<p class="jove_content"&gt; Nous remercions le Dr Yuval Dror Gottlieb-pour l&#39;illustration d&#39;électroporation. Ce travail a été soutenu par des subventions à DSD de l&#39;Institut national pour la psychobiologie en Israël et dans le programme de coopération Niedersachsen-Israël pour la recherche et par des subventions à AK de la Fondation Israël Science, le ministère israélien de la Santé et le Centre du Patrimoine Excellence-Legacy partenariat des sciences biomédicales.</p&gt;

1. électroporation Rhombencéphale 1.1 manipulation des oeufs <ol><li> Placez les oeufs horizontalement dans un incubateur humidifié (37 à 38,5 ° C). Les embryons sont électroporation après 65-70 heures d&#39;incubation, quand ils atteignent 16-17 (HH) stade (25-30 somites). </li><li> Retirer les oeufs de l&#39;incubateur, ils restent en position horizontale. </li></ol> 1.2 Préparatifs <ol><li> Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre). </li><li> Connexion pliées en forme de L Genetrodes électrodes d&#39;or (3 mm de diamètre) avec un support d&#39;adaptateur sur le générateur d&#39;impulsions. paramètres d&#39;électroporation comprennent 25 volts, 5 numéros d&#39;impulsions, 45 msec longueur d&#39;impulsion, 300 msec intervalles impulsions. </li><li> Préparer une pipette de bouche, 10 ml aiguille de la seringue, bandes parafilm, une brosse douce, des ciseaux de dissection tranchants et une solution de PBS stérile 25 ml. Cette quantité est habituellement suffisante pour gérer un plateau d&#39;oeufs (18 oeufs). </li><li> Préparer un mélange adéquat de plasmides d&#39;ADN (5 ug / ul chacun) etajouter environ 0,025% de colorant de vert rapide de visualiser injection d&#39;ADN. Habituellement, un volume de 4 pi est suffisant pour l&#39;injection d&#39;un plateau. </li></ol> 1.3 fenêtrage, injection et l&#39;électroporation <ol><li> Nettoyer les coquilles d&#39;œufs avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Manipuler un oeuf à la fois pour réduire le temps d&#39;exposition embryonnaire à l&#39;air. </li><li> Faire un trou au niveau du pôle d&#39;oeuf avec des ciseaux fins et retirer 3-4 ml d&#39;albumine avec la seringue. Ne pas retirer une plus grande quantité d&#39;albumine, car elle réduit la viabilité. </li><li> Ouvrir une petite fenêtre ovale (2,5 x 2 cm d&#39;épaisseur) au centre supérieur de la coquille de l&#39;oeuf à l&#39;aide des ciseaux de dissection. </li><li> Goutte à goutte quelques gouttes de PBS sur le dessus de l&#39;embryon pour prévenir la sécheresse durant tout le processus. </li><li> Charger une petite quantité du mélange d&#39;ADN dans le capillaire en verre à l&#39;aide d&#39;une pipette de bouche. </li><li> Placez l&#39;embryon avec son extrémité postérieure vers vous. Pas d&#39;injection d&#39;encre est nécessaire à ce stade que l&#39;embryon est clairement visible. Éviter les augmentations d&#39;injection d&#39;encresurvie embryonnaire. Pénétrer dans le cerveau postérieur caudale en maintenant le capillaire à ~ 45 °. Ne pas enlever la membrane du monde embryon. Injecter la solution d&#39;ADN soigneusement dans la lumière du cerveau postérieur et expirez sans former de bulles d&#39;air. solution d&#39;ADN se propage en avant. </li><li> Immédiatement après l&#39;injection d&#39;ADN, placer les électrodes parallèles à l&#39;AP précise et DV position hindbrain vous visez à cibler. Poussez les électrodes légèrement ventrale sans toucher le cœur, car il peut réduire la viabilité. Pulser le électroporateur. Les électrodes doivent être couverts avec des bulles pour indiquer une conductivité électrique (figure 1A). </li><li> Retirez délicatement les électrodes et couler quelques gouttes de PBS pour refroidir l&#39;embryon et pour éliminer les bulles. Sceller l&#39;ouverture correctement avec une bande parafilm pour éviter le dessèchement pendant l&#39;incubation oeuf. Lavez électrodes dans PBS avec la brosse douce. </li><li> Placer l&#39;œuf dans l&#39;incubateur pendant la durée souhaitée. La survie des embryons est d&#39;environ 90% 2-3 jours aprèsélectroporation, et réduit jusqu&#39;à 50% de 12 jours après l&#39;électroporation. </li></ol> 2. Analyse des embryons 2.1 préparation Flat-mount et immunofluorescence <ol><li> Préparations plat de montage du cerveau postérieur peuvent être effectuées jusqu&#39;à E6.5 de visualiser facilement les axones sous un microscope ou un stéréo-microscope. </li><li> Disséquer l&#39;embryon soigneusement en le séparant de membranes qui entourent et les vaisseaux sanguins. Placez l&#39;embryon dans une petite silicone - boîte de Pétri contenant recouvert PBS. Fixez l&#39;embryon dans le plat avec des épingles de tungstène face dorsale. Effectuer une fente dorsale dans le cerveau postérieur toit-plaque à l&#39;aide forte capillaires en verre. </li><li> En utilisant des pinces pointues et des micro-ciseaux tenir la partie supérieure de la tête et tirez le tissu de cerveau postérieur très soigneusement de rostral à caudal. Après la séparation du cerveau postérieur éliminer les derniers tissus ventraux pour atteindre une préparation propre. </li><li> Incuber le cerveau postérieur avec 4% solution de paraformaldéhyde (PFA) pour 1-2 heures à température ambiante (RT). Laver le cerveau postérieur avec PBT (PBS contenant 0,1% de Triton X-100) pour enlever les PFA. </li><li> Pour immunofluorescence dans hindbrains plat montés ajouter 500 ul de solution de blocage (5% de sérum de chèvre en PBT et incuber pendant 2 heures à température ambiante incuber avec 1 m anticorps ON à 4 ° C. Laver avec de PBT (15 min x 3). Incubate avec 2 ème anticorps pendant 2 heures à température ambiante. Laver avec PBT (15 min x 3). </li><li> Placez le cerveau postérieur face dorsale sur une lame de verre. Ajouter milieux de montage fluorescentes sur le cerveau postérieur. Utilisez capillaires en verre ou des aiguilles de tungstène pour aplatir le cerveau postérieur sur la diapositive. </li><li> Ajoutez petite quantité de graisse à chaque coin pour éviter la compression des tissus par la lamelle. Placez délicatement une lamelle sur le dessus du cerveau postérieur et d&#39;éviter les bulles d&#39;air. Pour ajouter adhésion de vernis à ongles pour couvrir les bords du verre. </li></ol> 2.2 Cryo-sections et immunofluorescence <ol><li> Cryo-sections du tronc cérébral can être effectuée à n&#39;importe quel stade de visualiser les trajectoires axonales. Pourtant, après E6.5 ce devrait être la méthode privilégiée en raison de la difficulté à visualiser axones dans l&#39;embryon plate-monté, qui devient trop épaisse. De plus, la démonstration de synapses nécessite la coupe du tissu et une vue à fort grossissement au microscope. </li><li> Disséquer l&#39;embryon et enlever tous les tissus environnants. Rincer avec du PBS. Couper l&#39;embryon à la partie caudale de la moelle aide de micro-ciseaux et des pinces acérées. Faire une large incision entre le cervelet et le mésencéphale et retirer l&#39;ensemble du tronc cérébral. Le tissu doit contenir la moelle, la protubérance et le cervelet. </li><li> Fixer le tronc cérébral dans 4% PFA pour la nuit (ON) à 4 ° C, rincer avec du PBS (10 min x 3), et incuber à 30% de saccharose de ON à 4 ° C jusqu&#39;à son naufrage. </li><li> Intégrer le cerveau postérieur dans un cryo-moule avec du composé OCT (Optimal Cutting Temperature), et placez-le à -20 ° C jusqu&#39;à ce que le gel, comme décrit par ailleurs 11. </li><li&gt; Placez le bloc octobre dans le cryostat à l&#39;axe section souhaitée. largeur de la section est de 12 um. </li><li> Sécher les diapositives. Ajouter 100 ul de solution de blocage sur chaque diapositive pendant 2 heures à température ambiante. Ajouter 100 ul d&#39;anticorps (dilué dans la solution de blocage à la concentration souhaitée). La période d&#39;incubation de 1 ère et 2 ème anticorps est ON à 4 ° C ou 2 heures à température ambiante, respectivement. Pour chaque temps d&#39;incubation, ajouter doucement la bande parafilm sur le dessus de la lame pour prévenir la sécheresse. Laver avec du PBS (10 min x 3) entre les anticorps. Si nécessaire, ajoutez 1:1000 Dapi (4&#39;-6-Diamidino-2-phenylindole), dilué dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincer avec du PBS. </li><li> Monter la lame avec un milieu de montage fluorescentes. Laisser sécher pendant 1 heure avant l&#39;analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li><li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord.">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons.">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21 (2009).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain.">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining.">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm,+Pectinophora+gossypiella.">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li><li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis.">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li><li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain:+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition.">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li><li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain.">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li><li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.</p

En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux 20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d&#39;électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l&#39;étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition Pi...

Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l&#39;audition et la coordination motrice 1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral 4. Le cerveau postérieur est également divisé le long de son axe dorso-ventral (DV) dans une plaque basale et Alar, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux distincts deviennent spécifiés et se différencient dans des endroits distincts DV 3,5,6. Comment le début AP et spécifiques DV modèles neuronaux sont relatives à la création de circuits de tronc cérébral fonctionnel est largement inconnue. D&#39;acquérir des connaissances sur ce principe fondamentalquestion, des outils sont nécessaires pour étiqueter sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur au début et à retracer leurs trajectoires axonales et la connectivité à des stades plus avancés. Nous avons déjà utilisé des éléments activateurs spécifiques, et un système d&#39;expression conditionnelle Cre / loxP-base pour le suivi de trajectoire des axones des interneurones spinaux dorsaux au début embryon de poulet 7-9. Dans le manuscrit actuel, nous avons ciblé le cerveau postérieur et amélioré le paradigme expérimental pour l&#39;étiquetage fin des interneurones du cerveau postérieur embryonnaire, les axones et leurs cibles synaptiques, en utilisant une stratégie d&#39;électroporation modifié et le PiggyBac - transposition de l&#39;ADN induite. Notre nouvelle stratégie permet le marquage des sous-types neuronaux distincts dans un côté du cerveau postérieur et le suivi de leurs projections axonales et les sites synaptiques à différents stades embryonnaires, à partir de 2 jusqu&#39;à 12 jours après l&#39;électroporation. Sur la base de cette méthode, nous avons appelé la dorsale la plus sous-groupe des interneurones du cerveau postérieur (dA1/Atoh1 + </s&gt; Suivi des cellules) et révélé deux modèles de projections axonales ascendantes controlatéral, chacun vient d&#39;un endroit et s&#39;allonge AP différent dans un funiculus distinct. dA1 axones ont été trouvés à projet et le formulaire synapses dans les noyaux auditifs, le mésencéphale et dans de multiples couches du cervelet 10. La combinaison de poussin électroporation, génétique traçage des neurones et analyse des sites de projection à bien des stades avancés de développement fournit une plate-forme unique d&#39;étudier la formation des réseaux neuronaux dans le cerveau et à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des circuits.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l&#39;expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d&#39;électroporation d&#39;ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu&#39;à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox - Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l&#39;expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d&#39;intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.

Ce protocole a été récemment utilisée pour découvrir les modèles axonales et les sites de projection de dA1 sous-groupe des interneurones dans le cerveau postérieur poussin 10. Pour étiqueter spécifiquement ces axones, un élément activateur (Atoh1), qui a déjà été qualifiée de spécifique pour la colonne vertébrale EL1 neurones 8,12,13, a été confirmée à exprimer en dA1 cellules cerveau postérieur 10. L&#39;élément a été cloné en amont de la recombinase Cre et ...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d&#39;électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K vues.  The Hebrew University of Jerusalem. Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents st...

Vidéo: Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Recherche

Neurosciences

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Production d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...