Nous remercions chanson Renjie (Wadsworth Center de base de cytométrie en flux) de l&#39;aide pour l&#39;analyse cellulaire et Helen Johnson (Wadsworth Center animale Histopathologie de base) pour la préparation de coupes en paraffine. Nous remercions le Dr Richard A. Cole (Wadsworth Center de base Light Microscopy) de l&#39;aide pour la microscopie confocale et collection d&#39;images. Nous tenons à remercier Andy Bentley (Wadsworth Center Photo et illustration) à l&#39;aide d&#39;animations. MDJ est soutenu par la Fondation Life Sciences Research, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA est soutenu par un Wadsworth Center-Health Research Inc bourse de recherche postdoctorale intra-muros. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH HD061916 et GM082978.

Les animaux ont été logés dans des classiques, spécifiques exemptes d&#39;agents pathogènes conditions et ont été traitées en parfaite conformité avec les soins du Centre Wadsworth animaux institutionnel et l&#39;utilisation des comités (IACUC) des lignes directrices. 1. Gavage oral <ol><li> (Facultatif) souche de souris Gavage de choix avec un antigène ou microbes d&#39;intérêt en utilisant un G 22 x1.5-in. aiguille d&#39;alimentation en extrémité franche (Popper scientifique, New Hyde Park, New York). Les volumes de livraison ne doit pas dépasser 400 pi par souris. </li></ol> 2. Isolement de cellules PP pour cytométrie en flux <ol><li> Euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie, selon des soins aux animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices. </li><li> Nettoyer l&#39;abdomen avec de l&#39;éthanol à 70% ou Bétadine avant la chirurgie. Réaliser une laparotomie standard qui implique un seul (1 cm) incision à l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux de qualité le long de la ligne médiane début d&#39;environ 1,5 cm de la base de la cage thoracique. Exposez le parcavité itoneal et identifier le caecum. Snip l&#39;intestin petit terminal à la jonction iléale-caecal et retirez délicatement l&#39;intestin dans son intégralité. Veillez à ne pas hyperextension du tissu intestinal car il est retiré de la cavité péritonéale. </li><li> Posez l&#39;intestin grêle sur un lit de serviettes en papier humides ou Kimwipes. Mouiller doucement l&#39;intestin grêle avec une solution saline pour prévenir la déshydratation des tissus. Identifier visuellement PP individuelles situées du côté anti-mésentérique de l&#39;intestin (figure 1). En règle générale, une seule souris de 5 à 10 PP visibles qui sont uniformément réparties dans le duodénum (proximale) à l&#39;iléon (distale). En moyenne, quatre souris va rendement de 23 PP. </li><li> Utilisation courbes ciseaux chirurgicaux, doucement d&#39;accise PP individuels et les placer dans une solution froide saline équilibrée de Hank (HBSS). Remarque, les ciseaux doivent être placés courbe vers le haut juste au-dessus du PP et puis doucement appliquée au tissu. D&#39;accise que le PP (pas surrounding tissus) et transfert à l&#39;HBSS froid. Remarque: Toutes les incubations et les étapes de centrifugation de ce point de l&#39;article 2 doit être effectuée à 4 ° C afin de préserver la viabilité des cellules. </li><li> Transfert PP en 5 ml Spleen dissociation moyen et incuber pendant 15-20 min à 37 ° C tout en agitant vigoureusement à 250 rpm. Le temps d&#39;incubation plus longue affectera négativement la viabilité cellulaire. </li><li> À générer une suspension de cellules individuelles, sur un lieu PP stérile (autoclave) 70 um tamis en nylon maille et de force broyer le tissu dans la maille à l&#39;aide de la base d&#39;un plongeur d&#39;une seringue de 1 cc. Alternativement, PP sandwich entre deux givrés stériles lames de microscope (autoclavés dans des enveloppes) et doucement broyer les tissus avec un mouvement de va-et-vient. Utiliser une pipette de transfert stérile pour transférer la suspension de cellules dans un tube de 5 ml Falcon. </li><li> Ajouter de l&#39;EDTA à une concentration finale de 1 mM à la suspension cellulaire. Incuber sur un agitateur pour5 min à température ambiante. </li><li> Suspension cellulaire décanter à travers un second filtre 70 cellules um pour éliminer les agrégats cellulaires ou autres débris tissulaires. Prélever des cellules dans un tube de 15 ml ou 50 conique. </li><li> Cellules soumises à une centrifugation douce (5 min à 500 xg). Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de flux, ce qui est un tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de sérum de veau foetal (FCS). </li><li> Pour déterminer le nombre et la viabilité cellulaire, diluer les cellules 1:10 dans du bleu trypan et inspecter visuellement les cellules en utilisant un microscope optique et d&#39;un hémocytomètre. Alternativement, un compteur de cellules comtesse (Invitrogen) ou un instrument similaire peut être utilisée pour énumérer automatiquement le nombre de cellules et leur viabilité. Démarrage avec 20-25 PP, ce protocole devrait donner&gt; 2,5 x 10 6 cellules totales. Cela équivaut à ~ 0.8 à 1,2 x 10 6 cellules par souris. </li></ol> Marquage de l&#39;anticorps de cellules de cytométrie en flux &lt;début ol = &quot;11&quot;&gt; <li> Distribuer des cellules (10 5 par puits) dans les puits d&#39;une plaque de 96 puits à fond rond. </li><li> Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un tampon de bloc Fc et incuber sur de la glace pendant 15 min. Bien qu&#39;il existe un certain nombre de blocs de buffers disponibles dans le commerce Fc (par exemple chez le rat anti-souris CD16/CD32, BD Biosciences), nous utilisons simplement milieu usé d&#39;un rat de cellules d&#39;hybridome B (ATCC 2.4.G2) qui sécrète un anticorps monoclonal murin IgG 1 contre Fcy récepteurs pour cette étape. </li><li> Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg) comme ci-dessus, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque. </li><li> Ajouter fluorophore anticorps conjugués directement à des suspensions cellulaires lors de la dilution désirée, et incuber sur de la glace pendant 30 min avec balancement continu. </li><li> Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et décantersurnageant en retournant doucement la plaque. </li><li> Laver les cellules avec 100 pi de tampon de flux. </li><li> Centrifuger la plaque à 1.000 xg pendant 5 min, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules tampon 400 ul de fixation, qui se compose de 300 pi de tampon de flux et 100 pi de 1% de paraformaldéhyde dans des MEHP tampon (60 mM PIPES, HEPES 25 mM, 10 mM EGTA, 4 mM de MgCl2 à pH 6). </li><li> Cellules soumises à la cytométrie de flux en utilisant un FACSCalibur ou équivalent. Analyser les résultats à l&#39;aide du logiciel Cell Quest Pro version 5.2. </li></ol> 3. Préparation de cryosections PP <ol><li> En prévision de la collecte de tissus, ajoutez une température optimale de coupe (PTOM) composé de 7x7x5 mm moules à base de plastique. Préparer également une piscine de l&#39;azote liquide (&gt; 750 ml) dans un seau dewar ou la glace. </li><li> Euthanasier souris et effectuer un laparotamy, comme décrit ci-dessus. Enlever l&#39;intestin et les placer sur du papier absorbant humide. </li><li> ÀPP pour isoler cyrosectioning, couper 0,5 cm segments transversaux de l&#39;intestin grêle contenant un seul PP et les tissus transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS. Rincer délicatement la lumière de ces segments avec du PBS pour éliminer les débris indésirables fécale. </li><li> Placez les segments de tissus intestinaux verticalement à l&#39;intérieur des moules de base contenant octobre Plongez les moules dans de l&#39;azote liquide et permettre au tissu de geler complètement (1-2 min). La couleur de l&#39;OPO va changer du clair au blanc lorsque le tissu est complètement gelé. . Pour un refroidissement plus progressive (par exemple, pour réduire la fissuration des PTOM), les moisissures immerger dans un bain d&#39;isopentane refroidi avec de vapeurs d&#39;azote liquide Remarque: Porter des lunettes de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec de l&#39;azote liquide. </li><li> Retirer les moules de base congelée de l&#39;azote liquide en utilisant une pince et de permettre le moule à réchauffer à la température ambiante juste assez longtemps (~ 10-15 secondes) pour permettre aux bords du bloc octobre à ramollir. Pour retirez le bloc congelé de l&#39;OCT dele moule, retourner le moule et appuyez doucement sur le dos pour éjecter le bloc sur un chiffon propre 4 pièces x 4 cm de papier d&#39;aluminium. Immédiatement envelopper le tissu de la feuille et les placer dans un sac spécimen étiqueté stockés dans de l&#39;azote liquide ou de la neige carbonique. Sinon, le transfert de tissus dans un congélateur (&lt;-20 ° C). Utilisez le tissu à l&#39;intérieur d&#39;une semaine, sinon les blocs deviennent fragiles avec l&#39;âge. </li></ol> Découpe au cryostat <ol start="6"><li> Coupe à congélation du tissu en utilisant un Leica CM3050S cryomicrotome ou équivalent. La température de la chambre sur le cryostat doit être réglé à -21 ° C. </li><li> Efforcez-vous de sections qui sont 12-14 um d&#39;épaisseur. </li><li> Recueillir des sections sur Fisher SuperFrost Plus (ou équivalent) des lames de microscope en verre et d&#39;inspecter visuellement à l&#39;aide d&#39;un microscope à faible niveau de lumière électrique. Si plusieurs sections sont recueillies sur une lame, assurez-vous qu&#39;ils sont regroupés pour des applications en aval de coloration. </li><li> Magasin de til glisse à température ambiante dans une boîte à lames et, idéalement, de les utiliser dans quelques jours. </li></ol> Étiquetage des anticorps cryosections et analyse par microscopie confocale <ol start="10"><li> Immerger les lames dans de l&#39;acétone (ou méthanol) en cuve de coloration des tissus ou supports pendant 2 min. Une incubation prolongée peut causer des tissus à se détacher de la lame. </li><li> Transfert de diapositives à cuve de coloration nouvelle et laver 3 fois avec du PBS-T (PBS 1X avec 0,05% de Tween-20) pendant 3 minutes chacun. </li><li> Encercler les sections avec un stylo hydrophobe ImmEdge. Cela permettra d&#39;assurer que les réactifs et les anticorps restera confiné à cette région pendant les incubations. </li><li> Incuber les lames dans un tampon de bloc (sérum de chèvre 2% dans du PBS) pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Incuber les lames avec un tampon de bloc Fc (voir ci-dessus) pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Tremper dans du PBS-T et sec autour de sections à l&#39;aide Kimwipes ou d&#39;autres tissus absorbant.Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels. </li><li> Coupes de tissus de recouvrement avec une solution d&#39;anticorps primaire et incuber pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Anticorps primaire est généralement dilué dans un tampon de bloc à une concentration finale de 20 pg / ml. L&#39;utilisation d&#39;anticorps directement marqués primaires est souhaitable, car pas moins de trois anticorps peuvent être combinés directement à cette étape. Anticorps directement marqués également d&#39;éliminer la nécessité de mesures supplémentaires d&#39;incubation d&#39;anticorps. </li><li> Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS. </li><li> Si nécessaire, des diapositives incuber avec les anticorps secondaires pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humide. </li><li> Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS. </li><li> Incuber les lames pendant 4 min dans du paraformaldéhyde à 1% dans un tampon de MEHP, comme décrit ci-dessus. </li><li> Rincer les lames dans du PBS pendant 1 min. </li><li> Zone sèche autour des sections à l&#39;aide Kimwipes ou d&#39;autres absorbentent des tissus. Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels. Avec une pipette ou compte-gouttes, placer délicatement une goutte de prolonger à moyen Or montage direct sur la section. Recouvrir d&#39;une lamelle de verre sur le support de montage en prenant soin d&#39;éviter les bulles. Utilisez du papier buvard pour absorber l&#39;excès n&#39;importe quel support de montage. </li><li> Joint à lamelles lames de microscope avec vernis à ongles commerciale et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Afficher les diapositives avec un Leica TCS SP5 ou équivalent microscope confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous avons fourni des protocoles parallèles pour la préparation PP préparations de cellules uniques pour l&#39;analyse par cytométrie en flux et fonctionnelle et cryosections pour immunomarquage. Les deux méthodes sont hautement reproductibles et facilement accessible, à condition d&#39;un cytomètre en flux et cryostat sont disponibles. Pour les enquêteurs première fois, il convient de souligner que, par rapport à la rate, les rendements cellulaires totaux provenant PP sont relativement maigr...

Les plaques de Peyer (PP) sont des agrégats macroscopiques organisés follicules lymphoïdes présents tout au long de l&#39;intestin grêle de l&#39;homme et la souris (figure 1) et constituent les principaux sites à laquelle des réponses immunitaires muqueuses sont engagées contre des antigènes alimentaires, les bactéries commensales, les agents pathogènes microbiens et les vaccins oraux 1-4. Contrairement à d&#39;autres tissus lymphoïdes périphériques tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, PP manquent vaisseaux lymphatiques afférents. En tant que tels, des réponses immunitaires adaptatives en PP sont entraînés en réponse à des antigènes provenant de la lumière intestinale. L&#39;échantillonnage des antigènes luminal est accomplie par l&#39;épithélium du follicule-associé (EAF), qui se compose de deux entérocytes et l&#39;antigène d&#39;échantillonnage cellules appelées cellules M. Sous l&#39;EAF, dans le dôme sous-épithélial (SED) région, se trouve un réseau de cellules dendritiques (CD) entremêlés avec les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 + 5-9. Au cœur de chaque follicl PP lymphoïdee sont des cellules dendritiques folliculaires (FDC) et un B riche en cellules germinales centre central, flanqué de zones T interfolliculaires cellules riches. D&#39;échantillonnage de l&#39;antigène par les résultats PP dans le développement de plasmablastes + IgA cellules B et cellules CD4 + mémoires et effectrices que les semences de la lamina propria environnante et offrir une immunité à un large éventail d&#39;envahisseurs muqueuses. Disséquer les événements immunologiques complexes associées à l&#39;échantillonnage antigène, le traitement et la présentation de PP est une tâche ardue, étant donné que les cellules PP ne constituent qu&#39;une infime partie de la totalité des cellules lymphoïdes dans la muqueuse intestinale. Pour aider à la caractérisation in vitro de cellules dans ce contexte, nous proposons un protocole de préparation total des cellules de souris PP pour la cytométrie en flux et fonctionnelles, ainsi que d&#39;un protocole de préparation PP cryosections pour la microscopie d&#39;immunofluorescence et immunohistochimie. Notre protocole pour l&#39;isolement, la caractérisation et immunomarquage des protocoles d&#39;ententee cellules PP n&#39;est pas nouvelle en soi, comme en témoigne le fait qu&#39;il ya de nombreuses références datant de plus de 25 ans qui citent ces techniques 5,6,9-11. Au contraire, notre protocole prévoit une procédure simplifiée (et visuel) méthode de collecte des enquêteurs PP pour la première fois. Les techniques que nous décrivons sont faciles à maîtriser et facile à produire un grand nombre de cellules avec&gt; 90% de viabilité cellulaire. Le protocole de découpe au cryostat donne hautement reproductibles coupes sériées parfaitement adaptés pour immunofluorescence et la microscopie confocale. En outre, notre protocole complète deux autres articles Jove dernières années. La première, par Fukuda et ses collègues, décrit l&#39;utilisation de tests anse iléale ligaturée à évaluer l&#39;absorption de bactéries pathogènes par les cellules M PP 12. L&#39;autre, par Geem et ses collègues, décrit l&#39;isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de la muqueuse intestinale de la souris, mais exclut explicitement les PP à partir de leur analyse 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Entreprise </td><td> Cat. # </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Composé octobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Moules </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus Diapositives </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Rite bord de la lame </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Hank solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans rouge de phénol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um tamis cellulaire </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Spleen dissociation moyen </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Bloquer </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes obtenu à partir de la lignée cellulaire 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Ciseaux courbe </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Compteur de cellules comtesse </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hématoxyline </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formol </td><td> Starplex scientifique </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs et équipements utilisés dans cette étude. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Les plaques de Peyer (PP) font partie intégrante des tissus lymphoïdes associées à l&#39;intestin (GALT) et jouent un rôle central dans l&#39;homéostasie intestinale et immunosurveillance. Antigènes particulaires et des microbes dans la lumière intestinale sont continuellement échantillonné par les cellules M PP dans l&#39;épithélium folliculaire associée (EAF) et transportés vers un réseau sous-jacent des cellules dendritiques (CD), les macrophages et les lymphocytes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles dans lesquels PP murins sont (i) dissociée en suspensions de cellules isolées et soumises à la cytométrie en flux et (ii) préparé pour découpe au cryostat et immunomarquage. Pour la cytométrie en flux, PPs sont dissociées mécaniquement et ensuite filtré à travers 70 pm à générer des membranes suspensions monocellulaires libres des cellules épithéliales et les gros débris. Démarrage avec 20-25 PP (à partir de quatre souris), cette méthode rapide et reproductible donne une population de&gt; 2,5 x 10 6 cellules avec&gt; 90% de viabilité cellulaire. Pour découpe au cryostat, fraisPP ly isolés sont immergés dans la température de coupe optimale (PTOM) moyen, composant logiciel enfichable congelés dans l&#39;azote liquide, puis sectionnée à l&#39;aide d&#39;un cryomicrotome. Les coupes de tissus (5-12 um) sont séchés à l&#39;air, fixées à l&#39;acétone ou le méthanol, puis soumis à immunomarquage.

L&#39;analyse par cytométrie en flux des suspensions monodisperses de cellules PP totaux révèle une nette distinction entre les préparations de cellules bons et les mauvais. Dans les préparations cellulaires de bonnes relations avec plus de 80% de viabilité, la grande majorité des cellules démontrent une forte diffusion vers l&#39;avant (FSC), un indicateur de volume cellulaire élevée et à faible dispersion latérale (SSC), un indicateur de granularité cellulaire faible (figure 2A). Dans cet...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l&#39;intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l&#39;analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K vues.  New York State Department of Health. Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

Vidéo: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolement et activation de murins Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...