Cette étude a été soutenue par l&#39;Institut national de la santé accorde 1K22AI097291-01 et par le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre UL1TR000433. Nous reconnaissons également professeur Darrell Irvine au MIT et professeur Matthias Stephan au Fred Hutchinson Cancer Center pour leur contribution sur le travail initial sur les nanoparticules de vaccins et les souris transgéniques OT-I / Luc.

Toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l&#39;Université sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux (UCUCA) à l&#39;Université du Michigan et réalisés selon les politiques et les lignes directrices établies. 1. Synthèse et caractérisation de ICMVs Co-chargé avec de la protéine antigène et adjuvant Molécules <ol><li> Mélanger 1: 1 de rapport molaire de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) dans du chloroforme, en maintenant la quantité de lipides totaux à 1,26 umol par lot (par exemple, 500 pg de DOPC et 630 ug de MPB) dans un flacon en verre de 20 ml (diamètre = 28 mm et hauteur = 61 mm). </li><li> Ajouter médicaments lipophiles, tels que le monophosphoryl lipide A (MPLA) ou des colorants lipophiles (par exemple, a fait), à la solution de lipides à la concentration souhaitée. Bien enlever le solvant organique par purge à nitroge extra-secn gaz et plaçant les échantillons sous vide O / N. </li><li> Hydrater le film de lipide par addition de 200 ul de 10 mM de bis-tris propane (BTP, pH 7,0) contenant des médicaments solubles dans l&#39;eau (par exemple, des antigènes de protéines). Vortex pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Transférer le contenu du flacon en verre dans un tube de 1,5 ml, placer les échantillons dans un bain d&#39;eau glacée, et soniquer en continu pendant 5 min en utilisant le réglage sur une 125 W / 20 kHz pointe de sonde sonicator intensité de 40%. </li><li> Ajouter 4 pi de dithiothréitol 150 mM (DTT) à chaque lot (concentration de travail de 2,4 mM), vortex et centrifuger brièvement en utilisant une microcentrifugeuse de table. </li><li> Ajouter 40 ul de 200 mM de CaCl2 et mélanger avec la pipette (concentration de travail de 33 mm). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre la réticulation du MPB-contenant des couches lipidiques avec la TNT. </li><li> Centrifuger les échantillons à 20000 g pendant 15 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 200 pi de ddiH 2 O. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.7 et centrifuger à nouveau après le deuxième ddiH 2 O lavage pour éliminer CaCl 2, qui n&#39;a pas réagi de la TNT, et des matériaux de fret non encapsulées à partir du surnageant. </li><li> Préparer 10 mg / ml de 2 kDa polyéthylène glycol-thiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Remettre en suspension chaque échantillon ICMV dans 100 ul de solution de PEG-SH et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Effectuer deux ddiH 2 O lavages (étape 1.7) et remettre le culot ICMV finale dans PBS et conserver à 4 ° C. Avant l&#39;utilisation, mélanger la suspension ICMV, comme des particules peuvent se déposer au fond après un stockage prolongé. </li><li> Pour la caractérisation de particules, retirer une petite quantité aliquote (~ 10%) du ICMVs de chaque lot individuel et diluer à un volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Placer un échantillon unique dans une cellule Zetasizer taille et la mesure des particules, l&#39;indice de polydispersité, et le potentiel zêta des échantillons en utilisant un système DLS et de mesure de potentiel zêta (selon le protocole du fabricant). </li></ol> 2. Examen des ganglions lymphatiques Evacuation des ICMVs fluorescence étiqueté avec la microscopie confocale <ol><li> Préparation de ICMVs chargé avec un antigène marquée par un fluorophore et un colorant fluorescent lipophile <ol><li> Préparer fluorophore protéine à marquage, tel que mis à réagir avec de l&#39;ovalbumine Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, selon les instructions du fabricant. </li><li> Pour préparer ICMVs marqués avec fluorophore dans l&#39;enveloppe lipidique, ajouter lipophile colorant fluorescent, (par exemple, 1,1 dioctadécyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) pendant la préparation du film lipidique (Étape 1.2) à 0,05% quantité de lipides molaire. Pour le film lipidique hydratation (Étape 1.3), tampon d&#39;utilisation contenant l&#39;antigène marquée par un fluorophore, et la synthèse de ICMV complète telle que décrite dans les étapes 1.4 à 1.11. </li></ol></li><li> Administration sous-cutanée de nanoparticules à base de la queue <ol><li> Anesthésier la souris au moyen d&#39;un évaporateur à flux contrôlé équipé d&#39;une chambre d&#39;induction utilizing 3% d&#39;isoflurane et 1,5 l / min de débit d&#39;oxygène selon l&#39;une IACUC a approuvé le protocole de l&#39;animal. Une fois que la souris est inconscient, effectuez les étapes suivantes rapidement avant l&#39;anesthésie se dissipe pour permettre un accès optimal au site de l&#39;injection et de minimiser l&#39;inconfort à l&#39;animal. Vous pouvez également utiliser un cône de nez bon raccord pour maintenir l&#39;anesthésie. Si les souris sont anesthésiées pendant plus de 5 minutes, appliquer du lubrifiant nécessaire de minimiser l&#39;irritation de l&#39;oeil après l&#39;intervention. </li><li> Pulvériser la base de la queue avec 70% d&#39;éthanol pour désinfecter et mouiller la fourrure partie les cheveux mouillés pour exposer une petite parcelle de peau visible, qui peut être utilisé pour visualiser l&#39;aiguille sous la peau. </li><li> Préparez particule suspension injectable contenant la quantité désirée de l&#39;antigène et de l&#39;adjuvant pour 100 ul de dose de vaccination dans du PBS (par exemple, 10 pg d&#39;OVA et 0,3 ug MPLA pour 100 ul de dose d&#39;injection a été utilisé dans le passé de 6,9). </li><li> Dessinez le int suspension de particulesoa seringue avec une aiguille 27-29 G et insérer l&#39;aiguille à la base de la queue (~ 5 mm de la racine des cheveux) avec le biseau vers le haut et injecter 50 pi de la suspension de particules 22. </li><li> Attendez quelques secondes pour que la pression pour égaliser à prévenir tout refoulement excessive et retirez l&#39;aiguille. Répéter l&#39;injection de l&#39;autre côté de la base de la queue de cibler les ganglions inguinaux de drainage. </li></ol></li><li> Préparation des lymphatiques cryosections de noeuds et de l&#39;examen par microscopie confocale. <ol><li> Euthanasier la souris avec CO 2 asphyxie, suivie d&#39;un pneumothorax induite selon un IACUC approuvé le protocole de l&#39;animal. Extrait ganglions inguinaux selon le protocole démontré dans Bedoya 23 et laver le sang en plaçant les tissus dans 1 ml de 4 ° C PBS. </li><li> Absorber le PBS à partir des tissus avec les tissus et les placer dans le tissu cryomoules de tissus (10 x 10 x 5 mm 3) pré-remplie à ras OCT milieu de congélation 24. Aligner geler le tispoursuivre bloc dans l&#39;azote liquide pendant 30 sec. Sinon, placez bloc de tissu sur glace sèche pendant 30 min. Stockez tissu congelé à -80 ° C dans le congélateur. </li><li> Couper des sections de tissus 5-10 um d&#39;épaisseur dans un cryostat fixé à -20 ° C 24. </li><li> Si nécessaire, effectuez l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence, et d&#39;examiner le tissu avec la microscopie confocale comme précédemment démontré 24. </li></ol></li></ol> 3. Suivi Expansion de l&#39;antigène spécifique, la luciférase exprimant T CD8 + après vaccination avec des nanoparticules entier imagerie animale <ol><li> Isolement de OVA257-264 spécifique de cellules de luciférase exprimant CD8 + T de souris transgénique OT-I / Luc <ol><li> Euthanasier une souris transgénique OT-I / Luc avec CO 2 asphyxie et d&#39;induire un pneumothorax selon un IACUC approuvé le protocole de l&#39;animal. Récolter la rate d&#39;une manière stérile en accédant à la cavité péritonéale et soigneusement détacher le tissu du pancréas 23, etdans 5 ml de PBS à 4 ° C + 2% de FBS pour le transfert de la culture de tissus capot. </li><li> Placer la rate sur un tamis en nylon de 70 pm sur un tube de centrifugation conique de 50 ml (jusqu&#39;à 3 rates à la fois). L&#39;utilisation d&#39;un plongeur d&#39;une seringue de 3 ml, broyer les cellules à travers le tamis. </li><li> Laver le piston et la crépine avec PBS + 2% de FBS et le jeter. Porter le volume total à 10 ml / rate dans le tube de 50 ml, prendre un petit échantillon de la suspension cellulaire de compter avec un hémocytomètre, et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. </li><li> Utilisation d&#39;un kit disponible dans le commerce de sélection négative magnétique, isoler la population de cellules T CD8 + en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Après avoir lavé les cellules avec du PBS, compter le nombre de cellules T CD8 + isolées. Afin d&#39;évaluer la pureté des cellules T CD8 + isolées, incuber ~ 20.000-30.000 cellules dans 20 ul de CD16 de souris / anticorps 32 (0,025 mg / ml) pendant 10 min, puis ajouter 20 ul d&#39;anticorps αCD8-APC (0,005 mg / ml) et incuber pendant 30 min. Perform toutes les incubations à 4 ° C dans du PBS + 1% p / v de BSA. Effectuer flux analyse cytométrique 25. </li></ol></li><li> Le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + isolés et la visualisation de leur vaccination l&#39;expansion de poste <ol><li> Effectuer le transfert adoptif de cellules isolées OT-I / Luc T CD8 + naïfs en C57BL / 6 souris par administration de 1 à 10 x 10 5 cellules dans un volume de 200 ul de PBS par voie intraveineuse via la queue injection dans la veine 22 (jour -1). Considérant que la fourrure et de la peau noire correctifs dans C57BL / 6 peut interférer avec le signal de bioluminescence, albinos rasé souris C57BL / 6 sont idéales pour ces études. </li><li> Après une journée (jour 0), administrer le vaccin comme décrit précédemment (section 2.2). </li><li> Administrer 150 mg de luciférine par kg de poids corporel de la souris par voie intraperitoneale dans un volume de 300 ul de PBS. Après 10 min, anesthésier les souris avec l&#39;isoflurane (comme à l&#39;étape 2.2.1) et visualiser les cellules OT-I / Luc T CD8 + par l&#39;acquisition du signal de bioluminescence pendant 5-10 min wvec tout un système d&#39;imagerie animale (IVIS; se référer à Wilson 26 pour des instructions détaillées). Répéter au besoin pour les études longitudinales. </li></ol></li></ol> Les cellules T CD8 + peptide-CMH 4. La coloration tétramère de PBMC pour l&#39;analyse de l&#39;antigène-spécifiques Remarque: La procédure de protocole qui suit peut être effectuée en utilisant soit des souris C57BL / 6 avec des cellules transférées de manière adoptive OT-I / Luc T CD8 + ou des souris C57BL / 6 sans le transfert adoptif. <ol><li> A un point de temps souhaité après la vaccination, de recueillir environ 100 pi de sang (4-6 gouttes) de souris via submandibular technique de saignements 27 dans un tube revêtu de K 2 EDTA et inverser plusieurs fois pour empêcher la coagulation. </li><li> Transférer 100 ul de sang dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml de tampon de lyse, et incuber pendant 2 à 3 min pour éliminer les globules rouges (hématies). Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 xg et retirer le surnageant. Si la pastille encoreppears rouges (indiquant une élimination incomplète des globules rouges), répéter l&#39;étape de lyse avec une brève incubation (&lt;1 min) de tampon de lyse. </li><li> Laver les PBMC restantes avec 1 ml de tampon FACS (PBS + 1% p / v de BSA) et centrifuger à 1500 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension l&#39;échantillon dans 20 pi de CD16 / 32 anticorps de souris (0,025 mg / ml) pour bloquer la liaison non spécifique d&#39;anticorps et à médiation par FcR. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Transfert cellules de microtubes en 4 ml tubes FACS à fond rond. Ajouter 20 pi de H-2K b solution OVA Tétramère-SIINFEKL-PE selon les spécifications du fabricant pour chaque échantillon et incuber pendant 30 min sur la glace. </li><li> Préparer le cocktail d&#39;anticorps (par exemple, αCD8-APC, αCD44-FITC, et αCD62L-PECy7 anticorps (0,005, 0,005 et 0,002 mg / ml concentration, respectivement)). Ajouter 20 ul à chaque échantillon expérimental, et incuber pendant 20 min sur de la glace. Préparer des témoins fluorophores simples par laBeling cellules avec chaque anticorps tétramère ou fluorophore marqués à la concentration indiquée ci-dessus. </li><li> Laver deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension le culot final dans du tampon FACS contenant 2 ug / ml de DAPI. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;analyse par cytométrie en flux (détails et des exemples peuvent être trouvés dans Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer à condition que le coût de production encourus lors de la publication de cet article.

Le protocole fourni dans cet article décrit la synthèse et la caractérisation d&#39;un nouveau système de nanoparticules à base de lipides, appelé ICMVs, et fournit le processus de validation efficacité des formulations de vaccins à base de nanoparticules à induire CD8 + réponses des lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène. Synthèse ICMV est terminée dans tous les état ​​aqueuse, qui est un avantage majeur par rapport aux autres systèmes couramment utilisés polymères de nanoparticules (par ...

Développement traditionnel de vaccin a principalement utilisé l&#39;approche empirique de l&#39;essai-erreur. Cependant, avec le développement récent d&#39;un large éventail de biomatériaux et de découverte de déterminants moléculaires de l&#39;activation immunitaire, il est maintenant possible de concevoir rationnellement des formulations de vaccins avec des indices biophysiques et biochimiques dérivées d&#39;agents pathogènes 1,2. En particulier, diverses plates-formes de distribution de médicaments particulaires ont été examinés en tant que supports de vaccins, car ils peuvent être co-chargés avec des antigènes de sous-unités et agents immunostimulants, protéger les composants du vaccin contre la dégradation, et de renforcer leur collaboration livraison à cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA) résidant dans la lymphe nœuds (LNS), maximisant ainsi la stimulation et l&#39;activation immunitaire 3-5. Dans ce rapport, nous décrivons la synthèse d&#39;un système de nanoparticules &quot;pathogène imitant&quot;, appelé interbilayer réticulé vésicules multilamellaires (ICMVs), qui ont déjà été démontrées comme un platfor de vaccin puissantm pour le déclenchement de solide lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et des réponses immunitaires humorales dans les deux compartiments de tissus muqueux et systémiques 9.6. En particulier, la vaccination avec ICMVs atteint des niveaux d&#39;IgG sérique sensiblement améliorée contre un antigène de la malaria, par rapport à la vaccination avec des adjuvants classiques (par exemple, l&#39;alun et Montanide) 7 et également provoqué des réponses CTL puissantes contre les cellules tumorales et des modèles de provocation virale chez la souris 9. Ici, en utilisant ICMVs comme un système de nanoparticules de vaccin de modèle, nous décrivons des procédés de caractérisation de vaccins nano-formulations, y compris la taille des particules et des mesures de potentiel zêta et le suivi du trafic de particule de ganglions drainants (DLNS) en utilisant l&#39;imagerie confocale des tissus cryosectioned 7. En outre, nous présentons une méthode d&#39;analyse de l&#39;expansion de réponses CTL chez des souris après le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + spécifiques de l&#39;antigène exprimant la luciférase basé 9,10-imagerie-ensemble des animaux. Enfin, nous avons describe coloration tétramère de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour la quantification longitudinal de réponses de cellules T endogènes dans les souris vaccinées avec des nanoparticules 6,9. ICMVs sont une formulation de nanoparticules à base de lipides synthétisés par fusion contrôlée de liposomes multilamellaires à des structures simples, qui sont ensuite stabilisés chimiquement par des groupes de reticulation tête de phospholipides à fonction maléimide à l&#39;intérieur de couches lipidiques avec des agents de reticulation 6 dithiol. Une fois ICMVs sont synthétisés, une petite fraction de nanoparticules peut être utilisée pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta (c.-à-charge de surface des particules) d&#39;un système de diffusion de lumière dynamique (DLS) et un analyseur potentiel zêta. DLS mesure les changements dans la diffusion de lumière dans des suspensions de particules, permettant de déterminer le coefficient de diffusion et la taille hydrodynamique des particules 11. Atteindre la taille des particules cohérente de lot à la synthèse des lots est essentielleétant donné que la taille des particules est un des principaux facteurs qui influent sur ​​le drainage lymphatique de particules de vaccin à DLNS et l&#39;absorption cellulaire ultérieur par des APC 12,13. En outre, le potentiel zêta peut être obtenue par mesure de la vitesse des particules quand un courant électrique est appliqué, ce qui permet la détermination de la mobilité électrophorétique des particules et la surface de la charge particulaire 11. Assurer des valeurs de potentiel zêta de particules cohérentes est important car la charge de surface des particules détermine la stabilité colloïdale, ce qui a un impact direct sur ​​la dispersion de particules pendant le stockage et après l&#39;administration in vivo 14,15. Afin de suivre la localisation des particules à DLNS, ICMVs peuvent être marquées par des fluorophores désirés, y compris les colorants lipophiles et les antigènes de façon covalente-marqués. Après immunisation, les souris peuvent être euthanasiés à différents points dans le temps, DLNS réséqués, cryosectioned, et analysées par microscopie confocale. Cette technique permet de visualiser drai lymphatiquening des deux porte-vaccins de nanoparticules et de l&#39;antigène à DLNS. Les sections de tissu peuvent en outre être colorés avec des anticorps marqués par fluorescence et utilisé pour obtenir plus d&#39;informations, tels que les types de cellules associées à l&#39;antigène et la formation de centres germinatifs comme nous l&#39;avons indiqué précédemment 7. Une fois la synthèse des particules est optimisée et le trafic aux DLNS est confirmé, il est important de valider le déclenchement de l&#39;expansion dans vivo de CTL. Afin d&#39;analyser le déclenchement des cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD8 + en réponse à la vaccination de nanoparticules, nous avons utilisé un antigène modèle, l&#39;ovalbumine (OVA), avec de l&#39;OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) d&#39;un epitope immunodominant de cellule T CD8 +, ce qui permet des analyses immunologiques détaillées des réponses de cellules T spécifiques de l&#39;antigène pour 16,17 initiale de développement d&#39;un vaccin. En particulier, pour interroger la dynamique d&#39;expansion et de la migration des cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD8 +, nous avons généré unmodèle de la double-souris transgénique en traversant la luciférase de luciole exprimant souris transgéniques (Luc) avec des souris transgéniques OT-I qui possèdent des cellules avec le récepteur des cellules T (TCR) spécifique pour SIINFEKL (en association avec H-2K b) T CD8 +. A partir de ces souris OT-I / Luc, exprimant la luciférase, les cellules OT-I T CD8 + peuvent être isolées et préparées pour le transfert adoptif dans des souris C57BL / 6 naïves. Une fois ensemencée, l&#39;immunisation réussie avec des nanoparticules contenant OVA se traduira par l&#39;expansion des cellules T transférées, qui peuvent être suivis en surveillant le signal de bioluminescence avec un ensemble de 9,10 Système d&#39;imagerie par animal. Cette technique d&#39;imagerie du corps entier non invasif a été utilisé avec d&#39;autres antigènes viraux ou tumoraux dans le passé 18 à 20, les processus impliqués dans l&#39;expansion des cellules T dans les tissus lymphoïdes et la diffusion dans les tissus périphériques de manière longitudinale révélateur. Complémentaire à l&#39;analyse des adoptive cellules spécifiques de l&#39;antigène transférés T CD8 +, endógenoles réponses des lymphocytes nous T après la vaccination peut être examiné avec le complexe peptide-complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de dosage de tétramère 21, dans lequel un complexe tétramère peptide-CMH, composé de quatre fluorophore marqués MHC-molécules de classe I chargé avec des epitopes peptidiques, est utilisé à lier le TCR et l&#39;étiquette des cellules T CD8 + d&#39;une manière spécifique à un antigène. L&#39;essai de tétramère MHC-peptide peut être effectuée soit dans des études d&#39;autopsie terminaux afin d&#39;identifier les cellules T CD8 + spécifiques de l&#39;antigène dans les tissus périphériques et lymphoïde ou dans des études longitudinales avec des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sang en série tire. Après coloration des lymphocytes avec un peptide tétramère MHC, la cytométrie en flux analyse est effectuée pour des analyses détaillées sur le phénotype des CTL ou la quantification de leur fréquence chez les cellules T CD8 +.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Les étapes impliquées dans la synthèse de ICMVs sont illustrés sur la figure 1 6. En bref, un film lipidique contenant des médicaments lipophiles ou des colorants fluorescents est hydraté en présence de médicaments hydrophiles. Les cations divalents, tels que Ca2 +, sont ajoutés pour conduire la fusion de liposomes anioniques dans des vésicules multilamellaires. Dithiol agent de reticulation, tel que le DTT, est ajoutée aux lipides à fonction maléimide &quot;discontinu...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K vues.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Recherche

Immunologie et infection

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Test ELISpot interféron-gamma optimisé à mesure les réponses des cellules T dans le modèle cobaye après Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

La Quantification simultanée des anti-vecteur et Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I tétramère coloration après une Vaccination avec un vecteur Viral

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolement des cellules CD8+ T résidentes du rein de souris pour l’analyse de cytométrie de flux

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Un test de cytométrie en flux basé sur l’ADN / Ki67 pour l’analyse du cycle cellulaire des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène chez des souris vaccinées

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...