Nous remercions Emily A. Kelly pour la conception de la plaque la tête. Nous sommes reconnaissants pour le soutien de subventions des NIH pour HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 et le soutien généreux du Fonds de Geoffrey Waasdorp neurologie pédiatrique, sans lequel ce travail n&#39;aurait pas été possible. AKM est financé par le NIH (EY019277), Whitehall Foundation, la Fondation Alfred P. Sloan et une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l&#39;Burroughs Wellcome Fund. MET est financé par un Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) de bourses de formation postdoctorale. DFM est un stagiaire du Programme de formation scientifique médical, financé par le NIH T32 et T32 GM07356 AI049815.

1. Préparer l&#39;animal pour l&#39;imagerie <ol><li> Dans nos expériences, nous utilisons les adultes CX 3 CR 1 souris GFP / + qui expriment la GFP dans des lignées de cellules mononucléaires, y compris les microglies. 4 différentes souches de souris peut être utilisée pour répondre aux besoins d&#39;un projet spécifique. </li><li> Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale d&#39;un cocktail de trois médicaments comprenant de 0,05 mg / kg de fentanyl, 5,0 mg / kg de midazolam, et 0,5 mg / kg médétomidine. 5 préparation chirurgicale pour TSCW commence après que l&#39;animal ne réagit plus aux stimuli douloureux, comme comme un pincement de la queue. Tout au long de la chirurgie et l&#39;imagerie, nous gardons l&#39;animal sur un coussin chauffant pour éviter l&#39;hypothermie post-anesthésie. Si nécessaire, une dose de rappel d&#39;un tiers de la dose initiale du cocktail anesthésiant peut être donnée pour restaurer le plan d&#39;origine anesthésique. </li><li> Couvrir les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique de protection de garder les yeux humides pendant l&#39;anesthésie, ce qui supprime réflexe de clignement de l&#39;animal. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;un rasoir, ciseaux, les ciseaux, ou des méthodes chimiques. Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone iodée solution et 70% d&#39;éthanol. Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés, stérilisés avec un stérilisateur perles de verre, ou désinfectée avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Faire une incision médiane du cuir chevelu à l&#39;aide de petits ciseaux, en commençant 4-5 mm caudale du crâne et de faire progresser vers l&#39;avant à l&#39;avant des yeux. Il est important que cette incision être suffisamment long pour que la peau ne pas interférer avec le collage de la plaque de tête qui est utilisée pour stabiliser la tête de la souris pendant deux photons d&#39;imagerie (figure 1). Identifier la zone à être éclaircis sous un microscope à dissection. Éviter les zones d&#39;intérêt directement situé sur les sutures crâniennes, que le crâne est moins stable dans ces domaines et sous-jacente de grands navires et les méninges vont interférer avec l&#39;imagerie. </li><li> Appliquer l&#39;éthanol à 100%, suivi par solution à 10% de chlorure ferrique avec un coton tige stérile pour sécher les membranes sur le dessus du crâne et les gratter avec une pince fine ou une lame de rasoir. Le défaut de supprimer les résultats des membranes dans l&#39;attachement tête de plaque instable. </li><li> Placez une fine couche de colle à l&#39;Permabond 910 sur les bords de la fenêtre de visualisation sous la plaque la tête. Placer la plaque de tête enduite de colle sur la zone d&#39;intérêt sur le crâne de l&#39;animal avec une légère pression (figure 1). Il est important que la plaque de tête est seulement collé à l&#39;os du crâne. Toute la peau ou des membranes qui sont coincés entre la plaque de tête et le crâne va diminuer la stabilité de la liaison. Appliquez une petite quantité d&#39;acrylate autour de la fenêtre de visualisation utilisant une seringue pour instantanément obligataires de la colle. Enfin, appliquez une petite quantité de Loctite 454 sur les bords de la fenêtre de visualisation pour éviter les fuites. </li><li> Vissez la plaque de tête au détenteur des animaux (figure 1) et vérifier la stabilité de la plaque de tête sous un champ de dissection par une légère sondage avec une paire de pinces. Il devrait y avoir aucun mouvement du crâne par rapport à la plaque de tête. Déposer une goutte de solution saline sur la fenêtre de visualisation pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas de fuites. </li></ol> 2. Préparation de la Fenêtre Crâne Diluée corticale <ol><li> En préparation pour fluidifier le crâne, le crâne sec en utilisant une combinaison de coton-tiges stériles et d&#39;air comprimé. Nous avons d&#39;abord éclaircir le crâne avec un peu stérile, l&#39;IRF forage de 007 dans une perceuse Microtorque II a fixé à 4000 rpm. Très doucement, commencer amincissement une zone de 2 à 2,5 mm de diamètre circulaire du crâne. Utilisez uniquement des mouvements de balayage de lumière presque parallèle au crâne; ne pas utiliser une pression directe vers le bas. Arrêter le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d&#39;os à l&#39;aide de l&#39;air comprimé. Ces ruptures dans le forage permettent le crâne pour se rafraîchir il n&#39;ya donc pas de dommages induits par la chaleur dans le tissu cérébral sous-jacent. <ol class="lalpha"><li> Comme le forage progresse, l&#39;avis de la transition vers la couche d&#39;os spongieux humides (ie le &quot;diploé&quot;). Une fois cette couche est atteinte, faire preuve de prudence supplémentaire avec la perceuse. </li></ol></li><li> Vérifiez occasionnellement la minceur du crâne en plaçant une solution saline au cours de la zone amincie et la visualisation sous le microscope à dissection. Saline permettra en outre la dissipation thermique. Comme le crâne est aminci, les petits vaisseaux sanguins deviennent visibles. </li><li> Utilisez un microlames stériles dentaire pour atteindre la finale d&#39;éclaircie dans une solution saline, comme le microlames fournit une rétroaction beaucoup plus tactile sur la stabilité du crâne. Cela permet des préparations beaucoup plus mince que le forage seul. De notre expérience, l&#39;épaisseur du crâne optimale est de 10-30 um. <ol class="lalpha"><li> Il est important de vérifier la minceur du crâne sous épifluorescence plusieurs fois pendant les premières tentatives à faire quelques une fenêtre du crâne minces. La netteté et la profondeur de la microglie et les vaisseaux visibles donnent une bonne indication quant au moment où la fenêtre est prêt pour l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Une fois la fenêtre est prêt, coller un morceau sur-mesure rectangulaire de # 0 lamelle wi<html> e une dimension de moins de 2 mm de chaque côté sur la fenêtre. Avec une pipette de 1,0 mm de diamètre en verre, placer une petite goutte de colle cyanoacrylate sur la zone du crâne aminci et soigneusement bas le petit morceau de lamelle, puis appuyez doucement sur le crâne pour faire sortir l&#39;excédent de la colle. Il est important d&#39;éviter la formation de bulles entre le verre et la colle car l&#39;air piégé va provoquer la zone sous pour devenir opaques. La colle cyanoacrylate est utilisé parce qu&#39;il reste transparent lorsqu&#39;il est sec et empêche également les os et repousse la membrane gardant le crâne sous la fenêtre mince et translucide. S&#39;il n&#39;y a pas de colle sur le dessus du couvercle en verre, utilisez la microlames soigneusement enlever une fois le couvercle en verre est en place et la colle est sèche. </li><li> Un analgésique (par exemple, buprénorphine 2 mg / kg sous-cutanée) est administré immédiatement après la chirurgie et ré-administrées à tout signe de douleur, notamment la réticence à se déplacer, manger ou boire, perte de poids, la salivation, horripilation, bruits respiratoires, etc </li></ol> 3. Deux photons d&#39;imagerie <ol><li> En préparation pour l&#39;imagerie à deux photons, couvrir les TSCW avec une solution saline et de localiser la zone d&#39;intérêt sous épifluorescence (Figure 2). Afin de permettre l&#39;imagerie ultérieure de la zone, prendre une photo en utilisant un appareil photographique. </li><li> Pour l&#39;imagerie à deux photons, nous utilisons une mesure faite microscope à deux photons 6 avec un Ti: Sapphire laser accordé à 920 nm. La fluorescence est détectée en utilisant un tube photomultiplicateur en mode de détection tout-terrain et un filtre d&#39;émission 580/180. Une immersion dans l&#39;eau 20X optique (0,95 NA) est utilisé tout au long de la séance d&#39;imagerie. La puissance maximale de la puissance du laser à l&#39;objectif est fixé entre 50 et 65 mW. </li><li> Sélectionnez un domaine d&#39;intérêt dans les couches corticales I ou II (jusqu&#39;à 150 um dessous de la surface piales). Afin de faciliter la ré-imagerie, de prendre des photos d&#39;un même champ de vue à 1x, 2x et zoom numérique 3X. Les vaisseaux sanguins peuvent servir de repères pour trouver facilement le même champ de vision durant les séances d&#39;imagerie ultérieurs. En vertu d&#39;un zoom de 3x, plusieurs z-piles avec 80-90 Z-étapes dans chaque pile et une étape 0,69 um peuvent être acquis toutes les 5 minutes pendant 30 minutes, ce qui permet un bon échantillonnage de la morphologie de la microglie et les comportements au fil du temps ( Figure 3). Entre acquisitions de z-piles, on devrait vérifier le niveau de solution saline au cours de la TSCW, ainsi que la profondeur de l&#39;animal de l&#39;anesthésie. </li></ol> 4. L&#39;injection de la neurotoxine VIH-1, Tat <ol><li> Tout d&#39;abord, silaniser la doublure intérieure d&#39;une aiguille de calibre 35 et une seringue de 10 uL microvolume pour éviter le dépôt de Tat. Retirer la solution de silanisation (Sigmacote) jusqu&#39;à ce qu&#39;elle remplisse les deux aiguilles et de seringues. Laisser la solution reposer pendant 5 minutes à température ambiante. Videz la solution de la seringue, retirez le piston, et permettre à la seringue et l&#39;aiguille de sécher complètement. Enfin, laver la seringue et l&#39;aiguille avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Effectuer une craniotomie petite 0,5 mm de diamètre, soit 3 mm rostrale ou latérales au TSCW où deux photons images ont été obtenues en utilisant un peu plus petit foret et soin amincissant le crâne jusqu&#39;à une paire de pinces avec des conseils pointus peuvent enlever la couche amincie de osseux détache facilement. Nous utilisons une seringue de 10 uL microvolume équipé d&#39;une aiguille de calibre 35 commandé par une pompe seringue Ultramicropump III monté sur un micromanipulateur 3-axes et après alignant l&#39;aiguille de la craniotomie, il est soigneusement avancés à une profondeur de 700 à 900 um ci-dessous la surface piales où 3 uL Tat 1-72 (ou d&#39;autres agents pro-inflammatoires) ou une solution saline (ou d&#39;un véhicule de contrôle) est livrée à 80 Nl / min. </li></ol> 5. Logement des animaux <ol><li> Si l&#39;animal est à imager plusieurs fois en une seule journée, couvrir la zone ouverte du crâne avec un mélange de pommade ophtalmique et de la vaseline pour éviter la gêne ou de dommages au crâne entre les séances d&#39;imagerie. Débranchez le pont le soutien de la tête petite plaque (voir figure 1B) et placer l&#39;animal dans une cage réchauffé avec de la nourriture facilement accessible et l&#39;eau. Tous les animaux doivent être logés séparément après la chirurgie, à tout moment. Une fois les séances d&#39;imagerie pour un animal sont complets pour un jour donné, retirez soigneusement toute la tête de plaque et suture la peau du dos sur le crâne avec des n ° 6 ou plus petits de suture. Encore une fois, la maison des animaux individuellement avec de la nourriture facilement accessible et l&#39;eau entre les jours d&#39;expérimentation. Vérifiez les animaux tous les jours pour des signes de stress, la douleur, ou une infection. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Stabilisation de l&#39;animal pour la chirurgie et l&#39;imagerie à deux photons (A) et la conception de plaque de tête (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. GFP-étiquetée microglie visualisées avec épifluorescence. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. GFP-étiquetée microglie visualisées avec l&#39;imagerie à deux photons après l&#39;implantation de l&#39;TSCW, environ 50 um dessous de la surface piales. La seule à deux photons sections prises 15-30 minutes après l&#39;implantation de l&#39;TSCW (jour 0), ainsi que 7 et 17 jours plus tard, de démontrer que les fenêtres tout reste clair microglie reste inactivé en l&#39;absence d&#39;insultes inflammatoires. Le Z-projections prises 6 et 24 heures après l&#39;injection du VIH neurotoxine tat impressionnante exposition des changements morphologiques des cellules microgliales activées. Barre d&#39;échelle: 10 um.

<ol>
	<li>Mostany, R., &amp;amp, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., &amp;amp, Y. u. s. t. e., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li><li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system.">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li><li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp;amp, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia.">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li><li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp;amp, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders.">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li><li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp;amp, U. p. e. n. d. e. r., B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder.">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li><li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp;amp, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain:+correlations+with+dementia.">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li></ol>

Il ya un consensus croissant que le substrat réel pour le VIH-1 déficits neurocognitifs associés (MAIN) est la destruction de l&#39;architecture synaptique, probablement causée par médiateurs pro-inflammatoires libérés de VIH-1 phagocytes mononucléaires. L&#39;activation microgliale, des cellules géantes multinucléées, et gliose due à une hypertrophie astrocytaire sont considérés comme caractéristiques non spécifiques du VIH-1 infection et l&#39;inflammation dans les 7 SNC. En revanche, la sévérité de la maladie neurologique premortem a été corrélée à la perte de la complexité synaptique, ainsi que le fardeau des macrophages dans le SNC 8,9,10,11. Cependant, les interactions dynamiques entre la microglie, les macrophages infiltrant périphériques, et les neurones chez les patients atteints MAIN tout simplement ne peuvent pas être modélisés à l&#39;aide conventionnelle de traitement statique obtenue à partir d&#39;études conventionnelles immunocytochimiques. Des études récentes de nos laboratoires ont suggéré qu&#39;au moins certaines de ces interactions entre les périphériques et centraux des cellules mononucléées et les neurones peuvent être modélisés en partie par injection stéréotaxique de la pandémie du VIH-1 dans la protéine Tat 1-72 parenchyme cérébral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, et Gelbard, données non publiées). Nous avons donc décidé d&#39;appliquer in vivo deux imagerie photonique afin d&#39;examiner l&#39;interaction entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones, dans un modèle de petit animal docile pour NeuroSIDA. Alors que les préparatifs en plein crâne ou éclaircis-crâne se permettre un examen unique de l&#39;architecture corticale pendant une brève période de temps (heures), les enquêteurs s&#39;intéressent à l&#39;évolution temporelle des évènements subaiguë pouvez pas utiliser ces préparations sans artifactually activation des microglies / macrophages due à la manipulation chirurgicale de la la fenêtre crânienne. Ici nous démontrons une manière simple de contourner ces limites en collant un petit morceau de lamelle de verre sur la zone du crâne aminci la prévention de la calotte crânienne de se régénérer dans le TSCW ainsi que le maintien de translucidité pour ≥ 3 semaines. Nous avons également démontré que cette technique nous permet de surveiller le comportement des monocytes périphériques entrer microvascularisation cérébrale ainsi que le cerveau-résident microglie en réaction à l&#39;injection stéréotaxique du VIH Tat 1-72 dans le cortex de souris hétérozygotes pour CX 3 CR 1 / GFP ( pour identifier les cellules mononucléées de la lignée). Cette technique peut être facilement adaptée à une utilisation sur des souris avec différentes origines génétiques, par exemple, nous utilisent couramment hétérozygote CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 souris pour étudier les interactions entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones modèles in vivo de la neuroinflammation pertinentes à la main. Notre préparation TSCW permet aux enquêteurs de l&#39;étude des interactions cellule-cellule entre la périphérie et du SNC qui peuvent survenir sur des périodes de plusieurs semaines, dans lequel l&#39;animal peut être à plusieurs reprises d&#39;image avant et après le traitement expérimental. Ainsi, chaque animal peut servir de son propre contrôle. Une mise en garde pour ce modèle TSCW est que les cellules cibles à l&#39;étude doivent être soit génétiquement pour exprimer des protéines fluorescentes améliorée (eXFP) ou être étiquetés avec un colorant fluorescent, sans rupture mécanique de la calotte crânienne, et que l&#39;expression eXFP doit être suffisamment robuste pour permettent architecture cellulaire pour être visualisées après les séances d&#39;imagerie répétés sur une période de plusieurs semaines.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

Traditionnellement, dans les neurosciences, l&#39;imagerie in vivo deux photons du système nerveux central murin a soit impliqué l&#39;utilisation d&#39;open-crâne 1,2 ou amincie crâne 3 préparations. Alors que la technique du crâne ouvert est très polyvalent, il n&#39;est pas optimal pour l&#39;étude de la microglie, car elle est invasive et peut provoquer l&#39;activation microgliale. Même si l&#39;approche éclaircis-crâne est peu invasive, le re-répété amincissement du crâne requises pour l&#39;imagerie chronique augmente les risques de lésion des tissus et l&#39;activation de la microglie et permet à un nombre limité de séances d&#39;imagerie. Nous présentons ici une méthode window chroniques mince crâne pour le suivi des microglies murins in vivo sur une période prolongée de temps en utilisant microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une société stable, accessible, amincie crâne fenêtre corticale (TSCW) avec une lamelle de verre revêtue de ce qui reste translucide sur le cours de trois semaines d&#39;observation intermittente. Cette préparation est beaucoup plus TSCW immunologiquement inertes à l&#39;égard de l&#39;activation microgliale que craniotomie ouverte ou le crâne répétées amincissement et permet un nombre arbitraire de sessions d&#39;imagerie au cours d&#39;une période de quelques semaines. Nous préparons TSCW dans CX 3 CR 1 GFP / + 4 souris pour visualiser les microglies avec la protéine fluorescente verte améliorée à ≤ 150 um sous la surface piales. Nous montrons également que cette préparation peut être utilisée en conjonction avec des injections cérébrales stéréotaxiques de la protéine HIV-1 Tat neurotoxiques, adjacent à la TSCW, qui est capable d&#39;induire microgliose durables. Par conséquent, cette méthode est extrêmement utile pour examiner les changements dans la morphologie et la motilité microgliales au fil du temps dans le cerveau vivant dans des modèles de troubles neurocognitifs associés au VIH (main) et d&#39;autres maladies neurodégénératives ayant une composante neuro-inflammatoires.

Watch this Scientific Journal Video about A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation at JoVE.com

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Nous décrivons une méthode pour visualiser plusieurs reprises la microglie et les monocytes circulants murin<em&gt; In vivo</em&gt; Pendant des heures, jours ou semaines à l&#39;aide transcrânienne microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une fenêtre amincie crâne qui permet l&#39;observation intermittente de la microglie quiescente qui peut être activé par injection stéréotaxique adjacentes de la Tat du VIH-1 protéine régulatrice.

Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo</emImagerie> de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K vues.  University of Rochester. Nous décrivons une méthode pour visualiser plusieurs reprises la microglie et les monocytes circulants murin In vivo Pendant des heures, jours ou semaines à l'aide transcrânienne microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une fenêtre amincie crâne qui permet l'observation intermittente de la microglie quiescente qui peut être activé par injection stéréotaxique adjacentes de la Tat du VIH-1 protéine régulatrice.

Vidéo: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Recherche

Neurosciences

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluée-skull Technique fenêtre corticale pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomographie par cohérence optique d&#39;imagerie

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantification de l&#39;architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation