Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AR-49 419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), et les NIH bourse de formation T90DK70105 (CH).

1. Evaluation des propriétés contractiles et passive de l&#39;ex vivo muscle EDL Les propriétés contractiles et passive du muscle EDL sont évalués ex vivo en utilisant la science Aurora système in vitro test musculaire. Reportez-vous au tableau 1 pour les matériaux et l&#39;équipement. 1.1 Préparation Equipement <ol><li> Assemblez le bain tissulaire d&#39;organes en assurant la oxytube au bain de tissu chemise d&#39;eau. Fixez le bain assemblés à l&#39;appareil musculaire de montage. Branchez la conduite de gaz à l&#39;oxytube. Fixez les conduites de circulation d&#39;eau au bain de tissu chemise d&#39;eau et placer la vanne aiguille dans le drainage de bain. </li><li> Allumer le bain-marie en circulation et régler la température à 30 ° C 7. Attendre 5 PSI (livres par pouce carré) de 95% O 2 -5% CO 2 à circuler à travers le oxytube. Remplir la baignoire avec un tampon de Ringer. Équilibrer la mémoire tampon pour au moins10 min avec un débit de gaz constant par réglage de la vanne oxytube. </li><li> Activer les instruments (stimulateur, système de levier à double mode, et l&#39;interface de signal). Chargez le contrôle de la dynamique musculaire (DMC) de logiciels selon les instructions du fabricant. </li></ol> 1,2 dissection de muscle EDL Toutes les études sur l&#39;animal doit être approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation. <ol><li> Anesthésier la souris avec injection intrapéritonéale de 2,5 pl / g de poids corporel du cocktail anesthésique (reportez-vous à la section matériaux). Tout au long de l&#39;intervention chirurgicale, la profondeur de la sédation a été vérifiée en effectuant un pincement de l&#39;orteil. Un supplément de 10% de la dose initiale anesthésique est administré au besoin pour maintenir l&#39;animal sous anesthésie. Raser les pattes postérieures. Maintenir la température du corps à 37 ° C avant la procédure de dissection en plaçant la souris sur un coussin chauffant. La température du corps est contrôlé en mesurant constamment la tempéra rectaleure en utilisant une sonde thermique. </li><li> Placez le dos de la souris sur la carte dissection (figure 1). Décoller la peau des pattes pour exposer les muscles des membres postérieurs. Fixer la jambe sur le bloc de Sylgard utilisant deux repères, une couturière dans le pied et l&#39;autre dans le muscle gracilis. Placer une lampe chauffante au-dessus du corps de la souris pour maintenir la température corporelle à 37 ° C. Constamment superfuse tous les muscles exposés avec un tampon de Ringer. Égoutter l&#39;excès de tampon par une ligne vide. </li><li> Exposer le tendon distal TA et le ligament extenseur sous un stéréomicroscope en disséquant la peau vers le pied. Retirez délicatement le fascia recouvrant le muscle TA. Couper le ligament extenseur pour libérer le tendon distal TA. </li><li> Couper le tendon distal TA et l&#39;utiliser pour décoller le muscle TA. Retirez délicatement le muscle TA à son attache proximale. Placer un petit morceau de coton imbibé de tampon Ringer à côté de l&#39;EDL à absorber des saignements causés par la rupture de la vascularisation du muscle TA. Utilisez la ligne de vide pour enlever l&#39;excès de tampon et de sang. </li><li> Attacher un noeuds doubles crochets suivis d&#39;un noeud en utilisant une boucle de fil de suture en soie pain à la jonction du tendon du muscle (MTJ) du muscle EDL distale (figure 2). Faire une incision dans la partie distale du muscle biceps fémoral pour exposer le muscle EDL proximale. Répétez le même ensemble de noeuds (figure 2) à la MTJ du tendon proximal EDL. Fixez le crochet de bras de levier soit à la proximal ou distal des noeuds avec un double nœud carré à l&#39;aide de la ligne de suture même. Couper la ligne de suture restant. </li><li> Couper le tendon proximal EDL supérieur au noeud de suture proximale. Soulevez le muscle EDL avec le crochet et couper la vascularisation sous le muscle. Couper le tendon distal EDL inférieur au noeud de suture distale de retirer le muscle EDL dans le membre postérieur. Couvrir le membre postérieur exposée avec un morceau de coton imbibé de tampon Ringer. </li><li> Attachez le crochet au bras de levier. Aligner verticalement le muscleentre deux électrodes. Fixer la ligne de suture distale au poste fixe. Soulevez le bain de tissu de submerger le muscle dans un tampon de Ringer. Régler la tension de repos à 1,0 g en utilisant la platine de translation à double grossière / fine et permettre au muscle de se stabiliser pendant au moins 10 min. </li></ol> 1.3 Mesure des propriétés contractiles et passive du muscle EDL Utilisez le Tableau 2 pour régler les paramètres dans le logiciel de DMC pour chacune des mesures suivantes. Analyser les données en utilisant l&#39;analyse musculaire dynamique (DMA) du logiciel. 1.3.1 Mesurer les propriétés contractiles du muscle EDL <ol><li> Stimuler le muscle EDL trois fois à 150 Hz avec 60 secondes à part pour stabiliser le muscle 8. </li><li> Stimuler le muscle EDL à différentes tensions de repos afin de déterminer la longueur optimale (Lo). La longueur optimale est la longueur à laquelle la tension musculaire se développe contraction maximale. Permettre au muscle dedétendez-vous pendant 2 min. </li><li> Régler la tension de repos à Lo. Mesurer la force musculaire à la stimulation transcutanée unique. Déterminer la force contractile absolue (Pt), le temps de la tension de crête (TPT) et le temps de relaxation de la moitié (½ RT) du Pt. Permettre au muscle de se détendre pendant 2 min. </li><li> Régler la tension de repos à Lo. Mesurer la force musculaire tétanique générée à des fréquences de stimulation différents (50, 80, 100, 120, 150 et 200 Hz). Déterminer la force maximale absolue musculaire tétanique (Po) lorsque la force musculaire atteint le maximum. Mesurer la TPT et ½ RT du Pô 9. </li><li> Permettre au muscle de se détendre pendant 5 min. Régler la tension de repos à Lo. Appliquer 10 cycles de contractions excentriques avec 2 minutes de repos entre les cycles. Calculer la perte de la force relative de la Po après chaque cycle de contraction excentrique. </li><li> Détachez le muscle EDL à partir de l&#39;appareil et couper les tendons sur le site de suture. Déterminer le poids du muscle humide et calculer la surface de section musculaire (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Mesure des propriétés passives du muscle EDL <ol><li> Disséquer le muscle controlatéral EDL et le joindre à l&#39;appareil comme décrit dans la section 1.2, les étapes 2 à 7. </li><li> Sous réserve de l&#39;EDL à un protocole en six étapes d&#39;étirement où le muscle est tendu à 160% Lo avec un incrément de 10% Lo. Analyser le 6 Profil contrainte-déformation. </li><li> Évaluer la propriété visqueuse du muscle EDL en mesurant le taux de relaxation des contraintes (SRR) dans les délais suivants après l&#39;étirement et la tenue du muscle à 10% Lo: un pic à 0,1 s post-pic (pp), de 0,1 à 0,2 s pp, de 0,2 à 0,5 s pp, de 0,5 à 1 s et p allant de 1 à 1,5 s pp </li><li> A la fin de l&#39;étude, euthanasier la souris par dislocation cervicale et / ou la décapitation alors que la souris est toujours sous anesthésie. Détachez le muscle EDL à partir de l&#39;appareil et couper les tendons sur le site de suture. Déterminer le poids du muscle humide et calculer le muscle croix soizone ctional (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluation des propriétés contractiles du muscle TA In situ Les propriétés contractiles du muscle TA sont mesurés à l&#39;aide de la science Aurora dans le système musculaire test in situ. Reportez-vous au tableau 1 pour les matériaux et l&#39;équipement. 2.1 Préparation Equipement <ol><li> Chauffer le stade animal thermo-contrôlé à 37 ° C en utilisant la circulation de l&#39;eau dans la baignoire. </li><li> Activer les instruments (stimulateur, système de levier à double mode, et l&#39;interface de signal). Chargez le logiciel DMC selon les instructions du fabricant. </li></ol> 2.2 Préparation du muscle TA pour la mesure in situ de force <ol><li> Anesthésier la souris, le raser des membres postérieurs et exposer le muscle TA comme décrit dans les étapes 1 à 3 de la section 1.2. </li><li> Un double nœud carré autour de la rotule usi ligamentun fil de suture en soie ng pain. Un double nœud carré suivie d&#39;un nœud de boucle à la MTJ du muscle TA distale (figure 2), attachez un autre noeud double carré en laissant une boucle de ~ 10 mm du nœud tendon distal TA en utilisant la ligne de suture même. Placer le deuxième noeud double carré sur le côté de la boucle. </li><li> Retirer les épingles de la patte arrière et positionner l&#39;animal couché. Exposer le muscle biceps fémoral. Faire une incision sur la ligne médiane de révéler le nerf sciatique. Un double nœud carré autour de l&#39;extrémité proximale du nerf sciatique. Couper un côté des lignes de suture et couper le nerf supérieur du nœud. Doucement, tirez sur le nerf sciatique vers le genou en utilisant la ligne de suture et d&#39;effacer le tissu conjonctif environnant libre de ~ 5 mm de sa longueur. Ne pas étirer le nerf au cours de cette procédure et constamment superfuse le nerf avec un tampon de sonnerie. </li><li> Préparer le muscle TA controlatéral comme décrit dans les étapes 1 à 3. Couvrez un exposé du membre postérieur avec un morceau de Ritampon imbibé nger de coton. Constamment superfuse les deux membres postérieurs avec pré-chauffée (37 ° C) tampon Ringer. Retirer l&#39;excès de tampon par une ligne vide. </li><li> Placez l&#39;animal en décubitus ventral sur la plate-forme animale. Fixez le support de serrage genou à la plate-forme animale et fixer les deux genoux à la broche métallique avec doubles noeuds carrés en utilisant les lignes de suture du ligament patellaire. Pin les deux pieds sur le bloc Sylgard utilisant des broches de couturière. Fixez la plate-forme animale sur la scène thermo-contrôlé. Positionner la lampe de chaleur pour maintenir la température corporelle des animaux noyau à 37 ° C. </li><li> Fixez le porte-électrode à la plate-forme d&#39;animaux et de jeter le nerf sciatique sur l&#39;électrode en utilisant la ligne de suture. Conserver l&#39;électrode à l&#39;écart des muscles des membres postérieurs. Couper le tendon TA distale du membre postérieur à découvert sur le site de suture MTJ. Attachez la boucle de suture tendon distal TA au crochet de bras de levier. Couvrir le muscle du membre postérieur exposée avec du coton imbibé d&#39;un tampon Ringer chaud de. </li></ol><ol><li> Utilisez le Tableau 2 pour régler les paramètres dans le logiciel de DMC. Suivre le même protocole décrit dans la section 1.3.1 pour déterminer les propriétés contractiles du muscle TA. Analyser les données en utilisant le logiciel DMA. </li><li> Après la mesure des propriétés contractiles, détachez la boucle de suture tendon distal TA du crochet bras niveleur. Retirer le muscle TA. Déterminer le poids du muscle humide et calculer la CSA 10. </li><li> Mesurer les propriétés contractiles du muscle TA controlatéral suivant les étapes 1 à 3 décrites ci-dessus. Euthanasier la souris selon les directives institutionnelles à la fin de l&#39;étude. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, nous avons illustré tests physiologiques pour mesurer les propriétés contractiles et passive du muscle EDL et les propriétés contractiles du muscle TA. Une préoccupation majeure dans les études de physiologie du muscle est l&#39;oxygénation du muscle cible. Pour les grands muscles (comme le muscle TA), l&#39;approche in situ est préférée parce que la diffusion de l&#39;oxygène à partir du tampon de Ringer peut pas atteindre le centre du muscle dans un test in vitro. Dans l&#39;approche in situ ne perturbe pas l&#39;approvisionnement normal du sang et de l&#39;hypoxie associée effets artificiels sont évités. L&#39;EDL est l&#39;un des muscles les plus couramment utilisés dans l&#39;étude de la physiologie. Une oxygénation adéquate de l&#39;ensemble du muscle peut être obtenue dans un système in vitro en raison de la petite taille du muscle. En outre, le système in vitro fournit un environnement clos à manipuler les concentrations d&#39;ions (Ca 2 +, Na + et K +) et chimicochimiques (ATP et glucose) qui sont nécessaires pour la génération de la force musculaire optimale. Ce système offre une excellente occasion d&#39;étudier l&#39;effet de ces variables sur la production de force. La mesure précise des propriétés contractiles et passive du muscle membres est essentielle pour étudier la fonction des muscles squelettiques. Changements caractéristiques de ces propriétés sont souvent considérés comme les maîtres mots de maladies musculaires différents. Les variations de ces paramètres sont également des indicateurs importants pour déterminer si un traitement expérimental est efficace ou non.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel </td><td> Fabricant </td><td></td><td> Spécifications et commentaires </td></tr><tr><td> Tissus d&#39;organes bain </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Bain de tissu de la chemise d&#39;eau (Cat # 158351-LL), tube disperseur oxygène (Cat # 160192), vanne Luer (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Bain de circulation d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélange de gaz </td><td> Airgas nationale, Charlotte, Caroline du Nord, Etats-Unis </td><td></td><td> 95% de O 2 et 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction appareil de dosage </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Le système se compose d&#39;un stimulateur (Modèle # 701A), un système de levier bi-mode (Modèle # 300C ou 305C), une interface de signal (Modèle # 604B) et un test apreils (Modèle # 800A) pour monter verticalement bain d&#39;organe tissus </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction du logiciel d&#39;analyse </td><td></td><td></td><td> Contrôle dynamique musculaire (DMC) et le logiciel de contrôle dynamique du muscle analyse des données (DMA) du logiciel </td></tr><tr><td> Cocktail anesthésie souris mélangés dans NaCl à 0,9% </td><td> Reportez-vous aux directives institutionnelles </td><td></td><td> Kétamine (25 mg / ml), la xylazine (2,5 mg / ml) et d&#39;acépromazine (0,5 mg / ml). Tout au long de la procédure chirurgicale, un supplément de 10% de la dose initiale peut être nécessaire pour garder un animal sous anesthésie. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Instrument de précision mondiale </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Un conseil sur mesure dissection plexiglas </td><td> Dans la maison conçue </td><td></td><td> Reportez-vous à la figure 1 </td></tr><tr><td> Lampe chauffante </td><td> Lighting Company tenseur,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 Témoin Watt pour maintenir la chaleur de la souris lors de la dissection </td></tr><tr><td> Ringer tampon </td><td> Les produits chimiques sont achetés chez Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td> Composition en mM: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO 4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 glucose CaCl 2 (Cat # C79) et 10 (Cat # D16). Dissoudre et mélanger des produits chimiques individuellement dans l&#39;ordre indiqué ci-dessus. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stéréo microscope à dissection </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Outils de dissection </td><td> Outils Fine Science, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Forceps, ciseaux grossiers, grossiers pinces fines (droite et angle de 45 °) </td></tr><tr><td> Suture en soie tressée # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Un crochet sur mesure en acier inoxydable </td><td> Petites pièces, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; long S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diamètre) pour capteur de force 305C ou 2,5&#39;&#39; de long S / S 304V (0,012&#39;&#39; de diamètre) pour le capteur 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> Dans le système musculaire test in situ fonction </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Le système (809B, dans un appareil de souris in situ) sont constitués d&#39;un stimulateur (modèle n ° 701B), un système de levier à double mode (modèle n ° 305C), une interface de signal (Modèle # 604A) et un dispositif de thermo semelle contrôlée (Modèle 809A # ) </td></tr><tr><td> Dans le muscle in vitro fonction du logiciel d&#39;analyse </td><td> Aurora scientifique, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Contrôle dynamique musculaire (DMC) et le logiciel de contrôle dynamique du muscle analyse des données (DMA) du logiciel </td></tr><tr><td> Une plate-forme sur mesure TA animaux d&#39;essai </td><td> Dans la maison conçue </td><td></td><td> Reportez-vous à la figure 2 </td></tr><tr><td> Un crochet sur mesure en acier inoxydable </td><td> Petites pièces, Inc </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; long S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diamètre) </td></tr><tr><td> Custom-made électrodes de platine 25G </td><td> Entreprises Chalgren, Gilroy, Californie </td><td></td><td> Souder deux fils&#39;&#39; 0.016 platine d&#39;épaisseur à deux fils électriques 24G </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Matériaux et équipements.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Les mouvements du corps sont principalement fournis par la fonction mécanique du muscle squelettique. Muscle squelettique est composé de faisceaux de fibres musculaires de nombreux qui sont gainées par voie intramusculaire tissus conjonctifs. Chaque myofibrille contient plusieurs myofibrilles qui s&#39;exécutent longitudinalement le long de la longueur de la fibre musculaire. Myofibrilles sont l&#39;appareil contractile du muscle et ils sont composés d&#39;unités répétées contractiles appelées sarcomères. Une unité sarcomère contient des filaments d&#39;actine et de la myosine qui sont espacées par des disques à Z et de protéine titine. Fonction mécanique du muscle squelettique est définie par les propriétés contractiles du muscle et passive. Les propriétés contractiles sont utilisées pour caractériser la valeur de la force générée lors de la contraction musculaire, le temps de génération de force et de temps de relaxation musculaire. Tout facteur qui affecte la contraction musculaire (tels que l&#39;interaction entre les filaments d&#39;actine et de myosine, l&#39;homéostasie du calcium, rapport ATP / ADP, etc) influe sur la prope contractileles parties prenantes. Les propriétés passives désignent les propriétés élastiques et visqueuses (rigidité et la viscosité) du muscle en l&#39;absence de contraction. Ces propriétés sont déterminées par la extracellulaire et les composants intracellulaires structurelles (comme titine) et les tissus conjonctifs (collagène principalement) 1-2. Les propriétés contractiles et passive sont deux aspects inséparables de la fonction musculaire. Par exemple, flexion du coude est réalisé par contraction de muscles dans la région antérieure de la partie supérieure du bras et étirement passif des muscles de la loge postérieure de la partie supérieure du bras. Pour vraiment comprendre la fonction musculaire, les deux propriétés contractiles et passive doit être étudiée. Les propriétés contractiles et / ou passive mécaniques du muscle sont souvent compromis dans les maladies musculaires. Un bon exemple est la myopathie de Duchenne (DMD), une maladie du dépérissement musculaire sévère causée par une carence en dystrophine 3. La dystrophine est une prote du cytosqueletteà qui stabilise la membrane des cellules musculaires (sarcolemme) pendant 4 contraction musculaire. En l&#39;absence de dystrophine, le sarcolemme est endommagé par la force de cisaillement générée lors de la transmission de force. Cette membrane déchirer déclenche une réaction en chaîne qui conduit à la mort cellulaire musculaire et la perte de la machinerie contractile. En conséquence, la force musculaire est réduite et fibres musculaires mortes sont remplacées par des tissus fibreux 5. Ce changement augmente tard 6 raideur musculaire. La mesure précise de ces changements fournit un guide important pour évaluer la progression de la maladie et de déterminer l&#39;efficacité thérapeutique du nouveau gène / cellule / interventions pharmacologiques. Ici, nous présentons deux méthodes pour évaluer les propriétés contractiles et passive mécaniques du muscle long extenseur des orteils (EDL) muscle et les propriétés contractiles du muscle tibial antérieur (TA) du muscle.

Les résultats suivants sont une représentation de nos rapports précédents 6,9. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. Tableau 3 montre les propriétés morphométriques du muscle EDL dans BL10 normale et de la dystrophine-déficientes (mdx) souris à 4 à 6 mois d&#39;âge. La figure 4 montre représentatives des propriétés contractiles et passive de la EDL à partir BL10 et mdx souris. Les propriétés contractiles du muscle EDL sont décrits par les termes suivants, y compris le spécifique (force absolue divisée par la CSA) force contractile (figure 4A), spécifique la force tétanique maximale (figure 4B), TPT et ½ RT de la force tétanique maximale absolue (figure 4C et D). Le TPT et ½ RT peut également être calculer à partir de la force de contraction absolue. Le profil de contrainte-déformation (figure 4E) et SRR (Figure 4F) unre utilisé pour décrire les propriétés passives du muscle EDL. Absence de dystrophine a un impact significatif sur les propriétés contractiles et passive du muscle EDL 6,9. Tic précis et forces tétaniques sont significativement réduite dans le muscle mdx EDL. Le TPT est nettement plus rapide alors que la RT ½ est significativement plus lente dans le muscle mdx EDL. Le profil de contrainte-déformation suggère que la rigidité est significativement augmentée dans le muscle mdx EDL. Le muscle mdx EDL donne aussi une force de résistance significativement plus élevé (stress passive) avant d&#39;atteindre le pic de contrainte, tandis que les contraintes post-pic diminuent beaucoup plus rapidement. En outre, le RRF était significativement plus élevée dans le muscle mdx EDL par rapport à celle du muscle EDL BL10. L&#39;analyse statistique La signification statistique entre les deux groupes est analysée par le test t de Student. Pour sSTATISTIQUES importance parmi plusieurs groupes, One-way ou analyse de variance à deux voies suivies par une analyse post hoc de Bonferroni est recommandé d&#39;utiliser le logiciel SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC). Différence est considérée comme significative lorsque p &lt;0,05. Tableau 1. Matériaux et équipements. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Expérience </td><td class="jove_content_small"> La tension au repos (gramme) </td><td class="jove_content_small"> Fréquence d&#39;impulsion (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Largeur d&#39;impulsion (ms) </td><td class="jove_content_small"> Durée de stimulation (ms) </td><td class="jove_content_small"> Longueur d&#39;étirement </td><td class="jove_content_small"> Extensible (ms) </td><td class="jove_content_small"> Taux d&#39;allongement </td><td class="jove_content_small"> Commentaires </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. L&#39;évaluation des propriétés contractiles et passive du muscle EDL ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Mesurer les propriétés contractiles du muscle EDL </td></tr><tr><td> 1. Réchauffer </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Reposer les muscles pendant 60 secondes entre chaque stimulus. Ces contractions tétaniques préliminaires stabiliser le muscle pour les mesures suivantes. </td></tr><tr><td> 2. Longueur musculaire optimale (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 et 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 30 secondes entre chaque stimulus. Mesurer la longueur musculaire optimale en utilisant un compas numérique. </td></tr><tr><td> 3. Simple twitch vigueur (Pt) </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. La force musculaire tétanique </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 et 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 1 minute entre chaque stimulus. Déterminer la fréquence qui génère le maximum absolu tétanique force (Po). </td></tr><tr><td> 5. Contraction excentrique </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td> Utiliser la fréquence qui génère la force maximale tétanique (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> Lo 10% </td><td> dernière 200 ms de la durée de stimulation </td><td> 0.5 Lo / s </td><td> Répétez la contraction excentrique pendant 10 cycles avec 2 minutes de repos entre les cycles. </td></tr><tr><td> 6. CSA du muscle EDL </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masse musculaire (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 est la densité musculaire et 0,44 est la longueur du muscle EDL de fibres à Lo rapport. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Mesure des propriétés passives du muscle EDL </td></tr><tr><td> 1. Six-étape d&#39;étirage protocole </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Répétez le protocole d&#39;étirement avec un incrément de 10% jusqu&#39;à 160 Lo Lo% est atteint. Alow 1,5 sec entre les cycles d&#39;étirement. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Régler la tension de repos à Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR est calculé en divisant la différence de la contrainte avec le temps écoulé entre deux points dans le temps dans un laps de temps. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2.3 Mesure des propriétés contractiles du muscle TA </td></tr><tr><td> 1. Réchauffer </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Reposer les muscles pendant 60 secondes entre chaque stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Longueur musculaire optimale (Lo) </td><td> 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 et 7,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permettre au muscle de se détendre pendant 30 secondes entre chaque stimulus. Mesurer la longueur musculaire optimale en utilisant un compas numérique. </td></tr><tr><td> 3. CSA du muscle TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masse musculaire (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 est la longueur du muscle à fibres TA Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Paramètres pour l&#39;évaluation des propriétés mécaniques des muscles EDL et TA. <table border="1"><tbody><tr><td> Souche </td><td> Age (mois) </td><td> Poids corporel (g) </td><td> EDL poids (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Propriétés morphométriques du muscle EDL. *, La valeur mdx souris est significativement différent de celui de l&#39;âge des souris BL10 identifié. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figure 1. Un schéma de principe du conseil sur mesure souris dissection. Le conseil dissection est faite à partir d&#39;un ½ pouce d&#39;épaisseur en plexiglas et a été fabriqué à l&#39;atelier institutionnel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figure 2. Une série d&#39;images numériques montrant les étapes de faire un nœud double carré suivie d&#39;un nœud de boucle à la MTJ. Asterisk, l&#39;EDL; Arrow, le tendon distal du muscle EDL. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figure 3. Un diagramme schématique de la plate-forme sur mesure pour essai de fonction TA situ musculaire. La plate-forme animale en plexiglas et le support en acier inoxydable genou ont été conçus pour monter sur le 809B dans un appareil de souris in situ. *, Tige en acier inoxydable (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR); #, porte-électrode universelle (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, tige de fixation d&#39;électrode (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); ** Sylgard bloc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figure 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figure 4. Les résultats représentatifs pour les propriétés contractiles et passive du muscle EDL. Les propriétés contractiles du muscle EDL sont caractérisés par la force contractile spécifique (A), la force spécifique tétanique (B), le temps de la tension de crête (C) et le temps de relaxation de la moitié (D). Les propriétés passives du muscle EDL sont évalués par le profil de contrainte-déformation (E) et la SSR. *, Souris mdx sont significativement différents de appariées selon l&#39;âge BL10 souris.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice at JoVE.com

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changements dans les membres musculaires contractiles et passive propriétés mécaniques sont d&#39;importants biomarqueurs pour les maladies musculaires. Ce manuscrit décrit tests physiologiques pour mesurer ces propriétés dans l&#39;extenseur commun des orteils murin et jambier muscles antérieurs.

Evaluation de la fonction musculaire du muscle long extenseur des orteils<em&gt; Ex vivo</em&gt; Et du jambier antérieur<em&gt; In situ</em&gt; Chez la souris

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K vues.  University of Missouri. Changements dans les membres musculaires contractiles et passive propriétés mécaniques sont d'importants biomarqueurs pour les maladies musculaires. Ce manuscrit décrit tests physiologiques pour mesurer ces propriétés dans l'extenseur commun des orteils murin et jambier muscles antérieurs.

Vidéo: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Recherche

Biologie

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procédures pour Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriétés contractiles musculaires squelettiques

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Blessure à la gorge aortique murine: une efficacité<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de prolifération des cellules musculaires lisses et fonction endothéliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...