Les auteurs remercient le MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) et le NIH R21CA152473 de soutien.

1. L&#39;ensemencement de cellules <ol><li> Ne pas permettre aux cellules de se développer à overconfluency. Utilisez le passage des cellules au début quand la transfection de cellules primaires. </li><li> Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules trypsiniser, compter le nombre de cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre, et diluer la suspension cellulaire avec les médias pour atteindre la densité cellulaire désirée (cellules / volume). Cellules de semences dans les tissus clairs culture traitée à fond plat de 96 puits des plaques en utilisant un réservoir et pipettes multicanaux. La densité choisie devrait donner 70-80% de confluence le jour de la transfection. Par exemple, comme le montre le tableau 1, les cellules ont été diluées de 25 à 50 cellules / ul pour les données de transfection présentés ici. </li></ol> 2. La transfection de cellules <ol><li> La dilution du polymère et les stocks d&#39;ADN. Décongeler polymère et les solutions mères d&#39;ADN à température ambiante (RT). Diluer la solution mère de polymère et solution de l&#39;ADN, séparément claires plaques à 96 puits en utilisant une pipette douze canaux, Avec un solvant approprié à des concentrations nécessaires pour obtenir le poids souhaité de polymère à des rapports pondéraux d&#39;ADN (poids / poids). Dans ce cas, le solvant choisi est de 25 mM de tampon acétate de sodium (pH = 5,2). <ol><li> ADN dilution. Typiquement, l&#39;ADN stocké à 1 mg / ml est dilué dans un tampon d&#39;acétate de sodium à une concentration de 0,03 à 0,06 mg / ml dans une claire non traitée culture de tissus de 96 puits (un puits pour une formulation unique). Tableau 2 montre le protocole de dilution ADN typique pour une formulation unique utilisée pour transfecter des quatre puits répliqués dans une plaque de 96 puits ensemencés avec des cellules de l&#39;étape 1. </li><li> Dilution polymère. La 100 mg / ml de polymère / DMSO solution est diluée dans du tampon acétate de sodium selon la concentration nécessaire pour obtenir le polymère souhaité à l&#39;ADN poids / poids rapport. La gamme de poids / poids ratios généralement utilisés pour la délivrance de gènes de poly (bêta-amino ester) s (PBAEs) est de 20 à 100. Polymères sont PBAE première diluée à 10 mg / ml, suivie de la dilution protocole comme indiqué dans le tableau 3. Les dilutions de polymère peut être réalisée dans un tissu transparent non-culture traitée plaque 96-puits qui correspond à l&#39;orientation de l&#39;échantillon de la plaque de dilution d&#39;ADN. </li></ol></li><li> Formation des nanoparticules. Ajouter la solution PBAE à un volume égal de la solution d&#39;ADN plasmidique en utilisant une pipette douze canaux et mélanger vigoureusement. Laissez le mélange incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l&#39;auto-assemblage. </li><li> Transfection des nanoparticules. Après l&#39;auto-assemblage, 20 pl nanoparticules sont ajoutés par puits goutte à goutte au milieu de culture à l&#39;aide de la pipette douze canaux. Puits en double ne sont pas traitées ou sont transfectées avec des réactifs disponibles dans le commerce comme témoins. Les cellules transfectées sont incubées à 37 ° C pendant deux à quatre heures, puis les puits sont remplacés par du milieu frais (100 pl / puits). Le choix du temps d&#39;incubation dépend de la lignée cellulaire, des conditions de culture et un système de transfection. La différence de transfectionl&#39;efficacité et la toxicité pour les cellules par suite de faire varier la période d&#39;incubation seront quantifiées par le protocole d&#39;analyse décrite à l&#39;étape 3. </li></ol> 3. Analyse de l&#39;efficacité et de la toxicité cellulaire Transfection Efficacité de la transfection est analysée visuellement avec un microscope à fluorescence et quantifiés à l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux 48 heures post-transfection. Toxicité cellulaire est analysée visuellement avec un microscope à fluorescence et quantifiés en utilisant la CellTiter 96 aqueuses Un essai de 24 heures après la transfection. <ol><li> La microscopie à fluorescence. Analyser visuellement les puits pour l&#39;expression du gène rapporteur transfectée (par exemple, l&#39;EGFP ou DsRed) en utilisant le canal approprié fluorescence. Acquérir les images pour chaque puits, en choisissant des champs de vision que correctement représentent l&#39;efficacité de transfection des formulations particulières (figure 1). Prenez note de toute toxicité cellulaire observée visuellement. </li><li> Cytométrie en flux. <ol><li> N&#39;utiliser que des pipettes multicanaux pour préparer la plaque de 96 puits pour la cytométrie en flux. Laver avec du PBS, trypsiniser avec 30 ul / puits de trypsine / EDTA, neutraliser avec 170 ul de tampon FACS (PBS + 2% de FBS), une pipette de haut en bas dans chaque puits, y compris autour des bords, et de transférer la totalité de 200 ul volume de chaque puits dans les puits correspondants dans un fond rond ou en V 96 puits à fond plat. </li><li> Centrifuger la plaque à 130 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Retirez les médias 170 ul de chacune des cellules ainsi la pipette pour remettre tout en évitant les bulles. Pour utiliser une viabilité tache comme l&#39;iodure de propidium (PI), ajouter 10 ul de tampon FACS + PI (50:1 tampon FACS: PI dilution, la concentration actions PI 1 mg / ml) dans chaque puits. Immédiatement placer sur la glace et couvrir de la lumière. </li><li> Démarrez le cytomètre en flux C6 Accuri, le HyperCyt de 96 puits de fixation, et le logiciel HyperView. Utilisez les onglets Conception et HyperView Protocole de choisir la p appropriéeType tard, disposition de la plaque, et d&#39;autres paramètres tels que le tremblement / sip / rinçage / secouer de temps. Pour le protocole ci-dessus, les paramètres suivants ont été utilisés, un premier pré-plaque pendant une minute, et un tremblement de pré-plaque pendant 30 secondes à 2400 rpm. Temps d&#39;aspiration a été fixée au 15 sec à 15 tours par minute, une sonde de rincer chaque puits pendant 2 secondes, et une inter-bien agiter toutes les 12 puits pendant 12 sec à 2400 rpm. La secousse inter-puits est important de garder les cellules dispersées dans les médias, ainsi que pour une meilleure capacité à traiter les données en incluant les pauses chronométrées entre les groupes de puits (dans ce cas, 12 secondes). </li><li> Utilisez l&#39;onglet HyperView identification Eh bien, pour traiter les données et séparées dans le puits approprié (Figure 2). Afin d&#39;identifier les puits individuels, il peut aider à utiliser le filtre de bruit du logiciel, ainsi que notamment une base de même filtre dans les paramètres avancés. </li><li> Quantifier le pourcentage de cellules vivantes positivement transfectées par déclenchement approprié de séparer pop différenteulations (figure 3). Première afficher les données de flux sur un diagramme de dispersion FSC vs SSC afin de séparer les cellules de débris (figure 3A). Si l&#39;iodure de propidium (PI) a été utilisé, porte la population de cellules individuelles et estime que les données sur un terrain FSC vs FL3 afin de séparer les cellules vivantes des cellules mortes et les portes des cellules vivantes. Afin de quantifier le nombre de cellules transfectées, voir la population de cellules en direct sur les canaux appropriés, par exemple, la GFP peut être vu dans FL1. En utilisant la population traitée, porte les cellules non traitées afin de déterminer le signal de fond (Figure 3B). Les cellules transfectées de façon positive peut alors être isolé en utilisant cette grille et en visualisant les populations transfectées en utilisant à la fois la dispersion et tracés de contour (figure 3C et 3D). Il peut y avoir un continuum de cellules transfectées de façon positive, comme les cellules transfectées seront différentes à différents degrés de fluorescence. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 aqueuses Un dosage <ol><li> Transfecter une autre plaque exactement de la même manière pour les mesures de toxicité cellulaire. </li><li> Premix 1 ml de la solution d&#39;essai CellTiter 96 aqueuse avec 10 ml Un milieu frais. Retirez le papier de cellules et utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 110 ul de la solution prémélangée + média par puits. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 490 nm chaque intervalle d&#39;une heure de 1 à 4 heures jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance du puits avec la condition traitée est dans la gamme linéaire du dosage. Inclure les quatre puits de contrôle avec seulement des médias + la solution pour une lecture d&#39;absorbance de fond. </li><li> Les valeurs moyennes de l&#39;absorbance des quatre puits répétés par condition et soustraire l&#39;absorbance de fond moyenne de chaque moyenne. Normaliser la moyenne corrigée pour chaque affection traitée à la moyenne corrigée de l&#39;état non traité afin de déterminer la viabilité cellulaire pour cent. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. nanoparticules Dimensionnement avec le NTA et le plasmide calculs particule par <ol><li> Premier du système fluidique de l&#39;NS500 NanoSight faisant fonctionner la pompe diluant avant à environ 1/5ème de la vitesse maximale et la pompe de prélèvement vers l&#39;arrière à environ 1/10ème de la vitesse max. Continuer jusqu&#39;à ce que le système fluidique est rincé avec du diluant. </li><li> Préparer les nanoparticules à analyser. Dans le cas de PBAEs, séparément diluer l&#39;ADN plasmidique actions (1 mg / ml) et le stock PBAE (100 mg / ml) dans un tampon d&#39;acétate de sodium (25 mM, pH 5) dans des tubes Eppendorf. </li><li> Diluer la concentration d&#39;ADN plasmidique à 0,06 mg / ml. Concentration du polymère peut varier en fonction du poids requis rapport poids de polymère d&#39;ADN (par exemple, pour 60 en poids / poids des particules de polymère est diluée à 3,6 mg / ml). </li><li> Ajouter la solution de polymère à un volume égal de la solution d&#39;ADN plasmidique et mélanger vigoureusement. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l&#39;auto-assemblage. </li><li> Dila solution de nanoparticules luth 100-pli dans du PBS pour que la concentration des nanoparticules à être dans la plage appropriée pour le NTA et d&#39;obtenir un volume final de 500 pl au moins. </li><li> Chargez l&#39;échantillon dans le NanoSight en plaçant le tube de chargement dans l&#39;échantillon Eppendorf tube (figure 4A). Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d&#39;air. </li><li> Dans le mode de capture, augmenter le niveau de la caméra jusqu&#39;à ce que les particules peuvent être vues. Réglez la mise au point afin que les particules aspect lisse (figure 4A et 4B). </li><li> En mode standard, réglez le niveau devant la caméra au point que toutes les particules peut être vu à l&#39;écran. Puis diminuer le niveau de la caméra à la plus faible de telle sorte que les particules peuvent tous être encore observée. Si un niveau intermédiaire caméra est nécessaire, passez en mode avancé et modifier l&#39;obturateur et de gagner des niveaux appropriés. </li><li> Contrôler visuellement pour s&#39;assurer qu&#39;il ya entre 20 à 100 particules sur la screen. Un nombre idéal pour le suivi des nanoparticules est d&#39;environ 50 particules. S&#39;il ya trop ou trop peu, rincez le NS500, ajuster la dilution dans du PBS, et re-charger l&#39;échantillon. </li><li> Ajuster la durée de capture en fonction de la table de mode standard. Typiquement 30 - 60 sec est d&#39;une longueur de capture approprié (figure 4B). </li><li> Pour charger l&#39;échantillon suivant, rincer le système, puis re-charger le nouvel échantillon. </li><li> Une fois les vidéos sont capturées, passez à l&#39;étape du traitement par l&#39;ouverture d&#39;un fichier vidéo. </li><li> Il ya un certain nombre de paramètres qui peuvent être réglés pour mieux traiter une vidéo (figure 4C). L&#39;objectif est de sélectionner les paramètres qui conviennent le mieux capturer chaque particule à l&#39;écran, comme indiqué par une croix rouge sur l&#39;écran au-dessus de chaque particule (figure 5). </li><li> Augmenter le gain de l&#39;écran pour mieux voir les particules. Dans le mode standard ou avancé, sélectionnez le réglage automatique des paramètres par ClickIng les cases appropriées. Dans le cas où les réglages automatiques ne suffisent pas à sélectionner des particules, décochez la case et définir manuellement les paramètres (figure 4C). </li><li> Une fois que toutes les particules sont cueillies à l&#39;écran, cliquez sur le bouton processus du logiciel pour traiter le fichier vidéo (figure 4C). Ceci permet d&#39;obtenir la distribution de taille des particules, de taille moyenne, ainsi que la concentration des particules. </li><li> Afin de s&#39;assurer que la concentration en particules est exacte, changer la dilution PBS, par exemple en augmentant la dilution d&#39;un facteur 2, et répétez la procédure ci-dessus. Mesure des dilutions multiples d&#39;un même échantillon est recommandé de s&#39;assurer que la mesure de la concentration de l&#39;échantillon est exacte. Une bonne gamme de mesure est de 10 7 -10 9 particules / ml. </li><li> Vérifier que tous les plasmides sont incorporés dans des nanoparticules en exécutant l&#39;électrophorèse sur gel de nanoparticules et d&#39;évaluer si un ADN libre est présent.Si ce n&#39;est pas tous les plasmides sont encapsulés, utilisez des techniques standard pour mesurer l&#39;absorbance de l&#39;ADN dans le but de quantifier total des plasmides encapsulés. </li><li> Pour calculer le nombre moyen de plasmides par particule, il faut diviser la concentration totale encapsulée plasmide par la concentration de NTA particule mesurée. Afin d&#39;estimer le plasmide de distribution par échantillon de particules, utilisez d&#39;abord l&#39;histogramme NTA taille des particules pour calculer la fraction volumique de chaque bac 1-nm de particules. Multipliez cette répartition de la fraction de volume par la quantité totale de plasmide pour obtenir le nombre de plasmides par cellule. Diviser ces chiffres par le nombre de particules dans chaque cellule afin d&#39;obtenir le nombre de plasmides-p-particule pour chaque taille de particules (figure 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Les auteurs rapportent aucun conflit d&#39;intérêt.

Les protocoles ci-dessus décrivent des méthodes pour évaluer l&#39;efficacité de transfection des formulations de nanoparticules, ainsi que d&#39;un moyen pour caractériser la taille des particules et de la charge des nanoparticules d&#39;ADN. Le nombre de plasmides par des particules est un paramètre important qui peut aider à prédire l&#39;efficacité de la particule et peut également être utilisé pour la détermination de la dose. Analyse de suivi de nanoparticules peut être effectuée dans une gamme de d...

La détermination du nombre de plasmides complexés par nanoparticule est important de concevoir des nanoparticules efficaces des stratégies de transfert de gènes, en particulier pour la co-délivrance de plasmides multiples à la même cellule cible, comme il est souvent nécessaire dans les cellules souches reprogrammation des études 12. Quelques approches pour calculer le nombre de plasmides associés à une nanoparticule unique ont été décrites, et chaque approche présente des inconvénients dans les techniques utilisées pour l&#39;estimation de 13-16. Quantum dot (QD) combiné avec l&#39;étiquetage TEM a été utilisée pour estimer les plasmides par des particules de chitosane à base de nanoparticules. Estimation avec cette technique QD est compliquée en raison de la nécessité pour marquer l&#39;ADN, ce qui peut altérer ses propriétés d&#39;auto-assemblage, la possibilité que l&#39;ADN encapsulé sans étiquette n&#39;est pas directement détectée; plasmides potentiellement se chevauchent et QDS dans les images TEM 2D de particules, et d&#39;autres hypothèses simplificatrices 13. Une autre approche qui est unepplicable quand microdomaines ordonnés existent dans les particules a été utilisée pour étudier Lipopolyamine-ADN par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET), diffraction des rayons X et diffusion de lumière dynamique (DLS) 14,15. Malheureusement, les matériaux tels que les nanoparticules polymériques étudiés ici ne sont pas applicables à cette méthode. . Dans une autre étude, Collins et al ont utilisé une particule flux de l&#39;analyse d&#39;image technique pour étudier (Lys) 16-peptidiques contenant / ADN, mais leur méthode ne peut évaluer plus, particules microniques 16. Ainsi, nous avons récemment mis au point un nouveau test et flexible afin de quantifier le nombre de plasmides par nanoparticule 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Un tampon d&#39;acétate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluer à 25 mM dans de l&#39;eau désionisée </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP ADN </td><td> Biopharmaceuticals Elim </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> ADN DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> Prince-Édouard, ramifié </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 aqueuse une </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Matériels </td></tr><tr><td> Effacer fond plat de 96 puits, stérile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Effacer fond rond de 96 puits, stérile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-canaux Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 et 50-300 ul </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Numéro de modèle: AX10 </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux C6 Accuri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Attachement HyperCyt </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Transfert de gènes non viral en utilisant des nanoparticules polymériques est apparue comme une approche intéressante pour la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques 1 et comme une technologie pour la médecine régénérative 2. Contrairement aux virus, qui ont des problèmes de sécurité importants, des nanoparticules polymériques peuvent être conçus pour être non-toxique, non-immunogène, non mutagène, plus faciles à synthétiser chimiquement polyvalent, capable de transporter plus de fret acide nucléique et biodégradable et / ou soucieux de l&#39;environnement. Polymères cationiques s&#39;auto-assembler à l&#39;ADN chargé négativement par l&#39;intermédiaire d&#39;une interaction électrostatique pour former des complexes de l&#39;ordre de 100 nm qui sont communément appelées nanoparticules polymériques. Des exemples de biomatériaux utilisés pour former l&#39;échelle nanométrique des nanoparticules polycationiques de transfert de gènes comprennent la polylysine, polyphosphoesters, le poly (amidoamines) s et polyéthylènimine (PEI), ce qui est un non-dégradable off-the-shelf polymère cationique couramment utilisé pour la délivrance d&#39;acides nucléiques 1,3. Poly (bêta-aminoester) s (PBAEs) sont une nouvelle classe de polymères cationiques 4 qui sont hydrolytiquement dégradable et 5,6 ont été montré pour être efficace au transfert de gènes à des types cellulaires difficiles à transfecter comme les cellules endothéliales rétiniennes humaines (HREC) 7, les cellules épithéliales mammaires de souris 8, les cellules humaines de cancer du cerveau 9 et macrovasculaires (veine ombilicale humaine, HUVEC) des cellules endothéliales 10. Un nouveau protocole pour caractériser des nanoparticules polymériques en utilisant des nanoparticules d&#39;analyse de suivi (NTA) est décrite. Dans cette approche, tous les deux la distribution granulométrique et la distribution du nombre de particules par les plasmides sont obtenus 11. En outre, un haut débit de dosage de 96 puits de transfection plaque pour le dépistage rapide de l&#39;efficacité de transfection des nanoparticules polymériques est présenté. Dans ce protocole, le poly (bêta-amino ester) s (PBAEs) sont utilisés en tant que polymères de l&#39;homme et des modèles de cellules endothéliales rétiniennes (HREC) sont utilisés comme mocellules del humains. Ce protocole peut être facilement adapté pour évaluer une nanoparticule polymère et n&#39;importe quel type cellulaire d&#39;intérêt dans un format de plaque multi-puits.

La figure 1 montre une image de microscopie à fluorescence d&#39;un exemple d&#39;une transfection réussie de HREC avec le plasmide EGFP. L&#39;image en fond clair est utile de s&#39;assurer que les cellules conservent leur morphologie habituelle. En outre, les tests de viabilité cellulaire, tels que MTS ou des tests similaires, peuvent être utilisés pour évaluer la toxicité des nanoparticules 7. La cytométrie en flux, tel que décrit, peut être utilisé pour quantifier l&#39;efficac...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocole d&#39;analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d&#39;évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l&#39;évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de transfert de gènes.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K vues.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un protocole d'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d'évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l'évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de tran...

Vidéo: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulation de nanoparticules polymériques dibloc par la technique nanoprécipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Recherche

Bio-ingénierie

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymère Microneedle tableau Fabrication par photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...