&#39;être prolongée de chaque côté et à l&#39;écart. L&#39;animal ne doit pas être en mesure de saisir à l&#39;aiguille. </li><li> Tirez doucement la tête de l&#39;animal avec votre index, formant une ligne droite à travers le cou et l&#39;oesophage. Soutien dos de l&#39;animal à l&#39;intérieur de votre pouce. </li><li> Doucement et sans force, insérer l&#39;aiguille de gavage de chaque côté de la bouche et sur la langue. Dans un mouvement sans heurt, l&#39;aiguille doit passer contre le toit de la bouche et l&#39;œsophage. Gravity devrait guider l&#39;aiguille vers le bas sans rencontrer de résistance. S&#39;il ya une resistanCE, retirez l&#39;aiguille et recommencer. Gag de l&#39;animal et le réflexe d&#39;avaler peut être déclenché lors de l&#39;insertion. Cependant, il devrait y avoir aucune résistance ou de l&#39;animal haletant. Il est important de s&#39;assurer que l&#39;animal respire, lorsque l&#39;aiguille est en place en vérifiant le mouvement des narines et la poitrine. </li><li> Poussez lentement le piston de la seringue pour distribuer le volume de la dose. </li><li> Retirer délicatement l&#39;aiguille gavage au même angle et la voie que la voie qu&#39;il a été inséré dans l&#39;œsophage. </li><li> Retour à l&#39;animal de sa cage et la respiration de surveiller et de comportement pendant 5 ~ 10 minutes. </li></ol> IV. Imagerie in vivo Nous utilisons les sciences de la vie étrier pour surveiller le comportement des cellules injectées dans la cavité intrabursal. Des expériences utilisant ce système ont généralement un délai de 4 ~ 16 semaines à partir du moment de l&#39;implantation tumorale. <ol><li> Préparer la solution de D-luciférine (substrat de la luciférase de luciole) par dissolution de 5 ~ 20 mg dans 1 ml de PBS et le filtrage par membrane de 0,22 um pour la stérilisation. </li><li> Charge de la chambre de l&#39;induction en tournant sur les deux l&#39;oxygène et le gaz isoflurane. Tourner sur le flux de gaz à la chambre d&#39;induction seulement. Le débit d&#39;isoflurane est maintenue à un faible niveau jusqu&#39;en animaux sont prêts à être imagé. </li><li> Vérifiez le numéro d&#39;identification de l&#39;animal et la santé observables. Placez l&#39;animal dans la chambre de l&#39;induction chargé de gaz isoflurane. </li><li> Retirez les animaux de la chambre lorsque l&#39;animal semble être anesthésié. Livrer 200 uL d&#39;une solution de luciférine préparée par injection IP à l&#39;aide d&#39;aiguille 30 G. Il est important d&#39;enregistrer le temps d&#39;injection afin de maintenir le temps entre l&#39;injection cohérente luciférine et la performance d&#39;imagerie à travers l&#39;étude. </li><li> Placez le dos de l&#39;animal luciférine-injecté dans la chambre d&#39;induction. </li><li> Réglez le système d&#39;imagerie pour les paramètres appropriés. Soyez sûr d&#39;initialiser le système avant l&#39;acquisition de l&#39;image premier animal. </li><li> Eteignez le débit de gaz de la chambre de l&#39;induction et tourner sur le flux de gaz dans la chambre de l&#39;imagerie. </li><li> Placez la dorsale des animaux anesthésiés ou face ventrale en place. Veillez à placer le nez de l&#39;animal dans un cône de nez de maintenir l&#39;induction anesthésique approprié. Assurez-vous que l&#39;animal est dans le &quot;point de la grille d&#39;intérêt&quot; comme indiqué par l&#39;illumination verts. </li><li> Fermez la porte de la chambre et d&#39;acquérir l&#39;image au moment opportun. Le temps peut être déterminé par la cinétique. </li><li> Retirez les animaux de la chambre de l&#39;imagerie et le replacer dans sa cage. Surveiller la récupération des animaux tel que décrit dans «Injection Intrabursal&quot;. </li></ol> Résultats Représentant V. <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Imagerie in vivo des cellules tumorales ovariennes dans un modèle murin orthotopique. OVCAR5 cellules exprimant la luciférase ont été injectées dans intrabursally ovaire droit et imagés au fil du temps. Les images ont été prises 13 (à gauche), 17 (milieu) et 22 (droit) jours après l&#39;injection en utilisant le système d&#39;imagerie IVIS spectre. Face dorsale est montré dans le panneau supérieur et la face ventrale est en bas du panneau. Notez que la propagation des cellules tumorales péritonéale 22 jours suivant l&#39;injection. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par les soins Fox Chase Cancer Center animaux institutionnel et le Comité d&#39;utilisation.

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Cancer de l&#39;ovaire est la principale cause de décès parmi tous les cancers gynécologiques 1. Le taux élevé de mortalité de cette maladie est largement due à son diagnostic tardif et le manque de fiabilité des méthodes de diagnostic 2. Par ailleurs, la chimiothérapie conventionnelle se heurte souvent à la chimiorésistance et de rechute de cancer 3. Par conséquent, de nouvelles thérapies est nécessaire pour cibler efficacement cette maladie. Dans le développement de nouvelles thérapies ciblant le cancer ovarien humain, il est essentiel d&#39;élaborer un modèle animal représentatif. Un modèle animal orthotopique a des avantages sur des modèles de xénogreffe classiques (par exemple sous-cutanée ou intrapéritonéale injections de cellules tumorales) en ce que 1) il reproduit le site principal de la formation de tumeurs, 2) il représente le site commun de métastases, et 3) il fournit aux cellules tumorales interagir avec microenvironnement approprié 4, 5, 6, 7, 8. Les rongeurs ont une membrane unique, la bursite qui entoure l&#39;ovaire et est continue avec l&#39;oviducte. Cette anatomie unique de rongeurs permet l&#39;injection de cellules tumorales ovariennes orthotopique. Intrabursally injecté des cellules tumorales ovariennes comportement similaire à la maladie humaine, ce croissant au sein de la membrane et la diffusion intrabursal dans la cavité péritonéale à mesure que progresse la tumeur. L&#39;injection de cellules exprimant de façon stable luciférases ou des protéines fluorescentes permet également le suivi de comportement des cellules tumorales en temps réel. Bioluminescentes et / ou la technologie d&#39;imagerie fluorescente permet aux cellules tumorales d&#39;image à plusieurs reprises sur une période prolongée de temps et la croissance tumorale étude, la distribution, et la régression non-invasive de manière 9, 10, 11. En établissant le modèle orthotopique, il est essentiel de supprimer rapidement l&#39;aiguille de la bourse lors de l&#39;injection. Retrait brutal des phoques aiguille de ponction et empêche la fuite de cellules injectées. Toutefois, dans le même temps, le mouvement doit être doux de ne pas déchirer la bourse. Si une fuite se produit pendant l&#39;injection, il peut causer des cellules à des semences dans l&#39;abdomen et potentiellement confondre l&#39;étude, soit prématurée propager à l&#39;extérieur de l&#39;ovaire. Dans ce cas, l&#39;animal en question devraient être enregistrées et suivies pour le développement de sites tumoraux multiples dans le péritoine avant le traitement ou bien éliminés des analyses ultérieures. Avant de procéder à un gavage oral, il est essentiel de vérifier la longueur du tube de gavage en mesurant de la pointe de la tête de l&#39;animal à la dernière côte. Il est utile de marquer le tube au nez de l&#39;animal et ne pas passer le tube au-delà de cette marque. L&#39;insertion du tube au-delà de cette marque peut entraîner une perforation de l&#39;estomac. Déterminer la longueur du tube est particulièrement important avec de jeunes animaux ou des animaux pesant moins de 20 g. Lors de l&#39;insertion de l&#39;aiguille de gavage dans l&#39;œsophage, il devrait y avoir aucune résistance ou de lutte de l&#39;animal. Il est important de ne pas administrer la solution ou la suspension trop vite car cela peut conduire au reflux et ensuite livrer le volume dose inexacte, ainsi que l&#39;ajout de stress pour l&#39;animal. Pour obtenir des résultats comparables d&#39;imagerie, de temps en temps, il est souhaitable de maintenir le temps cohérent entre l&#39;injection de substrat de la luciférase et d&#39;imagerie. Le laps de temps peut être déterminé en prenant des séries d&#39;images après l&#39;injection du substrat et d&#39;observer la cinétique des signaux. Développement d&#39;un modèle de souris orthotopique de cancer de l&#39;ovaire, l&#39;administration orale de médicaments, et l&#39;imagerie in vivo sont les techniques nécessaires à une meilleure compréhension du développement et de propagation du cancer de l&#39;ovaire et d&#39;évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques qui pourraient éventuellement améliorer les résultats des patients atteints de cette maladie mortelle.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Cancer de l&#39;homme et la réponse au traitement est mieux représentée dans les modèles animaux orthotopique. Ce document décrit le développement d&#39;un modèle de souris orthotopique de cancer de l&#39;ovaire, le traitement du cancer par administration orale de médicaments, et le suivi du comportement des cellules tumorales en réponse à un traitement médicamenteux en temps réel en utilisant dans le système d&#39;imagerie in vivo. Dans ce modèle orthotopique, les cellules tumorales exprimant la luciférase de l&#39;ovaire sont appliquées localement en leur injectant directement dans la bourse de souris où chaque ovaire est clos. Lors de l&#39;injection de D-luciférine, un substrat de la luciférase de luciole, la luciférase cellules exprimant générer des signaux de bioluminescence. Ce signal est détecté par le système d&#39;imagerie in vivo et permet un moyen non invasif de surveillance de la croissance tumorale, la distribution, et la régression chez des animaux individuels. L&#39;administration du médicament par gavage permet un volume de dosage maximum de 10 mL / kg de poids corporel pour être livrés directement à l&#39;estomac et ressemble étroitement à la distribution des médicaments dans les traitements cliniques. Par conséquent, les techniques décrites ici, le développement d&#39;un modèle de souris orthotopique de cancer de l&#39;ovaire, l&#39;administration orale de médicaments, et l&#39;imagerie in vivo, sont utiles pour une meilleure compréhension du cancer ovarien humain et le traitement et améliorer le ciblage de cette maladie.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Modèles animaux orthotopique de cancer ovarien de reproduire la maladie humaine de mieux et donc améliorer notre compréhension de la progression du cancer et de la réponse tumorale au traitement. Un modèle de souris reçoit une injection intrabursal de la luciférase cellules tumorales exprimant l&#39;ovaire. Le traitement est administré par gavage. La croissance tumorale est contrôlée par<em&gt; In vivo</em&gt; Système d&#39;imagerie.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Vidéo: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Recherche

Biologie

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Imagerie resténose intra-stent: un peu coûteux, modèle fiable et rapide précliniques

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Imagerie du peroxyde mitochondrial dans des cellules de levure vivantes à l’aide de mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche mitochondriale - Biocapteur mtHyper7 pour l’analyse subcellulaire 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Imagerie de mtHyPer7, un biocapteur ratiométrique pour le peroxyde mitochondrial, dans des cellules de levure vivantes

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...