Nous tenons à remercier Amie Regan pour la lecture attentive du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NGFN plus de subvention # 01GS0801, MRC bourse subvention G1002523 et NHSBT subvention WP11-05 à LD et DFG subvention FR2938/1-1 au CCF

1. Marquage métabolique avec 4 thiouridine Faire un plan détaillé du dispositif expérimental / calendrier, par exemple quand il faut ajouter le 4SU à la culture cellulaire et quand récolter des échantillons. Régime pendant au moins 5 minutes entre chaque état. Ne traiter que des cellules d&#39;un état à la fois. Poignée max. 3-5 plats à un moment donné. Manipuler les cellules aussi rapidement que possible pour minimiser les changements dans 2 niveaux de température et CO. Évitez d&#39;exposer les cellules à la lumière après 4SU est ajouté, car cela pourrait conduire à une réticulation de l&#39;ARN 4SU marquées par des protéines cellulaires. Début de l&#39;étiquetage <ol><li> Dégel 4 thiouridine (4SU) juste avant l&#39;utilisation et la pipette quantité requise de 4SU pour chaque état dans un tube Falcon stérile. </li><li> Prenez le montant requis de milieu de culture cellulaire (5 ml par boîte de 10 cm) sur les assiettes et ajouter à tube Falcon 4SU contenant et bien mélanger. Retirez et jetez le milieu restant de la vaisselle. </li> &lt;li&gt; Appliquer 4SU contenant dossier moyen pour les plats. </li></ol> Fin de l&#39;étiquetage <ol start="4"><li> Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir de cellules. Ajouter 5 ml de Trizol à chaque plaque. Pour les expériences complexes incluant plusieurs points dans le temps ou des conditions, cette étape est mieux fait par deux personnes, une élimination du milieu, l&#39;autre ajoutant Trizol et la récolte du lysat. </li><li> Incuber pendant 5 min à la température ambiante pendant une lyse complète des cellules. </li><li> Utiliser une pipette de 10 ml de rincer soigneusement la plaque avec le Trizol ajouté. Ceci facilite la lyse complète des cellules et la récupération de l&#39;échantillon. Manipuler avec soin comme Trizol est extrêmement dangereux quand entrer en contact avec la peau ou les yeux! Avoir antidote pour les brûlures phénol à la main (par exemple le polyéthylène glycol 300 ou 400 dans l&#39;alcool dénaturé industriel (70:30)). Transférer les échantillons dans des tubes en polypropylène. Veuillez noter que les tubes Falcon classiques ne résistent pas à ces grandes forces G). Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins un mois avant l&#39;ARN total is préparé. </li></ol> 2. Préparation d&#39;ARN utilisant protocole modifié Trizol <ol><li> Ajouter 1 ml de chloroforme (0,2 ml par ml Trizol) et agiter vigoureusement pendant 15 secondes. Incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min. </li><li> Centrifuger à 13000 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Transférer la phase supérieure aqueuse (contenant de l&#39;ARN) à un nouveau tube en polypropylène de 15 ml. </li><li> Ajouter la moitié du volume de la réaction de précipitation à la fois un tampon d&#39;ARN et de l&#39;isopropanol (par exemple de 3 ml de surnageant ajouter 1,5 ml de tampon d&#39;ARN précipitation et de 1,5 ml d&#39;isopropanol). </li><li> Mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 13000 g pendant 10 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. </li><li> Centrifuger brièvement (5000 g pendant 30 sec) et retirer l&#39;isopropanol résiduel avec pipette 200 pl. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;éthanol à 75% et agiter le tube jusqu&#39;à ce que le culot se détache. Évitez le divisant en plusieurs petits morceaux comme cela peut rendre l&#39;enlèvement de résidusl d&#39;éthanol difficile. </li><li> Centrifuger à 13000 g pendant 10 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. </li><li> Isoler ARN brièvement et éliminer l&#39;éthanol restant avec une pipette 200 pl. Répétez l&#39;étape et éliminer l&#39;éthanol restant avec une pipette 20 ul. Après ces deux étapes, aucune autre séchage du culot doivent être effectuées. </li><li> Ajouter 100 ul de H 2 O par 100 ug de rendement en ARN attendu et bien mélanger par pipetage de haut en bas 5-6 fois pour aider à dissoudre l&#39;ARN. </li><li> Dissoudre et dénaturer l&#39;ARN par chauffage à 65 ° C pendant 10 min (shaker) et placer immédiatement sur la glace. </li><li> Mesurer l&#39;ARN concentration à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop, suivant les instructions du fabricant. Cet ARN peut être conservé à -80 ° C pendant au moins un mois. </li></ol> 3. Biotinylation thiol-spécifique de l&#39;ARN récemment transcrits <ol><li> Commencez avec 60 à 80 ug d&#39;ARN cellulaire total. </li><li> Constituer étiquetage réaction. Pipette dans la suiteordre (ARN par ug d&#39;): <ol class="lalpha"><li> 1 pl de tampon de Biotinylation 10x </li><li> 7 ARN ul (contenant 1 ug d&#39;ARN dilués dans nucléase H 2 O) </li><li> 2 pl biotine HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Toujours ajouter la biotine HPDP dernier et mélanger immédiatement par pipetage. Dans le cas où la biotine précipite, contenu DMF peut être augmentée jusqu&#39;à une concentration finale de 40%. <ol start="3"><li> Incuber à température ambiante pendant 1,5 heures avec rotation. </li><li> Ajouter un volume égal de chloroforme. Mélanger vigoureusement. Incuber pendant 2-3 minutes jusqu&#39;à ce que les phases commencent à se séparer et les bulles commencent à disparaître. </li><li> Centrifuger à 20000 g pendant 5 min à 4 ° C. Soigneusement transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 3,4 et 3,5 fois. Vous pouvez effectuer cette opération dans 2 ml à verrouillage de phase gel tubes lourds pour réduire la perte de l&#39;ARN. </li><li> ARN précipitations: ajouter 1/10 du volume de 5 M de NaCl et un volume égal d&#39;l&#39;isopropanol à la phase aqueuse. </li><li> Centrifuger à 20000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;éthanol à 75%, centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant. </li><li> Centrifuger brièvement et enlever des résidus d&#39;éthanol avec 200 pipette ul. </li><li> Centrifuger brièvement et enlever des résidus d&#39;éthanol avec 20 pipette ul. </li><li> Ne laissez pas l&#39;ARN à sécher. Re-suspendre en 50 - 100 pi H 2 O (~ 1 pi par 1 ug d&#39;ARN d&#39;entrée). Bien mélanger par pipetage de haut en bas 5 - 6 fois. </li><li> Vérifiez la qualité de l&#39;ARN par analyse électrophorétique d&#39;exclure dégradation de l&#39;ARN. </li></ol> 4. Dot Blot Analyse des 4SU-incorporation (Facultatif) Incorporation 4SU peut être facilement déterminée par analyse dot blot d&#39;ARN biotinylé. Il s&#39;agit d&#39;une étape facultative qui permet le dépannage et l&#39;estimation des taux d&#39;incorporation 4SU rapport à un témoin oligo d&#39;ADN biotinylé. Pour ce test nous avons recommend utilisant iodoacétyle-biotine au lieu de biotine HPDP pour biotinylation de l&#39;ARN 4SU marqués à l&#39;étape 3.2. Il en résulte une biotinylation irréversible de 4SU-ARN. Par conséquent, les méthodes basées sur colonne (par exemple RNeasy) peuvent être utilisés pour la récupération de plus petites quantités d&#39;ARN biotinylé (par exemple 5 ug). Alors que l&#39;ARN biotinylé en utilisant la biotine HPDP est également approprié pour cet essai, le signal résultant est plus faible et le rapport signal-bruit moins favorable (Figure 3). <ol><li> Suivre le protocole de 4SU-étiquetage et l&#39;isolement de l&#39;ARN cellulaire total, comme décrit dans les sections 1 et 2. </li><li> Biotinyler 4SU-ARN marqué comme décrit dans la section 3, en remplaçant la biotine HPDP avec iodoacétyle-biotine et d&#39;effectuer deux extractions chloroforme pour éliminer complètement les résidus iodoacétyle-biotine excessifs. </li><li> Récupérer ARN biotinylé par isopropanol / éthanol précipitation comme décrit ou en utilisant une approche basée sur les colonnes (par exemple RNeasy) en cas de petites quantités d&#39;ARN (&lt;10 pg) Sont utilisés. </li><li> Incuber la membrane Zeta dans l&#39;eau sans nucléase à bascule pour 10 min. </li><li> Prendre la membrane hors de l&#39;eau sans nucléase et retirer les fluides excessifs en plaçant la membrane entre deux serviettes en papier propre et en appuyant fermement. Air-séchage de la membrane pendant 5 min se traduira par des points plus agréables. </li><li> Pour chaque échantillon, préparer 20 pi d&#39;ARN 200 ng / ul utilisant glacée tampon de liaison dot blot (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Appliquer 5 ul de cette dilution (soit 1 ug d&#39;ARN), ainsi que trois dilutions de 10 fois suivantes (soit 100, 10 et 1 ng d&#39;ARN, respectivement) de la membrane Zeta par pipetage. Pipetage à travers un rack vide de pointes de pipette peut être utilisé pour fournir espacement uniformément répartie. Sinon, utilisez un appareil de dot blot selon les instructions du fabricant. </li><li> Appliquer 5 pl de l&#39;ADN oligo marqué à la biotine à des concentrations allant de 20 ng / ul à 20 pg / pl (soit 100, à 0,1 ng oligo) comme une suite favorablerol à la membrane par pipetage. Utilisez un échantillon biotinylé, 4SU naïfs comme contrôle négatif. </li><li> Air-sécher la membrane pendant 5 min. </li><li> Incuber la membrane pendant 30 min à 40 ml avec un tampon de blocage à bascule. </li><li> Incuber la membrane avec 10 ml de 1:1000 streptavidine-peroxydase de raifort pendant 15 min (5 ml de PBS + 5 ml SDS 20% + 10 pl streptavidine-peroxydase de raifort) </li><li> Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) pendant 5 min. </li><li> Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) pendant 5 min. </li><li> Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 pi 20% SDS) pendant 5 min. </li><li> Retirer un excès de liquide en plaçant la membrane entre deux serviettes en papier propre et en appuyant sur les fermement. </li><li> Visualisez membrane-bound HRP en utilisant ECL selon les instructions du fabricant. </li><li> Placer la membrane dans du papier / sac en plastique, enlever les bulles d&#39;air et incuber pendant 2 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Exposer la membrane àfilm 1 - 5 min. </li></ol> 5. Séparation de l&#39;ARN étiquetés et non étiquetés en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine <ol><li> La chaleur du tampon de lavage (3 ml par exemple) à 65 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Préparer une solution fraîche mM dithiothréitol 100 (DTT) dans nucléase H 2 O. Le faire par décantation de 15 à 30 mg de poudre de TNT dans un tube propre de 50 ml Falcon placé sur l&#39;ultra-fine échelle. Peser et ajouter la quantité requise de nucléase H 2 O. </li><li> Heat biotinylé échantillons d&#39;ARN à 65 ° C pendant 10 min pour dénaturer et immédiatement sur la glace. </li><li> Lieu μMacs colonnes dans le support magnétique. Nous vous recommandons de ne pas traiter plus de 12 échantillons à la fois (6 - 8 échantillons sont optimales). </li><li> Miltenyi colonnes pré-s&#39;équilibrer avec la température ambiante 1 ml de tampon de lavage. Cela prendra environ 15 minutes. </li><li> Pendant ce temps, ajouter 100 ul de billes de streptavidine à 50 - 100 ul d&#39;ARN biotinylé. Incuber à température ambiante pendant 15 min avec rotation. </li> &lt;<html> li&gt; Si l&#39;une des colonnes n&#39;a pas engagé de vidange maintenant ce qui peut être facilité en appuyant doucement sur le haut de la colonne avec un doigt ganté. Une fois que le flux a commencé les colonnes drainent facilement. </li><li> Appliquer les ARN / perles pour les colonnes. Jeter l&#39;effluent à travers, sauf si vous voulez récupérer la fraction d&#39;ARN sans étiquette (voir section 7). </li><li> Laver trois fois avec 0,9 ml de 65 ° C tampon de lavage (1 ml pointes de pipette rétrécissent quand pipetage tampons à 65 ° C). </li><li> Laver trois fois avec 0,9 température ambiante ml du tampon de lavage. </li><li> Pipette 700 ul de tampon RLT (RNeasy Kit de nettoyage de MinElute, Qiagen) dans de nouveaux tubes de 2 ml et de les placer sous les colonnes. </li><li> On élue l&#39;ARN nouvellement transcrites dans le tampon RLT en ajoutant 100 ul de 100 mM DTT aux colonnes. </li><li> Effectuer un deuxième tour élution 3 min plus tard dans le même tube en ajoutant un autre 100 pi de DTT 100 mM. </li></ol> 6. La récupération de l&#39;ARN récemment transcrits ontenu &quot;&gt; Continuer avec le nettoyage de MinElute RNeasy (Qiagen) protocole suivant les instructions du fabricant. Elute dans 25 pi H 2 concentrations d&#39;ARN Mesure O. nucléase aide d&#39;un spectrophotomètre Nanodrop. Pour éviter d&#39;avoir à décongeler et recongeler ARN avant de soumettre à un dosage à haut débit, nous vous recommandons la préparation d&#39;ADNc immédiatement après l&#39;ARN nouvellement transcrit est purifié. Utiliser 2,5 pi de l&#39;ARN nouvellement transcrites dans 20 pi de mélange de synthèse d&#39;ADNc pour la synthèse d&#39;ADNc en suivant les instructions du fabricant. effectuer des contrôles qRT-PCR en utilisant 1 : 10 dilutions du mélange d&#39;ADNc magasin ARN à -80 ° C.. 7. Récupération de vierge, Unbound ARN (Facultatif) Dans le cas où l&#39;ARN non lié doit être récupéré; recueillir et combiner l&#39;écoulement traversant (après addition de la solution de billes ARN-streptavidine pour les colonnes) et du premier lavage pour la précipitation subséquente. Habituellement, il est suffisante pour précipiter seulement 50% de l&#39;ARN non lié comme this contiendra&gt; 80% de la matière de départ. <ol><li> Ajouter un volume égal d&#39;isopropanol (pas de sel doit être ajoutée comme le tampon de lavage contenant déjà 1 M de NaCl). </li><li> Centrifuger à 20000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;éthanol à 75%, centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant. </li><li> Centrifuger brièvement et enlever des résidus d&#39;éthanol avec 200 pipette ul. </li><li> Centrifuger brièvement et enlever des résidus d&#39;éthanol avec 20 pipette ul. </li><li> Ne laissez pas l&#39;ARN à sécher. Remettre en suspension dans 100 ul H 2 O. Bien mélanger par pipetage de haut en bas 5 - 6 fois. Incuber à 65 ° C pendant 10 min avec agitation et transférer directement à la glace. </li><li> Vérifiez la qualité de l&#39;ARN par analyse électrophorétique d&#39;exclure dégradation de l&#39;ARN. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le marquage métabolique de l&#39;ARN transcrit nouvellement renforce considérablement la puissance des technologies à haut débit comme des puces et ARN-Seq en fournissant des modèles plus appropriés pour aborder la question biologique d&#39;intérêt. Le présent protocole a subi une optimisation considérable. Il permet l&#39;enrichissement&gt; 1000 fois de l&#39;ARN nouvellement transcrites et fournit des résultats hautement reproductibles. Le dispositif expérimental d&#39;une exp?...

Profil d&#39;expression génique est un outil clé utilisé pour étudier les processus cellulaires et le réseau d&#39;interaction complexe associé. Des études sur l&#39;abondance de l&#39;ARNm ont généralement été la méthode de choix pour obtenir un aperçu de base sur les mécanismes moléculaires sous-jacents. Le développement de puces tout-transcriptome 1 et, plus récemment, le séquençage de prochaine génération de l&#39;ARN (RNA-Seq) 2-4 alimentée cette approche. Bien que ces technologies ont révolutionné notre compréhension de la complexité de l&#39;expression du gène cellulaire, ils font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques de leur échantillon de modèle, à savoir l&#39;ARN cellulaire total. Premiers changements à court terme des niveaux d&#39;ARN totaux ne correspondent pas à l&#39;évolution des taux de transcription, mais sont intrinsèquement dépendante de l&#39;ARN demi-vie des transcriptions respectifs. Alors qu&#39;une induction cinq fois d&#39;une transcription, par exemple l&#39;encodage de courte durée pour un facteur de transcription, sera facilement détectable dans l&#39;ARN totalmoins d&#39;une heure, le même induction de la transcription, par exemple l&#39;encodage de longue durée pour une enzyme métabolique, restera pratiquement invisible. En outre, même un arrêt complet (&gt; 1000 fois down-regulation) du taux de transcription d&#39;un gène moyenne avec un ARN demi-vie de cinq heures seront simplement prendre cinq heures pour les niveaux d&#39;ARN totaux diminuer de seulement double . Par conséquent, l&#39;analyse de l&#39;ARN totale favorise la détection d&#39;une régulation de la transcription de courte durée, dont la plupart codent pour des facteurs de transcription et des gènes avec des fonctions de réglementation 5. En outre, la vraie cascade cinétique de la réglementation est obscurcie et événements de signalisation primaires ne peut être différenciée du secondaire. Les deux, à son tour, peut entraîner un biais important dans les analyses bioinformatiques aval. Deuxièmement, des modifications dans les niveaux d&#39;ARN totaux ne peuvent pas être attribuées à des changements dans la synthèse d&#39;ARN ou de pourriture. Les mesures de ce dernier nécessitent des approches invasives cellulaires, par exemple blocage transcriptisur l&#39;utilisation de l&#39;actinomycine D 6, et la surveillance prolongée de l&#39;ARN décroissance continue au fil du temps. Avec un ARNm demi-vie moyenne dans les cellules de mammifères de 5 à 10 hr 5,7, les niveaux d&#39;ARNm de la plupart des gènes seulement auront diminué de moins de double après plusieurs heures d&#39;arrêt de la transcription. Ces plutôt petites différences se traduisent en mesures grossièrement imprécise des demi-vies d&#39;ARNm pour la majorité des gènes cellulaires en raison de la nature exponentielle des équations mathématiques sous-jacents. Enfin, si l&#39;ARN-seq de l&#39;ARN cellulaire total a révélé que près de la moitié de nos gènes sont soumis à des événements d&#39;épissage alternatifs 8, la cinétique sous-jacents ainsi que les mécanismes dynamiques directeurs tissus et spécifiques au contexte réglementaire de traitement de l&#39;ARN restent mal compris. En outre, la contribution de l&#39;ARN traitement à l&#39;expression différentielle des gènes, en particulier pour les ARN non-codants, reste à déterminer. Au total, ces limitations représentent des obstacles majeurs pourmodélisation cinétique bioinformatique des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous avons récemment développé une approche, appelée résolution gène profilage de haute expression, pour surmonter ces problèmes 5,7,9. Il est basé sur le marquage métabolique de l&#39;ARN nouvellement transcrit en utilisant 4 thiouridine (4SU-tagging), un dérivé de l&#39;uridine naturel, et offre un accès direct aux transcriptions nouvellement transcrites avec un minimum d&#39;interférences dans la croissance cellulaire et l&#39;expression des gènes (voir Figure 1) 5, 10-12. L&#39;exposition des cellules eucaryotes aux résultats 4SU à son adoption rapide, la phosphorylation de 4SU-triphosphate, et incorporation dans l&#39;ARN nouvellement transcrites. Après isolement de l&#39;ARN cellulaire total, la fraction d&#39;ARN 4SU-marqué est thiol-spécifique biotinylé à générer un pont disulfure entre la biotine et l&#39;ARN nouvellement transcrites. &#39;ARN cellulaire total »peuvent ensuite être séparés quantitativement dans étiqueté (&#39; nouvellement transcrit») et sans étiquette («pré-existinG &#39;) d&#39;ARN avec une grande pureté en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Enfin, l&#39;ARN marqué est récupéré à partir des billes par simple addition d&#39;un agent réducteur (par exemple le dithiothréitol) le clivage de la liaison disulfure et de libérer l&#39;ARN nouvellement transcrites à partir des billes. ARN nouvellement transcrit représente l&#39;activité de transcription de chaque gène au cours de la période d&#39;exposition 4SU. 4SU-tagging dans le calendrier de minutes fournit ainsi un instantané de l&#39;expression des gènes eucaryotes et un modèle idéal pour les analyses bioinformatiques en aval (par exemple, l&#39;analyse du promoteur). Dans les cas où l&#39;état d&#39;équilibre peut supposer, les ratios de nouveaux transcrits / total, nouvellement transcrites / non étiquetés et non étiquetés / ARN total fournissent un accès non-invasive à l&#39;ARN précises des demi-vies 7,13. En outre, il est important de noter que les ARN transcrits nouvellement purifié après aussi peu que 5 min de 4SU-tagging (5 min 4SU-ARN) est plus jeune que 15 et 60 min 4SU-ARN.Lorsque vous effectuez à la fois ultra-court et progressivement plus 4SU-tagging dans un cadre expérimental unique combiné avec l&#39;ARN-Seq, la cinétique de maturation de l&#39;ARN sont révélés à la résolution de nucléotides 9. Enfin, les analyses temps-cours d&#39;ARN nouvellement transcrites et total combiné avec la modélisation informatique permettent une analyse intégrative de la synthèse de l&#39;ARN et de la décomposition 14. En conclusion, cette approche permet l&#39;analyse directe de la dynamique de la synthèse d&#39;ARN, de la transformation et de la dégradation dans les cellules eucaryotes. Elle est applicable dans tous les grands organismes modèles y compris des mammifères, des insectes (drosophile), les amphibiens (Xenopus) et la levure 5,15,16. Il est directement compatible avec l&#39;analyse des microréseaux 5,17, RNA-Seq 9,13,14, et est applicable in vivo 12,15. Ici, nous détaillons la méthodologie d&#39;étiqueter, d&#39;isoler et de purifier l&#39;ARN nouvellement transcrites dans les cellules de mammifères en culture. En outre, potentiomètreproblèmes al et les pièges sont discutées.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

Le développement de puces tout-transcriptome et le séquençage de prochaine génération a révolutionné notre compréhension de la complexité de l&#39;expression des gènes cellulaires. Avec une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués, des mesures précises de la cinétique sous-jacents sont devenus de plus en plus importante. Ici, ces méthodes puissantes font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques des échantillons de modèle à savoir l&#39;étude des ARN cellulaires, ils totales. Dans de nombreux cas, des changements dans l&#39;ARN cellulaire total surviennent trop lentement ou trop rapidement pour représenter les événements moléculaires sous-jacents et leur cinétique avec une résolution suffisante. En outre, la contribution des altérations de la synthèse de l&#39;ARN, le traitement et la décadence sont pas facilement différencié. Nous avons récemment développé à haute résolution de l&#39;expression génique pour surmonter ces limitations. Notre approche est basée sur le marquage métabolique de l&#39;ARN nouvellement transcrit avec 4 thiouridine (donc également dénommé 4SU-marquage) suivie d&#39;une purification rigoureuse de l&#39;ARN transcrit à l&#39;aide de nouveaux biotinylation thiol-spécifique et des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Il est applicable à un large éventail d&#39;organismes, y compris les vertébrés, chez la drosophile et la levure. Nous avons appliqué avec succès 4SU-tagging pour étudier la cinétique en temps réel des activités de facteurs de transcription, fournir des mesures précises de l&#39;ARN demi-vie, et obtenir de nouveaux aperçus sur les cinétiques de maturation de l&#39;ARN. Enfin, la modélisation computationnelle peut être utilisée pour générer une analyse globale et intégrée des mécanismes moléculaires sous-jacents.

1. Matériau de départ et rendements attendus Après 1 heure (h) de 4SU-exposition ARN nouvellement transcrit représente environ 1-4% de l&#39;ARN cellulaire total. Ce sera plus faible dans les cellules de la croissance arrêtés car ils ne synthétisent l&#39;ARN pour tenir compte de la croissance / réplication cellulaire. Lors de l&#39;étiquetage pendant 1 heure, nous vous conseillons de commencer le dosage avec 60 à 80 ug d&#39;ARN total. A partir de moins de 30 ug de l&#39;ensemble des...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

L&#39;ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l&#39;étude des changements à court terme dans la synthèse d&#39;ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l&#39;ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.

Marquage métabolique de l&#39;ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d&#39;expression génique de l&#39;ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K vues.  Max von Pettenkofer Institute. L'ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l'étude des changements à court terme dans la synthèse d'ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l'ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.

Vidéo: Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La détection des protéines liant l&#39;ARN par<em&gt; In vitro</em&gt; ARN Pull-down en adipocytes Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...