Nous remercions Homaira Nawabi, Frederic Moret et Isabelle Sanyas pour leur aide. Ces travaux sont soutenus par le CNRS, Association Française contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA à V.C. ; C.D-B et A.J sont soutenus respectivement par les bourses De la Ligue contre le cancer et du Labex DevWeCan.

1. Stratégie de clonage pour marquer le récepteur PlexinA1 avec pHluorin
<ol><li>Choisissez un vecteur d’expression approprié comme épine dorsale(par exemple, le vecteur exprimant le récepteur de la souris plexineA1, un don gentil du Dr Andreas Puschel11). Remarque: Ce vecteur plexinA1 a été conçu pour réaliser l’insertion efficace de récepteur HA- ou VSV-marqué dans la membrane plasmique.</li>
	<li>Amplifier par PCR la séquence codante de la pHluorine écliptique en utilisant le plasmide adéquat comme modèle(par exemple, le récepteur GABA A marqué par la pHluorine, un don du Dr Jacob2). Si nécessaire, ajoutez un site de restriction à l’extrémité 5' de l’amorce afin de faciliter l’étape de clonage dans l’épine dorsale principale.</li>
	<li>Insérez la séquence pHluorine dans le cadre entre le peptide signal et la séquence codante du récepteur à l’aide de sites de restriction(par exemple les sites de restriction NruI/Kpn2I comme décrit à la figure 1B). Remarque: Parce que le peptide signal qui assure le ciblage correct des récepteurs est clivé, le pHluorin doit être placé après elle. Ceci justifie la reconnaissance du peptide signal et empêche le clivage du pHluorin du récepteur d’intérêt.</li>
	<li>Séquencez les constructions obtenues pour s’assurer qu’aucune mutation n’a été introduite par PCR.</li>
</ol>2. Caractérisation in vitro du récepteur marqué par la pHluorine dans les cellules COS7
La capacité de la protéine de fusion à atteindre la membrane plasmique et sa perte réversible de fluorescence à mesure que le pH est abaissé peuvent être confirmées à l’aide de la procédure suivante.
<ol><li>Jour 1. Plaquez 1,5 x 105 cellules COS7 dans un plat de 35 mm à fond de verre dans 2 ml de milieu Eagle modifié complet de Dulbecco (DMEM - 10 % sérum fœtal bovin - 1 mM de pyruvate de sodium - 25 U/ml pénicilline/stretomycine - 2,5 μg/ml d’amphotéricine B - pH 7,4).</li>
	<li>Jour 2. Cellules transfectées : Remarque: Les cellules doivent être confluentes à 70-80%.<ol>
<li>Préparer 200 μl de NaCl 150 mM et ajouter 3 μg d’ADN, c’est-à-dire le vecteur codant pour le récepteur marqué par la pHluorine. Vortex doucement et tournez brièvement vers le bas. Remarque : Une carte du vecteur pHluorin-plexinA1 utilisé dans ces expériences est illustrée à la figure 1B.</li>
		<li>Ajouter 10 μl de réactif de transfection (ou la quantité appropriée du réactif utilisé). Vortex immédiatement.</li>
		<li>Incuber 10 min à TA.</li>
		<li>Ajouter 200 μl du mélange réactif de transfection/ADN aux cellules.</li>
		<li>Déplacez doucement la plaque pour obtenir le repartition du mélange et replacez les cellules dans l’incubateur à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3. Retirez le milieu de transfection et remplacez-le par 2 ml de DMEM complet frais.</li>
	<li>Jour 4. Effectuer l’imagerie cellulaire en direct des cellules transfectées COS7 pHluorin-plexineA1:<ol>
<li>Préparer deux aliquotes de milieu complet DMEM et ajuster le pH à 3,5 et à 9,5, respectivement. Remarque: Pour une plaque de 35 mm, 1,5 ml de chaque solution est nécessaire pour effectuer l’expérience.</li>
		<li>Retirez le milieu cellulaire et remplacez-le par 1 ml de DMEM complet milieu pH 7,4.</li>
		<li>Préparez une seringue de 5 ml avec un type approprié de tube afin d’injecter divers composants directement dans le milieu de culture cellulaire sans ouvrir la chambre du microscope.</li>
		<li>Utilisez un module qui permet le maintien d’une atmosphère de travail humide à 37 °C, 5 % deCO2. Remarque : Une autre approche de l’utilisation d’une chambre à CO2 consiste à utiliser un milieu tamponné hepes (généralement de l’ordre de 10 à 25 mM selon le type de cellule).</li>
		<li>Placez les cellules dans la chambre et ajustez le tube et la seringue. Remarque : Le microscope doit être équilibré avant de commencer à éviter la dérive mécanique pendant l’enregistrement.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie et sélectionnez le programme d’acquisition multidimensionnel.</li>
		<li>Trouvez des cellules COS7 transfectées avec l’objectif 40X et marquez la position dans le logiciel pour chacune d’elles.</li>
		<li>Configurez la pile Z afin d’avoir une acquisition de profondeur de 15 μm (la mise au point peut changer lors de l’ajout de média dans la plaque).</li>
		<li>Définissez l’exposition pour le filtre GFP et la phase.</li>
		<li>Configurez le calendrier d’acquisition. Note: Pour l’ensemble de l’expérience avec 5 champs d’intérêt, l’acquisition toutes les 20 secondes pendant 10 min devrait être suffisante.</li>
		<li>Commencez l’acquisition et prenez 5 images de contrôle dans un milieu DMEM pH 7,4.</li>
		<li>Suspendre l’acquisition, injecter 1,25 ml de PH 3,5 DMEM complet pour atteindre un pH de 5,5 dans le milieu de culture, marquer l’événement dans le logiciel et reprendre l’acquisition pour 5 points de temps supplémentaires. Remarque: La fluorescence verte devrait progressivement disparaître.</li>
		<li>Suspendre l’acquisition, injecter 1,2 ml de PH 9,5 DMEM complet pour atteindre un pH 7,4 dans le milieu de culture, marquer l’événement dans le logiciel et reprendre l’acquisition pour 5 points de temps supplémentaires. Remarque: La fluorescence verte devrait réapparaître au niveau de la membrane plasmique.</li>
		<li>Analyser les images. La figure 2 montre des images représentatives obtenues avec un tel protocole avec la construction pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In ovo Electroporation de pHluorin-plexinA1 Construire
<ol><li>Manipulation des oeufs avant électroporation:<ol>
<li>Conservez les œufs fécondés au réfrigérateur à 14 °C jusqu’à une semaine avant l’incubation.</li>
		<li>Incuber les œufs à 38,5 °C (101,3 °F) dans un incubateur avec une humidité saturée pendant 50-52 heures jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade HH1412. Remarque: Les œufs doivent être placés horizontalement pendant l’incubation afin que l’embryon soit correctement positionné pour l’électroporation, flottant sur le dessus du jaune. Le stade HH14 convient pour obtenir l’expression des plasmides dans les neurones différenciés de la moelle épinière et dans le ganglion de la racine dorsale avec un taux de survie approprié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embryons électroporates8-10:<ol>
<li>Préparer l’électroporation:<ol>
<li>Préparer des plasmides d’ADN sans endotoxine avec une concentration supérieure à 2 μg/μl, pour pouvoir le diluer comme concentration désirée.</li>
			<li>Tirez suffisamment de capillaires en verre pour injecter les différentes solutions d’ADN.</li>
			<li>Préparer du PBS stérile(-Ca2+;-Mg2+) - 100 U/ml de pénicilline/streptomycine et équilibrer à 38,5 °C.</li>
			<li>Stérilisez le capot, les ciseaux incurvés et les pinces fines.</li>
			<li>Contrôlez l’espacement des électrodes. Remarque: Un espace de 4 mm entre les électrodes est généralement utilisé.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fenêtre de l’œuf13 (figure 3A):<ol>
<li>Utilisez des ciseaux incurvés pour percer la coquille sur le côté émoussé de l’œuf.</li>
			<li>Retirer 2 ml d’albumine à l’aide d’une aiguille de 0,9 mm x 25 mm et d’une seringue de 5 ml. Orientez l’aiguille verticalement afin d’éviter d’endommager le sac vitellin.</li>
			<li>Couvrez le dessus de l’œuf avec du ruban adhésif pour maintenir l’intégrité de la coquille.</li>
			<li>À l’aide de ciseaux incurvés, percez la coquille au milieu du ruban adhésif pour égaliser la pression lors du retrait de 2 ml d’albumine de l’œuf. Ensuite, coupez une fenêtre assez grande pour visualiser l’embryon et pouvoir travailler dessus.</li>
			<li>Ajouter ~2 ml de PBS chaud stérile(-Ca2+;-Mg2+)- 100 U/ml de pénicilline/streptomycine pour éviter la déshydratation de l’embryon et le rendre plus accessible au manipulateur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Injecter de l’ADN et électroporater l’embryon<ol>
<li>Diluer le plasmide dans le PBS(-Ca2+;-Mg2+) à une concentration comprise entre 0,5 et 2 μg/μl et ajouter le colorant vert rapide pour atteindre une concentration finale de 0,025 %. Chargez le mélange d’ADN dans un capillaire. L’utilisation d’un injecteur est recommandée. Remarque : Vérifiez que la résistance capillaire n’est ni trop grande (ce qui signifie qu’il pourrait y avoir des difficultés lors de l’injection d’embryons) ni trop petite (ce qui signifie que le capillaire pourrait être trop gros et pourrait endommager l’embryon). De plus, une concentration d’acides nucléiques supérieure à 2 μg/μl peut causer des effets non spécifiques et doit être contrôlée.</li>
			<li>Percer le sac vitellin et le tube neural du côté caudal avec le capillaire chargé. Entrez dans le tube neural avec un angle peu profond et remplissez la lumière de la queue à la tête avec le mélange d’ADN (Figure 3B). Remarque: Le vert rapide permet de contrôler la précision de l’injection.</li>
			<li>Placez rapidement les électrodes de platine de 4 mm de chaque côté du tube neural au niveau que vous souhaitez électroporater et appliquez 3 impulsions à 31 V pendant 50 ms avec des intervalles de 500 ms(Figure 3C). Remarque : Évitez de placer les électrodes sur le cœur ou sur de gros vaisseaux embryonnaires supplémentaires pour éviter d’endommager l’embryon en développement. Des bulles devraient se former sur les électrodes.</li>
			<li>Avec l’aiguille, retirez 2 ml d’albumen pour diminuer le niveau dans la coquille.</li>
			<li>Scellez la fenêtre et le côté émoussé hermétiquement avec du ruban adhésif.</li>
			<li>Remettez les œufs à 38,5 °C dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade souhaité.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Incorporation et cryosection d’embryons
<ol><li>48 heures après l’électroporation, prélever soigneusement des embryons électroporés (stade HH24). Couper le ruban adhésif et la moitié de la membrane chorioallantoïde. Pour empêcher les embryons de s’enfoncer dans le jaune, placez une passoire sous l’embryon et coupez la seconde moitié de la membrane chorioallantoïde.</li>
	<li>Transférer l’embryon dans une parabole de dissection remplie de PBS glacé.</li>
	<li>Vérifiez l’efficacité de l’électroporation en recherchant la fluorescence dans le tube neural avec un stéréomicroscope à fluorescence. Note : La coélectroporation d’un plasmide témoin codant pour la RFP peut aider à visualiser la zone électroporée.</li>
	<li>Disséquer les embryons à l’aide d’un microscalpel afin de sélectionner la zone électroporée de la moelle épinière.</li>
	<li>Transférer les embryons disséqués sur une plaque de 24 puits et fixer dans un pH de 7,4 4 % de paraformaldéhyde (PFA) - tampon phosphate salin (PBS), O/N à 4 °C. Remarque: L’étape de fixation est cruciale pour permettre la stabilisation de la pHluorine dans sa conformation « vivante » et ainsi pouvoir utiliser la pHluorine dans les tissus fixes / perméabilisés. Bien que la fixation ralentisse considérablement le changement pH-dépendant de la fluorescence, il faut prendre en compte que les changements conformationnels/protonationnels peuvent encore se produire après fixation. Ainsi, le protocole suivant (incorporation, cryosections et observation) doit être réalisé dans les 3 jours suivant l’étape de fixation, avec tous les tampons à pH 7. Si la fixation n’est pas nécessaire, il est recommandé d’effectuer une observation sur les sections de tissus vivants.</li>
	<li>Enlever 4 % de PFA et laver les embryons à un pH de 7,4 PBS.</li>
	<li>Incuber les embryons dans du saccharose PBS-15 % et les conserver à 4 °C jusqu’à ce que les embryons coulent.</li>
	<li>Incuber des embryons fixes dans un pH de 7,4 gélatine à 7,5 % et 15 % de saccharose pendant 45 min à 37 °C afin que les embryons soient complètement incorporés.</li>
	<li>Placez des moules d’encastrement sur de la glace et ajoutez 400 μl de pH 7,4 gélatine à 7,5% et 15% de saccharose pour obtenir une base solide de 2 mm.</li>
	<li>Aspirer l’embryon incorporé avec une pointe coupée et placer l’embryon sur la base de gélatine solide.</li>
	<li>Couvrir avec un pH de 7,4 gélatine à 7,5% et 15% de saccharose et positionner l’embryon avec une pince avant que la gélatine ne se solidifie.</li>
	<li>Une fois que la gélatine est solide, préparez un bain d’isopropanol à -40 °C (utilisez de la glace carbonique ou de l’azote liquide) et congelez le bloc de gélatine pendant 5 min.</li>
	<li>Gardez les blocs congelés à -80 °C.</li>
	<li>Placer le bloc congelé à -20 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Retirez le moule et fixez le bloc sur un mandrin avec un milieu de polyéthylène glycol.</li>
	<li>Une fois que le bloc est bien fixé, placez le mandrin dans le système cryostat. Remarque : Utilisez des lames enrobées pour éviter la perte de tissu pendant la coloration.</li>
	<li>Effectuer des cryosections en série (des cryosections de 20 μm sont habituellement effectuées).</li>
	<li>Laisser sécher les cryosections pendant 15 min à TA. Remarque: des cryosections devraient être protégées contre l’exposition inutile à la lumière afin d’éviter le blanchiment de la fluorescence de GFP.</li>
</ol>5. Analyse microscopique des cryosections
<ol><li>Réhydratez les cryosections dans le pH 7,4 PBS à droite pendant 10 minutes. Remarque: Si nécessaire, les noyaux peuvent être colorés avec Hoechst.</li>
	<li>Utiliser une solution de Hoechst à 0,5 μg/ml dans du PBS et incuber des cryosections pendant 15 min.</li>
	<li>Rincer les lames 3x avec un pH 7,4 PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Passez au montage par glissement. Une solution de montage d’alcool polyvinylique à pH 7,4 (ou plus basique) qui durcit O/N peut être utilisée : positionner soigneusement la lame de couverture pour éviter la formation de bulles d’air entre la lame et la lame de couverture.</li>
	<li>Laisser le milieu de montage durcir O/N à 4 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Utilisez un microscope confocal inversé pour visualiser avec précision la protéine de fusion pHluorin-plexineA1 : effectuez une z-stack à la résolution optimale du trou d’épingle et optique et utilisez des lentilles 20X (NA 0,75) ou 40X (NA 1,3). Remarque : La pHluorine est détectable avec les mêmes paramètres que ceux utilisés pour détecter la GFP(c.-à-d. le pic d’émission à 509 nm). Les paramètres d’excitation et de filtre de détection de longueur d’onde sont définis de manière optimale par le logiciel d’imagerie. Hoechst est détecté entre 425-460 nm (l’excitation est à 405 nm), GFP ou pHluorin est détecté entre 485-545 nm (excitation est à 473 nm) et RFP est détecté entre 575-675 nm (excitation est à 559 nm).</li>
</ol>Des images représentatives de l’expression de la pHluorine-plexineA1 et de l’eGFP dans la moelle épinière de l’embryon de poussin sont illustrées à la figure 4.

<ol>
	<li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+guidance+receptors.">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour suivre la dynamique d’un récepteur de guidage axone à la fois dans la culture cellulaire et dans le contexte développemental de la moelle épinière de l’embryon de poussin.
Pour concevoir une protéine marquée par la pHluorine de novo, deux points doivent être pris en compte concernant la stratégie de clonage. Tout d’abord, la balise de pHluorin devrait être exposée à la lumière des endosomes acides, et par co...

Lors de leur navigation, les axones intègrent de multiples indices environnementaux qui les guident vers leur cible. Ces signaux activent les récepteurs de guidage à la surface des bornes axoniques, les cônes de croissance, qui à leur tour initient une voie de signalisation appropriée. Ainsi, la régulation temporelle et spatiale de la distribution de surface cellulaire des récepteurs est essentielle pour définir la sensibilité du cône de croissance1. Dans ce contexte, le croisement de la ligne médiane par les axones commissuraux est un excellent modèle pour étudier la régulation des niveaux de surface des cellules réceptrices. Dans la moelle épinière en développement, les axones commissuraux sont initialement attirés vers la plaque ventrale du plancher où ils traversent la ligne médiane. Après la traversée, ils perdent leur réactivité aux attractifs de la plaque de plancher et gagnent en réponse aux répulsifs de plaque de plancher afin qu’ils puissent sortir de la plaque de plancher et naviguer vers leur destination finale dans le côté controlatéral du système nerveux2,3. La régulation de la disponibilité des récepteurs à la surface du cône de croissance est l’un des mécanismes sous-jacents au changement de réactivité aux signaux médians4,5. Ainsi, la surveillance sélective des récepteurs présents à la membrane plasmique des cônes de croissance est d’une importance primordiale. Nous décrivons ici une méthode basée sur la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour visualiser spécifiquement les récepteurs de guidage axonaux qui sont adressés à la membrane plasmique in vitro et in vivo,dans la moelle épinière de poussin en développement.
Rothman et ses collègues ont conçu par des mutations ponctuelles des variantes sensibles au pH de la GFP, y compris le pHluorin écliptique6. Le pHluorin écliptique a la propriété d’être non fluorescent lorsqu’il est exposé à un pH acide (<6), tout en étant fluorescent à pH neutre. Cela permet de distinguer les récepteurs non fluorescents localisés dans les compartiments acides intracellulaires(c’est-à-dire endosomes, vésicules de trafic) des récepteurs fluorescents incorporés à la membrane plasmique et donc exposés au pH neutre extracellulaire7. Nous en avons profité pour surveiller la localisation de la membrane plasmique de la plexineA1, un récepteur de guidage axone médiant la réponse du cône de croissance à la sémaphorine répulsifique médiane 3B5 (figure 1A). Nous décrivons ici la caractérisation in vitro d’une construction pHluorin-plexinA1, avec l’électroporation8-10 in ovo de cette construction dans la moelle épinière de poussin se développante suivie de l’analyse microscopique des cryosections qui permettent de suivre la dynamique de récepteur de guidage d’axone in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Au cours du développement, les récepteurs de guidage axonaux jouent un rôle crucial dans la régulation de la sensibilité des axones aux signaux attrayants et répulsifs. En effet, l’activation des récepteurs de guidage est la première étape des mécanismes de signalisation permettant aux pointes axoniques, les cônes de croissance, de répondre aux ligands. En tant que tel, la modulation de leur disponibilité à la surface de la cellule est l’un des mécanismes qui participent à la définition de la sensibilité du cône de croissance. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser avec précision la dynamique de surface spatio-temporelle de cellules d’un récepteur de guidage axone in vitro et in vivo dans la moelle épinière de poussin en développement. Nous avons tiré parti de la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour détecter spécifiquement la fraction du récepteur de guidage axone qui est adressée à la membrane plasmique. Nous décrivons d’abord la validation in vitro de telles constructions pH-dépendantes et nous détaillons plus loin leur utilisation in vivo,dans la moelle épinière de poussin, pour évaluer la dynamique spatio-temporelle du récepteur axon de guidage d’intérêt.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Figure 1. A. Schéma des propriétés de fluorescence de la pHluorine-plexineA1 dans un contexte cellulaire. La pHluorine est non fluorescente dans les compartiments intracellulaires où le pH est acide (<6) comme dans les vésicules en trafic ou dans les endosomes et est fluorescente lorsqu’elle est expos...

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Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K vues.  University of Lyon. Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Vidéo: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recherche

Neurosciences

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...