En outre, nous remercions les chirurgiens cardiaques de l&#39;Université de Heidelberg pour la fourniture de tissu auriculaire humain et Claudia Liebetrau, Katrin Kupser et Ramona Nagel pour leur excellent soutien technique. Un merci spécial aussi à Andy W. Trafford pour ses suggestions et ses conseils lors de la mise en place des mesures transitoires 2 + Ca utiles. Les auteurs tiennent à exprimer leur profonde gratitude aux membres du Département de pharmacologie et de toxicologie (tête: Ursula Ravens) de l&#39;Université de technologie de Dresde pour l&#39;occasion ils nous ont offert d&#39;apprendre les techniques de base et des compétences en électrophysiologie cellulaire et l&#39;isolement des cardiomyocytes. Les recherches des auteurs est soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (Do769/1-1-3), le ministère fédéral allemand de l&#39;éducation et de la recherche à travers le réseau de compétence de la fibrillation auriculaire (01Gi0204) et le Centre allemand de recherche cardiovasculaire, l&#39;Union européenne par le biais l&#39;EuRéseau péenne pour la recherche translationnelle sur la fibrillation auriculaire (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, le projet d&#39;intégration à grande échelle, la proposition n ° 261057) et la fibrillation auriculaire Research Alliance Europe-Amérique du Nord (ENAFRA) subvention de la Fondation Leducq (07CVD03). La vue d&#39;ensemble schématique montré dans le fichier vidéo a été produite utilisant l&#39;art médical Servier.

Les protocoles expérimentaux doivent être approuvés par le comité d&#39;éthique local et tous les patients ont besoin de donner un consentement éclairé écrit. Notre recherche a été approuvé par le comité d&#39;éthique de la Faculté de médecine de Mannheim, Université de Heidelberg (# 2011-216N-MA) et a été réalisée en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé. 0. L&#39;obtention de tissu auriculaire humain Pendant les procédures de cathétérisme routine chez les patients subissant une chirurgie à coeur ouvert pour la circulation extracorporelle greffe, la pointe de l&#39;appendice auriculaire droit est habituellement retiré et peut être utilisé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes auriculaires. Après l&#39;excision de l&#39;échantillon de tissu est transféré immédiatement dans un tube Falcon de 50 ml avec du Ca 2 + libre stérile solution de transport contenant la 2,3-butanedione monoxime (tableau I; BDM, inhibiteur contractile, ce qui empêche des myocytes contracture). Avec des temps de transport entre 30 et 45 min, nous n&#39;avons pas reconnu un net avantage de refroidissement ou d&#39;oxygénation par rapport à la fois le nombre et la qualité des cardiomyocytes auriculaires isolées. Dans les transports en général au laboratoire doit être aussi rapide que possible. Toutefois, si le temps de transport plus ne peut être évitée, transport à 4 ° C dans une solution oxygénée pourrait être avantageux. 1. Préarrangements <ol><li> Allumez le thermocirculator, qui contrôle la température du récipient à double enveloppe (tableau II). Assurez-vous que la température dans le bécher est égal à 37 ° C. Recouvrir d&#39;un couvercle en verre pour maintenir une température constante à l&#39;intérieur du récipient à travers le processus d&#39;isolement ensemble. </li><li> Peser la collagénase I et protéase XXIV dans trois récipients en verre et stocker à température ambiante. Les enzymes seront dilués juste avant utilisation. </li><li> Magasin 20 ml de Ca 2 + solution libre dans une boîte de Petri à 4 ° C. </li><li>Magasin 250 ml de solution de Ca 2 + libre dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li></ol> 2. Nettoyage du tissu <ol><li> Transférer l&#39;échantillon de tissu avec la solution de transport dans une boîte de Pétri (~ 10 cm de diamètre) et enlever les tissus adipeux grossièrement avec des ciseaux. </li><li> Peser l&#39;échantillon de tissu. Entre 200 et 600 mg sont utilisés pour l&#39;isolement de cellules. Le tissu restant peut être congelé dans l&#39;azote liquide pour une analyse ultérieure biochimique. </li><li> Transférer l&#39;échantillon de tissu dans la boîte de Petri contenant 20 ml de Ca 2 + solution à 4 ° C (voir l&#39;étape 1.3) et hacher l&#39;échantillon de tissu en petits morceaux d&#39;environ 1 mm 3 dans la taille. </li><li> Les étapes suivantes doivent être exécutées à 37 ° C et sous gazage continu avec 100% d&#39;O 2. Un embout de pipette peut être placé sur le tube d&#39;oxygène pour éviter la formation de bulles et de forte générer un flux d&#39;air continu. </li><li> Transférer les morceaux de tissu avec la solution sans Ca + 2 endans le bécher enveloppe et mélangez soigneusement pendant environ 3 min avec un agitateur magnétique. </li><li> Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s&#39;installer pendant quelques secondes. Filtrer soigneusement le surnageant à l&#39;aide d&#39;un filet de nylon (200 um, tableau II). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher aide d&#39;une pince. </li><li> Remplir le bécher avec Ca 2 + solution libre et répéter l&#39;étape de lavage 2.4 et 2.5 deux fois. </li></ol> 3. Première digestion enzymatique <ol><li> Re-suspendre les morceaux de tissus avec 20 ml Enzyme solution E1 (tableau I) contenant de la collagénase et la protéase et mélangez soigneusement pendant 10 min. </li><li> Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. </li><li> Après filtrer le surnageant 35 min soigneusement à travers un tamis en nylon (200 um, Tableau II) de façon que la majeure partie des morceaux de tissu restent dans le bécher. Retour reposplu morceaux de tissus provenant de la maille dans le bécher. </li></ol> 4. Deuxième digestion enzymatique <ol><li> Reprendre les morceaux de tissus de nouveau avec 20 ml enzyme E2 solution contenant de la collagénase I seulement (tableau I). Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution immédiatement pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. </li><li> Au cours de la deuxième utilisation des ciseaux de digestion de couper davantage caillots de tissus parfois. </li><li> Après 5 minutes, prendre un échantillon à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur pour vérifier la dissociation des cellules. Répétez cette opération tous les 2-3 min jusqu&#39;à ce que la tige en forme de cardiomyocytes striés apparaissent. </li><li> Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s&#39;installer pendant environ 20-30 secondes. </li><li> Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, Tableau II) dans un tube de 50 ml Falcon (Tube A). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher. </li><li> Re-suspendre les morceaux de tissus dans le bécher avec 20 ml Storasolution GE (tableau I) 10 et plus dissocier les cellules par trituration mécanique douce à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique de 20 ml avec distributeur. Essayez d&#39;éviter la formation de bulles depuis bulles sont préjudiciables à la survie et la qualité cellulaire. </li><li> Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, tableau II) dans un ml Tube Falcon 50 (tube B). </li></ol> 5. Préparation finale et d&#39;adaptation de Final concentration de Ca2 + <ol><li> Centrifugeuse deux Falcon tubes A et B (voir l&#39;étape 4.5 et 4.7) à 95 g pendant 10 min. </li><li> Eliminer le surnageant de deux tubes soigneusement par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot. Jeter le surnageant. </li><li> Re-suspendre les boulettes dans une solution de stockage de 1,5 ml (tableau I) chacune (température ambiante). </li><li> Ajoutez deux fois 7,5 pi de solution à 10 mM CaCl2 à chaque Falcon et mélangez soigneusement. Incuber pendant 10 minutes après chaque étape. </li><li>Ajouter 15 ul d&#39;une solution à 10 mM CaCl 2 pour obtenir une finale Ca 2 + concentration de 0,2 mM. </li></ol> 6. Chargement des myocytes avec le Ca 2 + Fluorescent indicateur Fluo-3 AM (Figure 1) <ol><li> Transférer 1,5 ml de suspension cellulaire (tube A et / ou du tube B) dans un microtube de 2 ml (tube Eppendorf). </li><li> Les étapes suivantes doivent être exécutées à l&#39;étude de la sensibilité à la lumière du Ca 2 + indicateur fluorescent Fluo-3. </li><li> Dissoudre 50 mg du dérivé d&#39;ester acétoxyméthylique perméable de la membrane de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tableau III) dans 44 pl de la Pluronic F-127 (tableau III) solution (20% p / v dans du DMSO anhydre) pour obtenir ± 1 mm Fluo-3 heures solution mère, qui peut être conservé à -20 ° C pendant au maximum 1 semaine. </li><li> Ajouter 15 ul du Fluo-3 heures solution stock à la microtube contenant 1,5 ml de suspension cellulaire (voir l&#39;étape 6.1) et agitersoigneusement. </li><li> Incuber la suspension de cellules pendant 10 min dans une boîte optiquement opaque. </li><li> Centrifuger brièvement à environ 6000 rpm. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans une solution de bain de 1,5 ml (Tableau IV). </li><li> Laisser la suspension cellulaire pendant environ 30 min pour désestérification avant le début des expériences. </li></ol> 7. Simultanés patch-clamp et épifluorescence Ca 2 + Mesures Puisque les mesures de patch-clamp sont pas le sujet principal de cette étude, nous renvoyons le lecteur intéressé à d&#39;autres publications fournissant une description plus détaillée de cette technique. 11-14 Par souci d&#39;exhaustivité, nous donnons un bref résumé d&#39;un protocole pour mesurer potentiels d&#39;action ou de courants Ca 2 + de type L, les deux avec 2 enregistrements +-transitoires simultanées ca. Au cours d&#39;expériences myocytes sont perfusées à 37 ° C avec baignoire solutisur (Tableau IV) en utilisant un système de perfusion rapide (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Pour les expériences de potentiel imposé, courants K + sont bloquée par addition de 4-aminopyridine (5 mmol / L) et de BaCl 2 (0,1 mmol / L) à la solution du bain. Microélectrodes de verre borosilicate sont utilisés et auraient dû faire pencher résistances de 2-5 MQ quand il est rempli avec une solution pipette (Tableau V). En plus du Fluo-3 heures Chargement de la myocytes (voir l&#39;étape 6), Fluo-3 est également inclus dans la solution pipette (Tableau V). La fluorescence est excitée à 488 nm et la lumière émise (&lt;520 nm) converti en [Ca 2 +] i en supposant <img alt="Équation 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> où k d = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescence;. Fmax = Ca2 +-fluorescence saturée obtenue à la fin de chaque expérience 12 Les deux signaux électriques et épifluorescence Ca 2 + signaux sont enregistrés simultanément. Les potentiels d&#39;action sont stimulés à 0,5 Hz en mode courant-clamp avec 1 ms impulsions de courant de la force de seuil 1.2x. De type L de Ca 2 +-courants sont mesurés en mode voltage-clamp à l&#39;aide d&#39;un potentiel de maintien de -80 mV et une de 100 msec rampe impulsion à -40 mV à inactiver la Na +-courant rapide, suivie d&#39;une 100 msec test d&#39;impulsion de 10 mV à 0,5 Hz.

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Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

Worthington Biochemical Corp a soutenu cette publication en couvrant les coûts de production du fichier vidéo. Les bailleurs de fonds n&#39;a eu aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains des appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert. Pour utiliser ces myocytes pour les mesures de Ca 2 + cytosolique nous avons adapté une méthode décrite précédemment 4-11 en omettant EGTA à partir de la solution de stockage. Déjà en 1970, il a été observé que, bien que les myocytes se dissocient en présence de Ca 2 + au cours de la digestion, ils étaient tous dans contracture et non-viable. 16,17 conséquent, l&#39;isolement cellulaire est réalisée en Ca 2 + sans solution. Cependant, la réintroduction des concentrations physiologiques de Ca 2 + a entraîné rapide influx de Ca2 + et la mort cellulaire. Cela a été décrit comme le 2 + phénomène de paradoxe Ca qui a été initialement observée dans les coeurs perfusés par Zimmerman et Hulsman. 18 Des modifications des milieux d&#39;isolement, y compris la réduction du pH à 7,0, &lt;sup&gt; 19 plus de 20 taurin ou de petites quantités de Ca 2 + (voir l&#39;étape 3.2 et 4.1), 21 ainsi que le stockage des myocytes isolés dans EGTA contenant stockage solution 22 ont été suggérées pour éviter le Ca 2 + paradoxe. 17 Cependant, il est bien connu que Ca 2 + tampon par EGTA réduit l&#39;amplitude de type L Ca 2 + induite par le courant Ca 2 + amplitudes et les résultats dans une décroissance biphasique des transitoires de Ca2 transitoires. 23 Par conséquent, nous avons omis EGTA tout au long du processus d&#39;isolement ensemble afin d&#39;obtenir Ca 2 + transitoires avec des propriétés typiques et se désintègre monophasique. Afin de protéger les cellules du Ca 2 + paradoxe, nous avons augmenté la finale Ca 2 + concentration de la solution de stockage de manière progressive jusqu&#39;à 0,2 mm. Le choix de la collagénase est probablement l&#39;étape la plus critique pour la réussite de l&#39;isolement des myocytes. Coll conventionnelagenases sont des préparations brutes obtenues à partir de Clostridium histolyticum et contiennent collagénase en plus d&#39;un certain nombre d&#39;autres protéases, lipases et polysaccharidases. Sur la base de leurs collagénases générales de composition sont subdivisées en différents types. 24 Worthington collagénase de type I et II ont été utilisés avec succès pour l&#39;isolation des myocytes auriculaires humains. 4-10,15,25-30 Dans notre protocole décrit ici nous recommandons l&#39;utilisation de la collagénase Type I, mais nous avons également pu obtenir des quantités acceptables de cellules viables en utilisant la collagénase de type II. Cependant, même au sein d&#39;un seul type de collagénase il ya une variation de lot à lot significatif sur les activités enzymatiques. Ces variations nécessitent la sélection des lots attention et les essais des différents lots afin d&#39;optimiser la procédure d&#39;isolement. L&#39;outil disponible lots sélection en ligne de Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) peut être utilisé pour trouver des lots disponibles avec une composition qui a été montré pour être adapté à l&#39;isolation des myocytes auriculaires humains. Actuellement, nous utilisons la collagénase de type I avec 250 activité U / mg de collagénase, l&#39;activité 345 U / mg caséinase, activité 2,16 U / mg clostripaïne et 0,48 U / mg activité tryptique (lot # 49H11338). Les cellules obtenues en utilisant la procédure décrite dans ce manuscrit peuvent être utilisés dans les 8 h pour les études de patch-clamp, 2 + mesures transitoires de CA et une combinaison des deux. 15 En outre, ces cellules permettent des mesures de contraction cellulaire en réponse à une stimulation de champ électrique ou la stimulation électrique à l&#39;aide de la pipette de patch-clamp (observations non publiées).

L&#39;étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l&#39;exploration de Ca 2 + cellulaire anomalies de manutention nécessitent cardiomyocytes isolés. Ils sont généralement obtenus à la suite de l&#39;exposition à in vitro d&#39;échantillons de tissus cardiaques aux enzymes digestives (collagénase, hyaluronidase, peptidase, etc.) Depuis le premier rapport de l&#39;isolement des myocytes cardiaques viables en 1955 2 une grande quantité de protocoles a été développé dans le but de récolter des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires simples de différentes espèces, y compris souris, rat, lapin, chien, cochon Guinée et humain. Dans cette revue, nous nous concentrons sur l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains. En ce qui concerne les procédures d&#39;isolement des myocytes d&#39;autres espèces que nous appelons le &quot;Guide de Worthington Tissue dissociation» fourni par Worthington Biochemical Corp, USA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 Ici nous fournissons une description étape par étape, d&#39;une technique, qui est une adaptation d&#39;une méthode publiée précédemment, afin de obtenir myocytes auriculaires appropriés non seulement pour les expériences de patch-clamp, mais aussi pour Ca2 + intracellulaire mesures simultanées. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

L&#39;étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l&#39;exploration de l&#39;cardiaque Ca 2 + cellulaire anomalies manipulation nécessite cardiomyocytes isolés. En outre, la possibilité d&#39;enquêter sur les myocytes de patients utilisant ces techniques est une condition indispensable d&#39;élucider les bases moléculaires des maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire (FA). 1 Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains qui sont adaptés à la fois études de patch-clamp et des mesures simultanées des concentrations de Ca 2 +. Tout d&#39;abord, appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert sont coupés en petits morceaux de tissus («méthode du morceau&quot;) et lavées dans Ca 2 + sans solution. Puis les morceaux de tissus sont digérés dans la collagénase et la protéase contenant des solutions avec 20 uM Ca 2 +. Par la suite, les myocytes isolés sont harvested par filtration et la centrifugation de la suspension de tissu. Enfin, la concentration en Ca2 + dans la solution de stockage de cellules est ajusté par paliers de 0,2 mM. Nous discuterons brièvement le sens de Ca 2 + et Ca 2 + en mémoire tampon au cours du processus de séparation et aussi fournir des enregistrements représentatifs de potentiels d&#39;action et des courants de la membrane, à la fois simultanée avec Ca 2 + mesures transitoires, réalisée dans ces myocytes isolés.

La figure 2A montre trois exemples représentatifs de droits de myocytes oreillette droite isolés. Pour quantifier le rendement cellulaire nous pipette 10 ul de la suspension cellulaire (étape 5.5) sur une lame de microscope CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Les rendements des cellules moyennes dans la figure 2B indiquent clairement qu&#39;il ya une tendance à la baisse des rendements des cellules en chronique AF (CAF) des échantillons de patients (d&#39;un tube: 16,5 ± 3,1 cellules/10 pi (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 cellules/10 ul (n = 10) SR et de la CAF, respectivement, p &lt;0,05; Tube B: 17,9 ± 3,9 cellules/10 ul (n = 29) vs 5,9 ± 2,0 cellules/10 ul (n = 9) SR et de la CAF, respectivement, p = 0,107). Des exemples représentatifs de mesures d&#39;action potentiels et des enregistrements simultanés de Ca 2 + cytosolique transitoires sont donnés dans la figure 3. Dans environ 90% des cellules étudiées, tIl potentiel d&#39;action déclenché par Ca 2 + provoque des contractions de cellules claires et régulières. Comme indiqué précédemment, le potentiel de membrane au repos, ce qui est un indicateur reconnu pour l&#39;intégrité des cellules, en moyenne de -73.9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytes / patients) et -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytes / patients ) en SR et de la CAF, respectivement (p&gt; 0,05). 15 La figure 4 montre des enregistrements simultanés représentatifs de voltage-dépendant de type L Ca 2 + et courants Ca 2 + cytosolique transitoires. Application de la isoprénaline agoniste β-adrénergique non sélectif (1 nM) augmente les amplitudes des deux I Ca, L et cytosolique de Ca 2 + transitoires, suggérant intact β-adrénergique cascade de transduction du signal. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme des myocytes Fluo-3 heures chargement protocole (voir l&#39;étape 6,1-6,5). m / v, masse / volume. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figure 2. A, isolés myocytes auriculaires droits humains après une heure dans une solution de stockage. B, moyenne ± SEM du rendement des cellules comptées dans 10 pi de cellules dans une solution de stockage (voir l&#39;étape 5.5). n désigne le nombre de préparations à l&#39;intérieur de chaque groupe. * P &lt;0,05. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figure 3. Enregistrements représentatifs du potentiel d&#39;action déclenché par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d&#39;un rythme sinusal et une chrONIC patients de fibrillation auriculaire. Top: courant injecté membrane (I M) utilisée pour la stimulation (0,5 Hz). Ci-dessous: l&#39;enregistrement simultané du potentiel de membrane (V M), et le chat déclenchée (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figure 4. Enregistrements représentatifs de l&#39;(1 M) effet isoprénaline sur L-Type courant Ca 2 + déclenchée par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d&#39;un rythme sinusal et un patient atteint de fibrillation auriculaire chronique. Top: Voltage-clamp protocole (0,5 Hz). Ci-dessous: enregistrement simultané de membrane total net courant (I M), reflétant principalement de type L Ca 2 + Cat actuel (au milieu) et déclenché (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tableau 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tableau I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tableau 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tableau II. Equipements spécifiques. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tableau 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Le tableau III. Substances pour le chargement des myocytes avec Fluo-trois heures. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tableau 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tableau IV. solution pour bain de patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tableau 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Pipette solution de tableau V. de patch-clamp *.

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Nous décrivons l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mesures en combinaison avec des études de patch-clamp électrophysiologie.

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.2K vues.  University of Duisburg-Essen. Nous décrivons l'isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de Ca 2 + Mesures en combinaison avec des études de patch-clamp électrophysiologie.

Vidéo: Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Recherche

Biologie

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Méthodes pour l&#39;isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

La cartographie simultanée et au dosage des ribonucléotides dans l’ADN Mitochondrial humain

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...