Cette méthode d’imagerie in vivo des cellules rétiniennes permet d’étudier les maladies ophtalmologiques et de comprendre les fonctions normales de la rétine. Cette méthode fournit une approche simple et hautement reproductible de l’imagerie in vivo de la rétine par microscopie à deux photons. Une stabilisation correcte de la souris est essentielle pour obtenir des images in vivo de qualité.
Entraînez-vous à placer la souris dans le support de tête et familiarisez-vous avec la procédure avant d’essayer d’acquérir des images. Sédater l’animal conformément au protocole d’utilisation approuvé de l’animal. Appliquez la solution de dilatation des pupilles et laissez la souris dans l’obscurité pendant cinq minutes pour permettre aux pupilles de se dilater.
Fixez la broche du conduit auditif inférieur en position étendue vers l’intérieur et la broche du conduit auditif supérieur en position retirée. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la barre de l’écouteur soit inclinée à un angle de 60 degrés au-dessous de l’horizontale. Avec la souris face à la barre de morsure, montez une oreille sur la broche inférieure étendue avec la broche insérée dans le conduit auditif.
Après avoir desserré la vis fixant la goupille du conduit auditif supérieur, étendez la broche dans l’autre conduit auditif et serrez à nouveau la vis pour fixer la tête. Assurez-vous que la souris est bien fixée dans le support de tête. Appuyez sur le dessus de la tête.
La souris doit rester solidement dans les barres d’oreille et sa tête doit tourner librement autour de l’axe des conduits auditifs. Avec la barre de morsure positionnée vers la tête de la souris, surlevez doucement la tête de la souris pour permettre aux incisives maxillaires d’être abaissées dans le porte-barre de morsure et rétractez la barre de morsure avec une force douce pour sécuriser la tête. Utilisez la vis pour fixer la barre de morsure en position et placez la souris et le support sur la platine du microscope.
Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes sur les deux yeux de la souris. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la pupille d’un œil soit orientée en fonction du trajet de la lumière et placez un couvercle numéro 1,5 dans le porte-filtre compact. Après avoir fixé le support à l’étage du microscope, abaissez la lamelle de couverture jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le gel lubrifiant pour les yeux sans toucher la cornée, et ajustez la platine dans la dimension X-Y et la position Z de l’objectif jusqu’à ce que la lumière d’excitation à grand champ recouvre complètement la cornée.
Utilisez l’oculaire pour continuer à ajuster la position Z jusqu’à ce que les cellules fluorescentes ou les structures de la rétine entrent en ligne de compte, augmentant ainsi l’illuminateur d’épifluorescence si nécessaire pour résoudre les cellules ou les structures d’intérêt individuelles. Affiner l’alignement de la rétine avec le trajet de la lumière d’imagerie. Ajustez l’angle de la tête jusqu’à ce que seule l’expansion ou la contraction de la lumière floue se produise lors de la modification du plan focal, minimisant ainsi les distorsions X-Y.
Ensuite, éteignez l’illuminateur d’épifluorescence et fermez l’obturateur de l’illuminateur. Pour l’imagerie à deux photons, suivez tous les protocoles de sécurité laser institutionnels. Éteignez et couvrez toute la lumière ambiante, et basculez le chemin de la lumière d’excitation vers le laser et le chemin de la lumière d’émission vers les PMT.
Dans le logiciel d’acquisition d’images, définissez la taille de l’image sur 512 par 512 et la moyenne de l’image sur trois. Réglez le pas en Z pour qu’il commence en haut de la pile et progresse vers le bas, minimisant ainsi l’activation laser à deux photons des photorécepteurs. Allumez et activez les PMT, et réglez la tension à 680 volts.
Activez les obturateurs d’imagerie et d’émission. Commencez un aperçu de l’image en direct du tissu cible, en commençant par une puissance laser de 1 %, et ajustez automatiquement la luminosité de l’écran pour visualiser les cellules ou les structures d’intérêt. Si le tissu cible est sombre ou peu clair, augmentez le pourcentage de puissance laser jusqu’à ce que les structures deviennent visibles sans dépasser 45 milliwatts.
Manœuvrez l’étage du microscope dans la direction X-Y pour vous centrer sur une zone d’imagerie souhaitée et naviguez vers le plan Z avec les structures d’intérêt dans la mise au point. Pour une expérience de time-lapse chronique, ouvrez une image précédemment obtenue pour l’utiliser comme référence pour les cellules d’intérêt, en veillant à ce que l’angle d’imagerie dans l’image actuelle soit similaire à celui des images précédentes. Ensuite, accédez aux plans Z supérieurs et inférieurs d’intérêt pour définir les limites Z de la pile d’images et acquérir l’image.
Lorsque toutes les images ont été acquises, désactivez les PMT et l’obturateur laser. Basculez le chemin de la lumière d’excitation sur l’éclairage d’épifluorescence et le chemin de la lumière d’émission vers l’oculaire. Ensuite, quittez le logiciel d’acquisition d’images, éteignez le laser dans l’interface de l’ordinateur et arrêtez le matériel dans l’ordre de démarrage inverse, à l’exception de l’équipement toujours actif.
À la fin de l’analyse, retirez la souris du support de tête et utilisez un mouchoir non pelucheux pour retirer délicatement le gel pour les yeux. Ensuite, appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur les deux yeux et placez la souris sur un coussin chauffant de circulation d’eau chaude de 37 degrés Celsius avec surveillance jusqu’à la position couchée complète, avant de remettre la souris dans son boîtier. Chez les souris VGlut-2-Cre, les somas des cellules ganglionnaires de la rétine sont clairement discernables et les fascicules axonaux sont souvent apparents.
La trajectoire des axones et l’image négative du système vasculaire facilitent l’identification de la tête du nerf optique chez les souris VGlut-2-Cre, ce qui est utile comme point de repère dans les expériences d’imagerie chronique. Contrairement aux cellules ganglionnaires de la rétine, les neurites des cellules amacrines sont plus souvent observées dans les couches plexiformes internes. Un jour après l’injection intraoculaire de NMDA, la microglie rétinienne présente des processus courts ou une morphologie amiboïde conformément aux rapports précédents.
L’administration du colorant bleu Evans par une seule injection intrapéritonéale 30 à 60 minutes avant l’imagerie induit un fort marquage des vaisseaux sanguins émanant de la tête du nerf optique qui persiste pendant au moins sept jours. Après fixation, la distance réelle entre les paires de cellules dans les montures entières rétiniennes aplaties peut être mesurée par balayage confocale et comparée à des distances de pixels in vivo pour déterminer la taille moyenne des pixels des images in vivo. Les microsphères fluorescentes injectées dans les yeux de souris permettent de mesurer le diamètre de la microsphère in vivo, ce qui donne une estimation de la taille des pixels légèrement plus grande mais avec plus de variance.
L’imagerie in vivo peut être associée à des analyses histologiques telles que l’immunomarquage et l’hybridation in situ. Ces méthodes permettent d’identifier des types cellulaires spécifiques et d’examiner l’expression génique de cellules imagées.
