Partie 1: Extraction des ARN totaux à l&#39;aide du réactif Trizol Lorsque vous travaillez avec de l&#39;ARN, il est très important de travailler dans un environnement qui est exempt de RNases. Des précautions simples, comme avoir des pipettes réservées à un usage uniquement avec les procédures de l&#39;ARN et la pulvérisation de la zone de travail avec un réactif décontaminant (par exemple, RNase Away) avant le début de la procédure sont très utiles. <ol><li> Pour atteindre une quantité suffisante d&#39;embryons de poisson zèbre pool d&#39;ARN 50 dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation et retirer autant d&#39;eau que possible avec une pipette. </li><li> Immédiatement ajouter 250 ul de réactif TRIzol 1 au tube de centrifugeuse contenant les embryons. Réactif Trizol contient du phénol et ne doit être utilisée sous une hotte. </li><li> Lyse et homogénéiser les embryons avec un pilon à granulés (environ 20 coups) jusqu&#39;à ce que le tissu est suffisamment perturbé. </li><li> Lorsque les cellules sont suffisamment homogénéisé, ajouter 750 ul réactif TRIzol pour égaler un volume total de 1 ml. </li><li> Afin de permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques, incuber des échantillons homogénéisés pendant 5 minutes à température ambiante. A ce stade, l&#39;échantillon peut être éclair congelés dans l&#39;azote liquide et conservés à -80 ° C ou le protocole peut être poursuivi. </li><li> Pour continuer à ajouter 0,2 ml de chloroforme et le rock le tube pendant 15 secondes pour mélanger. </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 2 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 xg pendant 15 minutes à 4 ° C. </li><li> Le mélange va se séparer en bas d&#39;un rouge de phénol-chloroforme phase, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. La phase aqueuse supérieure contenant l&#39;ARN. La couche supérieure doit comporter d&#39;environ 60% du volume initial de TRIzol (environ 0,6 ml). Transfert de la couche aqueuse supérieure dans un tube de centrifugeuse nouvelle aide d&#39;une pipette de 1 ml en faisant attention à ne pas transférer de la couche d&#39;interphase. </li><li> Pour précipiter les ARN ajoutez 0,5 ml d&#39;isopropanol. </li><li> Laisser l&#39;échantillon reposer à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C. ARN formeront une pastille de gel-like sur le fond du tube. </li><li> Sans perturber le culot, éliminer le surnageant avec une pipette et laver le culot dans 1 ml d&#39;éthanol à 75%. Mélanger l&#39;échantillon en retournant délicatement et centrifuger à 7500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer l&#39;éthanol avec une pipette et permettre échantillon à sec tout inversé pendant 10 minutes. </li><li> Reprendre le culot en ajoutant 100 pi d&#39;eau sans RNase et incuber l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes. Il est recommandé aux doigts de vortex fréquemment pendant l&#39;incubation à l&#39;aide de réhydratation ARN. En option, vous pouvez vérifier la qualité et la quantité d&#39;échantillon en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre ou directement à l&#39;étape suivante. </li></ol> Partie 2: Nettoyage ARN utilisant le kit Qiagen RNeasy Mini Le kit Qiagen RNeasy Mini 2 est utile pour éliminer les contaminants et les impuretés d&#39;un échantillon d&#39;ARN isolé à partir d&#39;autres méthodes. Pour cette procédure, β-mercaptoéthanol, l&#39;éthanol et eau sans nucléase sont nécessaires en plus des composants inclus dans le kit. Un traitement optionnel DNAse est recommandé pendant cette procédure. <ol><li> Dès la première utilisation de la trousse, tampon RPE devra être préparé par addition de 4 volumes d&#39;éthanol à 100% à 1 volume de tampon RPE. </li><li> Le jour de la procédure, tampon RLT devront être préparés frais. Calculez le montant total de tampon RLT qui sera nécessaire. Un volume de 350 ul est nécessaire par échantillon. Pour préparer le tampon RLT, ajouter 10 l de β-mercaptoéthanol pour chaque 1 ml de tampon. Cela devrait être fait sous la hotte. </li><li> Pour chaque échantillon ajouter 350 ul du tampon RLT et 250 ul d&#39;éthanol à 100%. Mélangez bien par aspiration et refoulement à plusieurs reprises. </li><li> Transférer l&#39;échantillon, ce qui devrait être d&#39;environ 700 ul, dans une colonne RNeasy qui est placé dans un tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, éliminer le flux à travers et ajouter 700 ul de tampon RW1 à une colonne RNeasy. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante, puis jetez le débit à travers. </li><li> Traitement à la DNase avec QIAGEN kit RNase-Free DNase: DNAse traitement est facultative mais fortement recommandée pour les échantillons de haute qualité. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Lorsque vous recevez le kit de traitement à la DNase, vous aurez besoin pour préparer la solution de DNase I en ajoutant 550 ul eau sans nucléase de la DNAse. Mélanger doucement en inversant et ne vortex. Aliquoter dans des flacons à usage unique contenant 10 ul de la solution stock. Vous pouvez stocker la solution stock à -20 ° C jusqu&#39;à 9 mois. Les aliquots décongelés peuvent être conservés à 4 ° C pendant 6 semaines si nécessaire, mais ne pas recongeler les aliquots après décongélation. </li><li> Pour préparer le mélange incubation de DNase I ajouter 70 ul de tampon RDD à 10 ul DNAse I ssolution tac par échantillon. Mélanger par inversion douce et tube à centrifuger brièvement pour ramasser résiduelle sous forme liquide sur les côtés du tube. Ajouter 80 ul mélange incubation de DNase I directement à la colonne RNeasy. Incuber le traitement DNAse pendant 30 minutes à température ambiante. </li></ol></li><li> Après le traitement DNAse ajouter 350 pi de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation jetez le débit à travers et ajouter 500 ul tampon RPE à la colonne spin. Incuber l&#39;échantillon pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante et jeter le débit à travers. </li><li> Après centrifugation ajouter 500 ul d&#39;éthanol de 75% à la colonne. </li><li> Répétez centrifugation à 8000 xg, mais pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Après centrifugation jetez le débit à travers la colonne et permettre de sécher pendant 5 minutes. </li><li> Immédiatement centrifuger à 8000 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour enlever tout à gauche sur les traces de l&#39;éthanol. </li><li> Après centrifugation est un transfert complet de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml et ajouter 10 ul eau sans nucléase. Incuber pendant 1 minute, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante. L&#39;ARN sera dans le flux à travers. </li><li> Ajouter un autre ul 10 de eau sans nucléase à la colonne de spin et incuber à température ambiante pendant 1 minute. Centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation retirez et jetez la colonne. L&#39;ARN sera dans le flux à travers. </li><li> Vérifiez la quantité et la qualité de l&#39;ARN en utilisant une NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant. </li><li> En outre, d&#39;exécuter un gel dénaturant ou d&#39;utiliser un bioanalyseur Agilent 2100 pour vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ARN. </li><li> Les échantillons doivent être conservés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la synthèse d&#39;ADNc peut être effectuée. </li></ol> Partie 3: Synthèse d&#39;ADNc en utilisant l&#39;Invitrogen SuperScript premier brin système L&#39;ARN est facilement sujette au clivage par ARNases conduisant à la dégradation. En conséquence de nombreux protocoles d&#39;expression génique ont été développés pour utiliser un produit plus stable d&#39;ADNc qui a été directement synthétisés à partir de l&#39;ARN. Voici la synthèse des détails que nous premier brin d&#39;ADNc en utilisant le système d&#39;Invitrogen SuperScript Synthèse du premier volet 3. Chaque réaction de synthèse d&#39;ADNc peut accueillir jusqu&#39;à 5 ug d&#39;ARN. <ol><li> Avant de commencer le mélange procédure et centrifuger brièvement chaque composante. </li><li> Préparer ARN / mélange de primer dans un tube de micro stérile de 0,5 ml comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 65 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Immédiatement le transfert de l&#39;échantillon à coulis de glace pendant 10 minutes. </li><li> Alors que l&#39;échantillon est de refroidissement préparer un master mix avec les composants décrits dans le tableau 2. Les volumes sont répertoriés par une réaction. Ajustez le volume en conséquence pour le nombre total de réactions. </li><li> Après refroidissement, ajouter 9 ul du mélange maître préparé à l&#39;étape 5 pour chaque ARN / mélange d&#39;amorces. Mélanger délicatement et recueillir par centrifugation brève. Le volume total de chaque échantillon doit être de 19 pi. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 42 ° C pendant 2 minutes dans un thermocycleur. </li><li> Ajouter 1 ul (50 unités) de SuperScript II RT dans chaque tube, mélanger et incuber à 42 ° C pendant 60 minutes dans un thermocycleur. </li><li> Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes, puis réfrigérer l&#39;échantillon à 4 ° C. Un thermocycleur peut être programmé pour des étapes 8 et 9. </li><li> Après l&#39;échantillon a atteint 4 ° C, le transfert de la réaction d&#39;un bain de glace. </li><li> Sur la glace ajouter 1 l de RNAse H pour chaque tube et incuber pendant 20 minutes à 37 ° C. Le volume total est maintenant de 21 pi. Ajout de la RNAse H pour votre échantillon va dégrader la matrice ARN et ne laisser que le produit seul brin d&#39;ADNc. </li></ol> Partie 4: Isolement d&#39;ADNc et des précipitations <ol><li> Une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube sera utilisé dans l&#39;isolation du produit d&#39;ADNc. Préparer une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube par centrifugation à 12000 xg pendant 2 minutes. Le gel devraient tous être au fond du tube. </li><li> Ajouter 81,5 ul de phénol (Tris-saturés, tamponné à pH 8,0), 81,5 l de chloroforme alcool isoamylique 24:1, et l&#39;échantillon (21 ul) dans le tube de gel à verrouillage de phase. Mélanger plusieurs fois par inversion douce. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> L&#39;ADNc doit être dans la phase aqueuse supérieure. Transférer la phase supérieure dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml. Le volume total devrait être d&#39;environ 20 pl. </li><li> Ajouter 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 et mélanger doucement. Par exemple, si le volume de la phase aqueuse supérieure est égale à 20 pl, vous aurez besoin d&#39;ajouter 2 pi de NaOAc 3 M, pH 5,2. </li><li> Ajouter 7 l de 5 mg / ml de glycogène et mélanger délicatement. </li><li> Ajouter 1X volume d&#39;isopropanol et mélanger doucement. En général, cela se situe autour de 30 ul d&#39;isopropanol. </li><li> Laisser l&#39;échantillon à incuber à températur ambiantee pendant 10 minutes et puis centrifuger à 12 000 xg pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Une petite pastille d&#39;ADNc devraient former sur le fond du tube. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 70% et mélanger par retournement. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes. </li><li> Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette et répéter le lavage à l&#39;éthanol 70% et de centrifugation (étapes 10 et 11). </li><li> Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette. S&#39;il ya du liquide restant sur les parois du tube, il peut être recueilli par une brève filature le tube. Retirez tout excès de liquide et de permettre le culot sécher à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 20 ul d&#39;eau sans nucléase pour réhydrater la pastille. Placer l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 5 minutes pour la réhydratation de la pastille. </li><li> La quantité et la qualité du produit d&#39;ADNc est ensuite vérifiée en utilisant un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant. L&#39;ADNc peut être conservé à -20 ° C. </li></ol> Les résultats représentatifs Après le nettoyage d&#39;ARN, d&#39;environ 15 ug de haute qualité de l&#39;ARN total peut être attendu de 50 embryons de poissons zèbres. Pour évaluer la qualité totale ARN, un spectrophotomètre, électrophorèse sur gel, et un bioanalyseur Agilent 2100 peut être utilisé. A ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre peut être utilisé pour évaluer l&#39;absorption à 260 nm en comparaison de l&#39;absorbance à 280 nm (figure 1). L&#39;A 260 / A 280 peut révéler la présence de contaminants et de donner des preuves de la dégradation possible. Un A 260 / A 280 de 1,9 à ​​2,0 est considéré comme acceptable. En outre, il est fortement recommandé que la dénaturation d&#39;un gel d&#39;ARN être exécuté pour évaluer l&#39;intégrité des ARN. Brins d&#39;ARN sera séparé sur base de leur taille, avec de petits brins migrent plus loin dans le gel. Un échantillon non dégradé apparaîtra comme un frottis avec deux bandes fortes. Le frottis est un résultat d&#39;une population de différents brins d&#39;ARNm de taille et les bandes correspondent aux ARNr 28S et 18S. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S (figure 2). Alternativement, une totale intégrité ARN peut être évaluée en utilisant une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics distincts représentant l&#39;ARNr 28S et 18S est attendue (figure 3). Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l&#39;aire sous les pics d&#39;environ 2:1, respectivement. Deux pics distincts ne sera pas observée dans les échantillons dégradés. Les échantillons d&#39;ARN présentant la dégradation ne doit pas être réalisée grâce à des procédures expérimentales ultérieures. Analyse spectrophotométrique peut être utilisé pour évaluer la qualité du produit d&#39;ADNc (figure 4). L&#39;A 260 / A 280 devrait être d&#39;environ 1,8. réactions d&#39;ADNc avec une entrée de 5 ug d&#39;ARN total systématiquement le rendement mg ​​1-2 de produit d&#39;ADNc dans notre laboratoire. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un spectre d&#39;échantillon d&#39;ARN NanoDrop. Après le nettoyage d&#39;ARN, la quantité d&#39;ARN et de la qualité peut être évaluée en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre. Environ 15 pg d&#39;ARN total élevé de qualité est systématiquement donné de 50 embryons de poissons zèbres avec un A 260 / A 280 autour de 1,9 à ​​2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un gel dénaturation ARN. Afin d&#39;évaluer l&#39;intégrité de l&#39;isolement d&#39;ARN total, un gel dénaturation ARN peut être couru. Un frottis avec deux bandes brillantes correspondant à l&#39;ARNr 28S et 18S est attendue. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Une trace d&#39;un échantillon d&#39;ARN à partir d&#39;un bioanalyseur. Afin d&#39;évaluer l&#39;intégrité de l&#39;isolement d&#39;ARN total, les échantillons peuvent aussi être analysés sur une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics, correspondant à l&#39;ARNr 28S et 18S, devrait être visible. Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l&#39;aire sous les pics d&#39;environ 2:1, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un spectre NanoDrop d&#39;un échantillon d&#39;ADNc. Analyse spectrophotométrique avec un NanoDrop ND-1000 peut être utilisé pour évaluer la quantité et la qualité du produit d&#39;ADNc. L&#39;A 260 / A 280 devrait être d&#39;environ 1,8. réactions d&#39;ADNc avec une entrée de 5 ug d&#39;ARN total régulièrement le rendement de 1 à 2 ug d&#39;ADNc dans notre laboratoire. Tableau 1. Composants à ajouter pour l&#39;ARN / mélanges amorce à l&#39;étape 2 de la synthèse de l&#39;ADNc. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> L&#39;ARN total (jusqu&#39;à 5 ug) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Mélange de dNTP 10 mM </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> DEPC eau traitée </td><td> ul n </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Mélange de réaction Tableau 2. Pour l&#39;étape 5 de la synthèse de l&#39;ADNc. Les volumes indiqués sont par réaction. Augmenter le volume de chaque composant pour le nombre total de réactions. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 10X tampon RT </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> 25 mM de MgCl2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM de DTT </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La fragilité de la molécule d&#39;ARN est le facteur le plus critique qui devrait se rappeler tout au long de ce protocole. Matériel stérile qui est RNAse free devrait toujours être utilisé dans une zone de RNAse free du laboratoire. Il est utile de réserver une partie du laboratoire pour être utilisés pour les procédures d&#39;ARN seulement. Cette zone doit être fréquemment pulvérisés avec un produit RNAse enlever, comme RNAse Away. Les échantillons d&#39;ARN devraient toujours être manipulés avec des ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Beaucoup de procédures de laboratoire importants et complexes nécessitent une entrée de haute qualité, l&#39;ARN intact. Un échantillon de dégradé ou de la présence d&#39;impuretés peuvent conduire à des résultats désastreux en aval des applications expérimentales. Il est donc primordial d&#39;utiliser des techniques solides avec de nombreuses garanties et des contrôles de qualité afin d&#39;assurer un échantillon de qualité supérieure. Ici, nous détaillons un protocole pour isoler l&#39;ARN total à partir d&#39;embryons de poisson zèbre entier en utilisant un dénaturant chimiques disponibles dans le commerce et le nettoyage subséquent pour enlever les traces de l&#39;ADN et les impuretés à l&#39;aide d&#39;un kit d&#39;isolation commerciale ARN. Comme l&#39;ARN est relativement instable et facilement sujettes au clivage par RNases, la plupart des protocoles d&#39;expression génique dosage en utilisant un produit d&#39;ADNc qui est directement synthétisée à partir d&#39;une matrice d&#39;ARN. Nous détaillons une procédure pour convertir l&#39;ARN dans le produit plus stable d&#39;ADNc en utilisant un kit disponible dans le commerce. Tout au long de ces procédures il ya de nombreux contrôles de qualité afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon n&#39;est pas dégradés ou contaminés. Le produit final de ces protocoles est d&#39;ADNc qui est approprié pour biopuces d&#39;analyse, la RT-PCR ou stockage à long terme.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

L&#39;isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l&#39;extraction d&#39;ARN à partir d&#39;embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l&#39;ADNc pour l&#39;application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l&#39;analyse des microréseaux d&#39;expression génique.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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37.7K vues.  Purdue University. L'isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l'extraction d'ARN à partir d'embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l'ADNc pour l'application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l'analyse des microréseaux d'expression génique.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marquage métabolique de l&#39;ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d&#39;expression génique de l&#39;ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...