This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Éthique nationaux et institutionnels appropriés doivent être obtenus avant de procéder à des expérimentations animales. 1. Suppression des EDL musculaires et nerveuses <ol><li> Peser et anesthésier profondément une souris adulte avec isofluorane inhalée à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur avec 5% isofluorane majoré d&#39;un taux de 1,5 L / min d&#39;oxygène flux ou une cloche de verre trempé isofluorane coton sur le fond. </li><li> Assurez-vous que la souris est profondément anesthésié et ne répond pas à une pincée de pointe. Décapiter rapidement à l&#39;aide de grands ciseaux pointus ou une guillotine. </li><li> Faire une coupe médiane ventrale à travers les côtes à l&#39;aide de ciseaux et enlever les organes internes. </li><li> Peau de l&#39;animal en le saisissant par la peau du cou et le tirant passé les pieds. </li><li> Retirez les jambes en coupant au-dessus des hanches et placer les jambes à la peau dans un plat avec frais (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% de CO 2) faible taux de calcium, de magnésium de haute bicarbonate tamponnée contai de solution salinetion en mM: 128 NaCl, KCl 1,9, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl2, 6,5 MgSO 4, et 10 glucose (pH de 7,4 ± 0,05) 16. Le faible taux de calcium, solution de haute magnésium inhibe la transmission synaptique lors de la dissection. </li><li> Placez les jambes côté dorsal dans le plat et épinglez les jambes et les hanches vers le bas en utilisant des aiguilles ou des épingles insectes ainsi que les articulations du genou et de la cheville sont à un angle de 90 °. Placer une broche à chaque extrémité du pied et une tige sur chacune de la partie antérieure et postérieure des cuisses pour maintenir le tissu en place. </li><li> Utilisation Castroviejo ciseaux à ressort, soulevez la couche supérieure du muscle au niveau des cuisses et de faire une ligne médiane couper pour exposer le nerf sciatique directement ci-dessous. Le nerf sciatique est situé juste en dessous de la couche musculaire haut et passe au-dessus du fémur de sa sortie près des hanches jusqu&#39;à ce qu&#39;il se ramifie en sciatique poplité externe et le nerf tibial juste avant l&#39;articulation du genou. </li><li> Retirer le muscle au-dessus du nerf sciatique jusqu&#39;à la point à laquelle les plongées nerf de la branche péroniers profondément dans le muscle fléchisseur de l&#39;hallux (FHL) est visible. </li><li> En utilisant # 55 forceps, disséquer le tissu conjonctif autour de la branche péronier à le libérer des jumeaux et soléaire, qui sont sur le côté interne du tibia. Couper les tendons des jumeaux et soléaire et les enlever soigneusement sous le nerf. </li><li> Retirer le muscle superficiel sur le côté latéral du tibia pour exposer trois faisceaux tendineux distinctes à l&#39;articulation de la cheville-de dedans en dehors: FHL, EDL, et jambier antérieur (TA), avec l&#39;EDL caché sous la TA. </li><li> Couper le tendon TA à l&#39;articulation de la cheville, soulevez le TA et loin de l&#39;EDL, et couper le muscle près du genou pour le supprimer. </li><li> Couper le tendon FHL à la cheville et soulevez-le pour atteindre la zone où le nerf pénètre dans la FHL. Coupez juste en dessous de ce point et retirer ~ 2/3 du muscle FHL. </li><li> Couper le nerf sciatique au plus près de l&#39;articulation de la hanche que possible et dépouiller doucement toutes les branches nerveuses, sauf pour la branche tibial antérieur. </li><li> Couper les tendons EDL à la fois les chevilles et les articulations du genou à l&#39;aide de grands ciseaux à ressort. </li><li> Avec des ciseaux pointus, retirer le permis de conduire Plus, la FHL restant et le nerf du tissu environnant en coupant à travers l&#39;os du tibia au genou et à mi-chemin à travers la cuisse. Coupez le tibia os restant de sorte que tout l&#39;EDL, une partie de la FHL et les nerfs restent. </li></ol> 2 Montage de l&#39;EDL et nerveuse dans le bain de tissu (figure 1A) <ol><li> Avant le début de l&#39;expérience, la préparation du bain de tissu. Toujours perfuser le bain avec oxygénée (100% de O 2) de fluide interstitiel synthétique (SIF) contenant (en mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl2, 9,5 NaC 6 H 11 O ( le gluconate de sodium), 5,5 glucose, saccharose 7,5, et 10 -2 N-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-etacide hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Un taux de 15 à 30 ml / min est recommandée. Montré est un bain disponible dans le commerce de 25 ml de capacité avec deux électrodes de stimulation fixe au fond de la baignoire, un poste de tissu monté et un support pour un contrôleur de la force et de la longueur (dimensions de bain d&#39;environ 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; pour les spécifications voir le tableau des Matériaux / Équipement). </li><li> Utilisez le tissu FHL restant à traiter le muscle-nerf isolé et placez-le dans le bain de tissu. Placer une petite pièce de Sylgard sur le fond de la boîte et en utilisant une broche à travers le tissu insecte FHL restant à stabiliser le muscle. </li><li> Utilisez 6-0 sutures de soie à nouer les deux tendons et fixer une extrémité au poste de tissu et l&#39;autre sur le bras de levier de la force et le contrôleur de longueur (voir le tableau des Matériaux / Équipement pour les spécifications). Utiliser la plus petite longueur de fil de suture qui est pratique. Retirer la goupille d&#39;insectes et Sylgard après avoir lié les tendons. REMARQUE: Pour faciliter facileconnexion au bras d&#39;un levier petit morceau de fil peut être courbé dans une &quot;j&quot; en forme de crochet et fixée sur le bras de levier avec de l&#39;époxy. Le fil de suture peut alors être lié à la place du fil enfilé dans le petit trou sur le bras de levier. </li><li> Assurez-électrodes d&#39;aspiration de 16 SA verre en utilisant d&#39;abord un extracteur micropipette de verre (chaleur = 286, Pull = 0, vitesse = 150, Temps = 200); briser la pointe arrière et la main broyer sur une pierre à aiguiser jusqu&#39;à il ya environ 3 mm cône. Faire fondre la pointe en utilisant un microforge à la pointe souhaitée diamètre intérieur compris entre 10 à 100 um en fonction de la zone de nerf on souhaite échantillonner (voir les figures 1B-1C pour électrode schématique et Table des Matières / Équipement pour des informations). </li><li> Remplir une électrode d&#39;aspiration de verre préfabriqué pour le fil d&#39;argent interne avec SIF. </li><li> Aspirer la fin de la coupe de nerf dans l&#39;électrode et la connexion au port positive d&#39;un amplificateur différentiel. Enveloppez l&#39;électrode avec de l&#39;argent chloréfil qui se connecte à l&#39;orifice de la headstage négatif. Rez de bain SIF en exécutant un deuxième fil chlorée d&#39;argent de la salle de bain sur le port au sol de l&#39;headstage. Aussi la terre la tubulure de perfusion de la cage de Faraday en plusieurs points afin d&#39;atténuer le bruit électrique introduit par les pompes à perfusion. </li><li> Stimuler le muscle par l&#39;intermédiaire des électrodes montées de chaque côté du muscle dans le bain de tissu pour provoquer une contraction de la secousse. En variante placer une électrode de stimulation à la fin de la coupe de nerf. Augmenter la tension de stimulation jusqu&#39;à ce qu&#39;une force de contraction de pic est observé, puis augmenter la tension de 15% pour atteindre la tension supramaximale (0,5 ms de largeur d&#39;impulsion). Continuer les contractions de contraction à la tension supramaximale, avec un repos de 10 secondes entre les deux, mais de faire varier la longueur du muscle jusqu&#39;à ce qu&#39;une force de contraction maximale est atteinte pour déterminer la longueur optimale (L o) du muscle. Toutes les rampes de longueur et les vibrations vont commencer avec le muscle à ce lenge. </li><li> Laisser la préparation nerf-muscle de rester dans le bain pendant au moins une heure avant la collecte de données ultérieure pour permettre au tissu d&#39;atteindre la température du bain et de la transmission synaptique normale de récupération suivant dissection dans une solution faible de calcium. </li><li> Pour collecter des données, à une température autre que la température ambiante, placer une sonde de température dans le bain de tissu près du muscle. Porter lentement le bain à la température de l&#39;eau chauffée par pompage à travers la plaque de base de bain de tissu. Enveloppez argile coussins chauffants au micro-ondes dans le réservoir SIF pour aider à maintenir une température constante. </li></ol> 3 Collecte des données <ol><li> Pour identifier un afférente comme un afférent de la broche, enregistrer l&#39;activité neuronale pendant les contractions répétées de contraction produites par une tension de stimulation supramaximale 0,5 msec délivré une fois par seconde. REMARQUE: Muscle afférences de la broche doivent pause au cours de la contraction de 18,19 contraction (figure 2). </li><li> Utilisez dalogiciel d&#39;acquisition ta appliquer les changements de longueur à des vitesses différentes et de différentes longueurs. Utilisez un script personnalisé pour automatiser cette tâche (voir informations supplémentaires pour une capture d&#39;écran du script et des directives sur la façon de personnaliser les données étendues). Appliquer tronçons de rampe et de maintien de 4 sec à des longueurs d&#39;étirement de 2,5%, 5% et 7,5% L o et la vitesse d&#39;étirement de 20, 40, ou 60% de L o / sec 15. NOTE: Voir le mode d&#39;emploi de la force spécifique et un contrôleur de longueur pour nécessaire facteur de conversion tension-millimètre. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, de déterminer la santé des muscles à 24 ° C en utilisant des contractions tétaniques isométriques maximales (500 trains ms, 120 Hz fréquence des trains, 0,5 ms largeur d&#39;impulsion, la tension supramaximal). Comparer la force contractile pic de valeurs précédemment rapportées (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Le but de cet article est de décrire une méthode pour enregistrer à partir des afférences du fuseau musculaire dans une préparation souris muscle-nerf isolé. Nous avons trouvé que les afférences de la broche de la souris réagissent de manière similaire à étirer que celles de rats, les chats et les humains 15 et d&#39;autres laboratoires ont utilisé des souris comme organismes modèles pour étudier les neurones sensoriels à la fois dans le muscle et la peau in vitro (par exemple 3,13) . Muscle afférences sensorielles peuvent être enregistrées pendant au moins 6-8 heures à la fois 24 ° C et 34 ° C. Afin de minimiser la manipulation du EDL et nerveuse, utiliser la partie restante de la FHL à manipuler le tissu chaque fois que possible. Après la dissection, attendre au moins 1 heure pour commencer la collecte de données pour permettre le tissu s&#39;équilibrer à la température du bain et de la transmission synaptique normale pour récupérer. Auparavant, la santé des muscles ont été vérifiées sur un sous-ensemble de muscles utilisés dans cette préparation en déterminant que la contra maximale tétaniquectile active générée par les muscles est similaire à celle rapportée par d&#39;autres au début et à la fin de l&#39;expérience 15. Muscle afférences de la broche ont été identifiés fonctionnellement dans cette préparation par la recherche d&#39;une pause caractéristique à tirer en réponse à la contraction contraction (figure 2) ainsi que la fréquence augmente instantanées attendus en réponse aux changements de longueur (Figure 3). Dans notre expérience, la plupart des afférences qui tirent dans des conditions de contrôle sont les afférences du fuseau musculaire. La longueur du nerf retenu dans cette préparation (~ 7 mm maximum) n&#39;est pas assez longtemps pour utiliser les différences de vitesse de conduction afférents à identifier les sous-types afférentes musculaire 13. En outre, contrairement à chez les chats et les humains, les mesures de sensibilité dynamique n&#39;étaient pas en mesure de différencier clairement groupe Ia et les afférences II chez la souris (pour plus de discussion, voir Wilkinson et al. 15). D&#39;autres sous-types de fibres afférentes (c.. Groupe III et IV) peuvent être identifiés en utilisant des tests fonctionnels supplémentaires dans cette préparation, par exemple par addition de substances comme la capsaïcine, de l&#39;ATP, ou la bradykinine, ce qui diminue le pH bain, ce qui expose le muscle à une ischémie, etc 3,13,21-23 En utilisant des électrodes d&#39;aspiration permet l&#39;activité des neurones sensoriels de multiples devant être enregistrées en même temps, ce qui augmente la quantité de données qui peuvent être collectées à partir d&#39;un seul muscle. Cette préparation peut être utilisé pour évaluer l&#39;effet global d&#39;une perturbation sur sensorielles réponses des populations de neurones ou les réponses des afférences identifiés. Si les formes de pic sont assez uniques, jusqu&#39;à 4 neurones sensoriels peuvent être discriminés par le logiciel (à la fois Spike2 (Cambridge Electronic Design) et Pro LabChart (AD Instruments) ont effectué la même manière). Dans les cas où les neurones ne peuvent pas être discriminés, les changements dans le placement des électrodes ou le diamètre de la pointe peuvent facilement être mises en œuvre. En résumé, la souris muscle-nerf en prépar vitroation est une approche expérimentale simple qui peut être utilisé pour étudier les propriétés de réponse des muscles afférences sensorielles à différents modèles perturbations, les blessures et les maladies physico-chimiques. En outre, cette préparation est idéale pour profiter des outils génétiques puissants disponibles chez la souris, y compris les animaux transgéniques et des outils optogénétiques.

Les muscles squelettiques sont innervés par les neurones sensoriels qui fournissent le système nerveux central des renseignements importants sur l&#39;environnement musculaire. Les fuseaux neuromusculaires sont des structures composées de fibres encapsulées musculaires intrafusoriales qui se trouvent en parallèle avec les fibres musculaires extrafusales hautement spécialisés. Broches sont innervés par le groupe Ia et II afférences qui codent pour des changements dans la longueur du muscle et intrafusales ton de fibre est dynamique réglementés par les neurones moteurs innervant gamma 1. Groupe afférences Ib sont positionnés entre les fibres musculaires et de leurs insertions tendineuses et sont sensibles aux variations de la force musculaire, par exemple au cours de la contraction du muscle 2. Le groupe Ia, Ib et II afférences proprioceptives fournissent une rétroaction qui aide dans le contrôle moteur approprié. D&#39;autres populations de afférences musculaires situées tout au long du muscle (groupes III et IV) servir pour signaler une accumulation metabolite, la présence de stimuli nociceptifs, et la température des muscles <sup&gt; 3. Cette information sensorielle musculaire est essentielle au maintien de l&#39;homéostasie, la prévention des lésions musculaires et la modulation de mouvement. afférences musculaires peuvent modifier leurs modes de tir basé sur l&#39;expérience avant 4. Activation des nocicepteurs peut conduire à l&#39;induction de la douleur chronique et de la signalisation aberrante 5 des propriocepteurs musculaires peuvent conduire à des problèmes d&#39;équilibre ou de mouvement 6. Nous utilisons un muscle-nerf isolé dans la préparation in vitro pour étudier la réponse des muscles terminaisons des récepteurs des neurones sensoriels de souris adultes des deux sexes (indiqués sont des réponses 2-4 mois vieux souris C57BL / 6). La souris est l&#39;espèce modèle pour les études génétiques chez les mammifères. Cette préparation nécessite l&#39;isolement de la branche profonde péronier du nerf sciatique et le muscle long extenseur des orteils (EDL), un muscle à contraction rapide du groupe péronier trouve dans la partie latérale de la jambe inférieure. Le permis de conduire est souvent utilisé pour étudier les propriétés contractiles des muscles 7-9, a tendons qui sont faciles à isoler et est suffisamment petit pour permettre l&#39;apport d&#39;oxygène par diffusion adéquate au repos et aux cycles raisonnables en matière de droits de contraction 10. D&#39;autres muscles dans ce domaine (par exemple soléaire et jambier antérieur) sont de taille similaire et cette préparation pourraient facilement être modifiés pour enregistrer à partir d&#39;afférences de ces muscles. Une électrode d&#39;aspiration est placé sur l&#39;extrémité du nerf sensoriel pour enregistrer muscle afférents cuisson de coupe. Neurones individuels peuvent être identifiés et analysés en fonction de leur forme de pointe Piquet logiciel de tri. La stimulation des électrodes dans le bain ou sur le nerf peut être utilisé pour évoquer la contraction musculaire. la longueur du muscle et de la force peuvent être contrôlées et mesurées à l&#39;aide de systèmes disponibles dans le commerce. Similaires dans les préparations in vitro ont été utilisés chez les rongeurs pour étudier Groupe III et IV afférences musculaires chez le rat EDL 11, groupe Ia et II afférences de broche chez le rat quatrième lombrical muscle orteil 12 et Groupe III et IV musculaires afférences en til plantaire de souris muscle 13. Un système in vitro a les avantages de l&#39;accessibilité pharmacologique et un contrôle direct de variables perfusat et physico-chimiques telles que la température et le pH. Une approche in vitro élimine le potentiel in vivo confond l&#39;anesthésie et le muscle état ​​de perfusion. Bien que la préparation nerf-muscle permet l&#39;étude de la réponse directe d&#39;une perturbation sur les afférences, la possibilité d&#39;étudier la modulation gamma efférent de sensibilité broche et d&#39;autres réponses intégrées qui est possible avec 14 in vivo ou ex vivo trois préparations sont sacrifiés il n&#39;y a pas de corps cellulaires neuronaux de cette préparation. Cette préparation a déjà été utilisé pour caractériser la réponse des afférences de broche de muscle de souris à une batterie de rampe et tenir les étirements et les vibrations et il a été déterminé que les responsab afférentes de la broche de la sourises étaient similaires à ceux rapportés dans d&#39;autres espèces comme le rat, le chat et l&#39;homme. Souris réponses broche afférentes ont été jugés similaires à la fois 24 ° C et 34 ° la température du bain de C, mais à 34 ° C des taux de combustion absolue étaient plus rapides et les afférences sont plus en mesure de répondre à la longueur plus rapide change 15. Nous décrivons ci-dessous comment cette préparation peut être utilisée pour identifier et étudier les afférences du fuseau musculaire. En outre, cette préparation peut être facilement modifié pour étudier la réponse des autres sous-types afférentes musculaire 13, à comparer les propriétés des afférences sensorielles en réponse à un état ​​de drogue ou d&#39;une maladie ou d&#39;autres variables assortis (par exemple, l&#39;âge, le sexe, le gène knock-out).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle neurones sensoriels innervant les fuseaux neuromusculaires et organes tendineux de Golgi codent des changements essentiels à la proprioception longueur et de force. Fibres afférentes supplémentaires surveillent d&#39;autres caractéristiques de l&#39;environnement musculaire, y compris métabolite accumulation, de la température, et des stimuli nociceptifs. Dans l&#39;ensemble, une activation anormale des neurones sensoriels peut conduire à des troubles du mouvement ou des syndromes de douleur chronique. Nous décrivons l&#39;isolement du long extenseur des orteils (EDL) musculaire et nerveuse pour l&#39;étude in vitro des réponses afférentes étirement évoqué chez la souris adulte. Activité sensorielle est enregistré à partir du nerf avec une électrode d&#39;aspiration et les afférences individuelles peut être analysé en utilisant un logiciel de tri pic. In vitro préparations permettent des études bien contrôlées sur les afférences sensorielles sans les facteurs de confusion potentiels de l&#39;anesthésie ou modifié perfusion musculaire. Nous décrivons ici un protocole pour identifier et tester la réponse des afférences de broche de muscle à l&#39;étirement. Fait important,cette préparation prend également en charge l&#39;étude des autres sous-types de afférences musculaires, des propriétés de réponse suite à l&#39;application de la drogue et de l&#39;incorporation des approches génétiques puissants et des modèles de la maladie chez les souris.

La réponse des afférences musculaires peuvent être enregistrées suivant une variété de perturbations, selon lequel le sous-type est afférente à l&#39;étude. Réponses représentatives des afférences de broche de muscle à la contraction musculaire et la rampe et maintenez tronçon sont présentés ici. Pour identifier un afférente comme un afférent broche, à contraction contractions sont donnés une fois par seconde (0,5 ms de largeur d&#39;impulsion) pour voir si il ya une pause dans la cuisson lors de la contraction 18,19. Figure 2 montre une trace représentant l&#39;activité neuronale et la tension musculaire pendant ces contractions de contraction. Aucune activité neuronale est observée pendant les contractions de contraction, comme prévu pour les afférences broche. Si la afférente a été enregistré un afférent de l&#39;organe tendineux de Golgi Groupe Ib, une augmentation du taux de décharge durant la contraction on pouvait s&#39;y attendre. Dans des conditions de contrôle de la plupart des afférences avec un motif de licenciement régulier (~ 12 impulsions / sec à 24 ° C et ~ 32 impulsions / sec à 34 ° C) Sont musculaires afférences de la broche. Un sous-ensemble des afférences de broche ne se déclenche pendant tronçon (dans nos mains ~ 11% des afférences de broche) 15. Figure 3A montre une trace brute représentant de deux afférences de broche de muscle en réponse à une rampe et maintenez tronçon produite par le contrôleur de la force et de la longueur. La fonction de Spike histogramme de LabChart est utilisé pour identifier et analyser la fréquence de mise à feu instantanée des deux neurones individuels séparément (figures 3B-3C). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: isolé Muscle Préparation A) Le long extenseur des orteils (EDL) et innervant nerf sciatique sont montés dans un bain de tissu isolé perfusé avec du liquide interstitiel synthétique oxygéné (SIF). Amplificateur extracellulaire relié à un suctisur l&#39;électrode enregistre l&#39;activité neuronale. Un double la force et la longueur contrôleur pour les logiciels-contrôles et des mesures appropriées la force musculaire et de la longueur. Les électrodes de bain de tissus fournissent des stimuli pour produire contraction ou contractions tétaniques. Pompage de l&#39;eau chauffée par la voie de la plaque de bain interne contrôle la température du bain de tissu. B) Tiré verre de l&#39;électrode d&#39;aspiration avec ~ 3 mm pointe effilée. C) agrandie représentation de la forme de pointe idéal pour l&#39;électrode d&#39;aspiration qui est produit en utilisant une microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: Réponse afférente à la broche Twitch contraction. Activit neuronaleY (tracé supérieur) et la tension musculaire (trace inférieure) de 30 contractions de contraction se superposent avec haut trace de chevauchement en noir. Activité afférente pause pendant l&#39;augmentation de la tension induite par la contraction, ce qui est une caractéristique de réponse des afférences de broche musculaire. Support et flèche au-dessus de la trace en haut indiquent le temps lors de la contraction lorsque l&#39;activité est en pause. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3 broche réponse afférente à rampe et Maintenez la position A) l&#39;activité neuronale Raw de deux afférences (haut traces) au cours d&#39;une rampe et maintenez étirement appliqué à l&#39;EDL (longueur musculaire indiqué dans la trace du bas). B) instantanée de la fréquence de mise à feu (Inst. Fr., impulsions par seconde) de l&#39;unité présentant une activité à L o de A (en bleu). C) Instantanéous la fréquence de mise à feu de l&#39;unité inférieure qui ne se déclenche au cours de l&#39;étirement (représenté en orange). Les deux unités présentent une adaptation de la fréquence de pic pendant tronçon qui est caractéristique des fibres afférentes de la broche 1 du muscle.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle neurones sensoriels sont impliqués dans la signalisation propriocepteur et signalent également sur les événements métaboliques de l&#39;Etat et des blessures liées. Nous décrivons une souris adulte in vitro préparation musculaire du nerf pour les études sur les afférences musculaires extensibles activé.

Un<em&gt; In Vitro</emMuscle-nerf&gt; Adult Souris Préparation pour étudier les propriétés de cuisson des afférences musculaires

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K vues.  San José State University.  Muscle neurones sensoriels sont impliqués dans la signalisation propriocepteur et signalent également sur les événements métaboliques de l'Etat et des blessures liées. Nous décrivons une souris adulte in vitro préparation musculaire du nerf pour les études sur les afférences musculaires extensibles activé. 

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Etudier l&#39;intégration des adultes-né Neurones

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Recherche

Neurosciences

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Préparation Susciter et enregistrement des programmes d&#39;alimentation moteur avec les mouvements physiologiques en<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Préparation des horizontales Tranches de souris adultes Retina pour les études électrophysiologiques

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caractérisation des propriétés électrophysiologiques des fibres afférentes du côlon chez le rat

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...