Nous tenons à remercier le Dr Claycomb pour fournir des cellules HL-1 et le protocole d&#39;entretien détaillé. Nous tenons également à remercier Mme Elena Carrillo et le Dr Seth Robia pour leur aide à générer le film cellulaire et M. Pete Caron pour son aide à la rédaction des accessoires pour notre double système de cartographie optique canal. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 à XA), National Institutes of Health (HL113640 à XA), et le Fonds de l&#39;Université Loyola de recherches pour le développement (à XA).

1. Solution Préparation <ol><li> Noradrénaline (NP) solution <ol><li> Dissoudre 40 mg de NP dans 25 ml de 30 mM d&#39;acide ascorbique (0,1475 g d&#39;acide ascorbique dans 25 ml d&#39;eau Milli-Q (MQ) de l&#39;eau purifiée. Éviter l&#39;exposition lumière directe lors de cette préparation de solution, car la noradrénaline (NP) est sensible à la lumière. </li><li> Filtrer la solution à NP avec un filtre à seringue de 0,22 um. Aliquoter la solution dans 1 ml microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Une fois congelés, NP est stable pendant un mois. </li></ol></li><li> Complété Laver et final Claycomb médias <ol><li> Commencez avec 43,5 ml de milieu Claycomb et de compléter avec 5 ml de sérum de veau fœtal (FBS), 0,5 ml de pénicilline / streptomycine, 0,5 ml de NP et 1: 100 diluée L-glutamine pour faire 50 ml de milieu final Claycomb complétée. Éviter l&#39;exposition de la lumière directe pendant cette préparation de la solution parce moyenne Claycomb est sensible à la lumière. </li><li> Préparer le milieu de lavage Claycomb utilisant la même recette que l&#39;supmoyenne complétée Claycomb sauf ajouter 5% de FBS et omettre le NP et les composants de la L-glutamine. NOTE: Les médias final et Wash Claycomb complété sont bons pour deux semaines lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C sans exposition à la lumière directe. </li></ol></li><li> Trypsine de soja solution inhibitrice <ol><li> Dissoudre 25 mg d&#39;inhibiteur de trypsine de soja dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate sans Ca et Mg libre de Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre à seringue de 0,22 um. REMARQUE: La solution stérilisée est stable pendant un mois lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C. </li></ol></li><li> solution de gélatine / fibronectine plat revêtement <ol><li> Dissoudre 0,1 g de gélatine dans 500 ml d&#39;eau MQ pour faire 0,02% de gélatine. </li><li> Autoclave, puis diluer 1 ml de fibronectine dans 199 ml de 0,02% de gélatine et mélanger délicatement. </li><li> Aliquote 6 ml de solution de gélatine dans des tubes séparés et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> La solution de sel de Hank <ol><li> Utiliser un émoiplaque, dissoudre les sels suivants dans l&#39;eau MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1,261). </li></ol></li><li> Calcium colorant sensible (Rhod2) solution <ol><li> Diluer 1 mg de poudre sèche Rhod2 dans 400 pi de 20% de Pluronic F-127 dans du DMSO pour faire un Rhod2 colorant solution de stock et conserver à -20 ° C. </li><li> Diluer cette solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Tension colorant sensible (Rh237) solution <ol><li> Diluer 5 mg de Rh237 avec 2 ml de DMSO pour faire une solution de stock et conserver à -20 ° C. Diluer la solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l&#39;expérience. </li></ol></li></ol> &amp; #160; REMARQUE: 04.01 solutions sont basées sur le HL-1 Claycomb protocole de culture cellulaire avec des modifications mineures. 2. Le repiquage et culture des HL-1 auriculaire myocytes sur des lamelles NOTE: Les cellules HL-1 peuvent être obtenus auprès du Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Cultivez HL-1 cellules dans des flacons T25 et nourrir avec 5 ml d&#39;complétée Claycomb moyenne quotidienne. Passage des cellules en flacons T25 tous les cinq jours selon la Claycomb HL-1 protocole de culture cellulaire (décrite ci-dessous) 10. </li><li> La place des lamelles rondes (diamètre 20 mm) en culture à 12 puits des plaques de 24 heures avant que les cellules dans le flacon T25 sont entièrement confluentes et prêtes à être repiquées, puis couvrir les lamelles avec de la gélatine / de la fibronectine pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> Le lendemain, aspirer et jeter la gélatine / fibronectine des plaques de culture et le remplacer par 1,5 ml de milieu supplémenté final Claycomb dans chaque puits. </li><li> Fractionner les cellules d&#39;une cultur T25e flacon après avoir atteint pleine confluence au jour 5. Aspirer le milieu du flacon T25 contenant la culture de confluence et rincer la culture rapidement avec du PBS à 37 ° C. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C en pipetant la trypsine / EDTA dans le fond du flacon T25 pour éviter le contact direct avec les cellules. Incuber à 37 ° C pendant 1 min. </li><li> Retirer la trypsine / EDTA par aspiration et ajouter un autre 1,3 ml de trypsine / EDTA par flacon T25. Incuber à température ambiante pendant 1 min. Examiner sous un microscope et si les cellules sont encore attachés au ballon, appuyez sur pour déloger entièrement cellules restantes. </li><li> Ajouter 1,3 ml d&#39;inhibiteur de trypsine de soja pour les cellules et les cellules de transfert à partir de la fiole dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Rincer la fiole vide avec 5 ml de milieu de lavage Claycomb. Ajouter le liquide de rinçage pour les cellules dans le tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot cellulairedans 6 ml de milieu supplémenté final Claycomb. </li><li> Ensemencer chaque puits d&#39;une plaque à 12 puits avec 0,5 ml de suspension de cellules à partir de passages de cellule. Nourrir les cellules avec un milieu frais complété final Claycomb quotidienne. REMARQUE: Surveiller de près la croissance des cellules, généralement les monocouches de cellules confluentes atteindre le statut le jour 4 et les activités spontanées restent visibles. Ensuite, la culture monocouche sera prêt pour la cartographie optique sur 4-5 jours. </li></ol> 3. Chargement de calcium et de tension colorants sensibles aux cellules <ol><li> Pour les études de cartographie optique, retirez délicatement la lamelle de la plaque de culture cellulaire de 12 puits et rincer avec la solution de sel de Hanks. </li><li> Pour colorer les cellules avec le colorant sensible Ca Rhod2, incuber la monocouche de cellules sur la lamelle couvre-objet avec 3 ml de la oxygénée (barbotage avec 5% de CO2 / 95% d&#39;O 2 gazeux) de la solution de travail Rhod2 à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 30 min . </li><li> Pour colorer les cellules avec V m colorant sensibleRh237, immerger la monocouche cellulaire Rhod2 chargé dans 3 ml de solution de travail Rh237 oxygénée à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 15 min. </li></ol> Cartographie 4. Double canal optique <ol><li> Placer la monocouche cellulaire, qui est coloré avec du double-V m colorants et Ca, dans une chambre de circulation sur un microscope à fluorescence inversé. Utiliser un système de circulation chauffé pour maintenir la température de la chambre de cellule à 35 ± 1 ° C. Contrôler soigneusement la température du liquide de perfusion en réglant la vitesse du flux circulant à travers la chambre afin d&#39;éviter un gradient de plus de 0,3 ° C à travers la chambre. <ol><li> Avant d&#39;enregistrer V m / signaux Ca, laver la monocouche cellulaire avec une solution fraîche Hanks pendant environ 5 min pour éliminer le colorant reste des étapes de coloration précédentes. </li></ol></li><li> Pace monocouches de cellules en bonne santé en utilisant une électrode bipolaire composée d&#39;une pipette en verre rempli d&#39;une solution saline de Hanks et un silver fil enroulé autour de la pointe de la pipette comme décrit précédemment 12,17. </li><li> Pace monocouches de cellules saines à une longueur de cycle de 200-500 ms et de largeur d&#39;impulsion de 2 ms, attendent un seuil de stimulation à environ 1 mV. NOTE: Pour chaque lot de monocouches de culture, au moins deux monocouches non traitées doivent être utilisés pour tester l&#39;état de la charge de la cellule. Monocouches témoins en bonne santé devraient être en mesure d&#39;être capturé par la stimulation électrique à la durée du cycle de 200-500 ms. Si les monocouches de contrôle ne parviennent pas à être électriquement rythme, cela suggère que l&#39;ensemble du lot de cellules peut ne pas convenir pour des expériences de cartographie optique. </li><li> Pour exciter à la fois m et V Ca colorants sensibles, utiliser une source de lumière à LED (520 nm de longueur d&#39;onde) couplé à un filtre d&#39;excitation (510 nm / 40) et un miroir dichroïque (561 nm). <ol><li> Recueillir les signaux fluorescents émis par les cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;un objectif 40X et divisée avec un miroir dichroïque (594 nm) dans un composant de m V et d&#39;un composant de Ca.On filtre la lumière émise dans le canal de m V avec un filtre passe longue (700 nm) et la lumière émise dans le canal de Ca avec un filtre passe-bande (585/40 nm). </li><li> Collecter la lumière fluorescente filtrés en utilisant deux caméras CCD (80 x 80 pixels, 1000 fps; redshirt imagerie). </li><li> Pour éviter colorant photoblanchiment, faire des enregistrements pour les moins de 2 s sur chaque champ de vue de limiter le temps d&#39;exposition à la lumière. Ici, l&#39;image généralement quatre domaines différents pour chaque monocouche. </li></ol></li></ol> 5. Traitement des données de V m ou Ca Recordings <ol><li> Pour les deux V m et signaux Ca (80 x 80 pixels), la moyenne des valeurs d&#39;intensité de vingt-cinq (5 x 5) pixels voisins dans une valeur d&#39;intensité à différents points de temps d&#39;enregistrement pour réduire le bruit de fond. NOTE: Après le calcul de la moyenne de données, chaque point de la durée d&#39;enregistrement d&#39;un potentiel d&#39;action individuelle ou transitoire Ca donne une matrice de données contenant 16 x 16 valeurs d&#39;intensité moyenne (moyennedes canaux de données) avec une résolution spatiale de 50 um. </li><li> Définir temps d&#39;activation (AT) des signaux enregistrés Ca m V ou. <ol><li> Pour définir un temps d&#39;activation (AT) d&#39;un potentiel d&#39;action individuel ou Ca transitoire, déterminer le temps de 50% de l&#39;amplitude de crête des signaux de Ca en utilisant un algorithme basé sur MATLAB sur mesure m V ou comme décrit précédemment. 12 </li><li> Manuellement relire l&#39;AT analysé pour éliminer les erreurs qui peuvent survenir lors de l&#39;analyse du programme. </li><li> Stocker les AT matrice définie (16 x 16 en moyenne canaux de données) de potentiel d&#39;action enregistrée et transitoire de calcium, respectivement, dans le logiciel utilisé. </li></ol></li><li> Calculer potentiel d&#39;action ou de calcium transitoires vitesse de conduction (CV) des vecteurs de la matrice à l&#39;aide de la méthode d&#39;analyse du champ de vecteur tel que décrit précédemment avec des modifications mineures 12,18. <ol><li> Calculer le vecteur de CV d&#39;un canal de données par rapport à son environnement à des points de données (5 ×; 5 voisine moyenne canaux de données) pour simuler une surface polynomiale lisse du temps d&#39;activation (à la surface) en utilisant un algorithme des moindres carrés dans le programme MATLAB 12,18. </li><li> Calculer vecteur de conduction en utilisant les formules ci-dessous Formule 1: <img alt="Equation 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formule 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] REMARQUE: Ve est un vecteur de CV projeté à x et y axes; dx / dt est la projection du vecteur de CV en abscisse; dy / dt est la projection du vecteur de CV dans l&#39;axe y. T est la surface AT; x, y désignent les coordonnées de la 2-D; T x = ∂T / ∂x est la dérivée partielle de T par rapport à x; T y = ∂T / ∂y est la dérivée partielle de T par rapport à y; θ est la direction finale d&#39;un vecteur de CV. </li><li> Groupe tous les vecteurs de la matrice AT dans 36 voies, dont chacun couvre un secteur de dix degrés sur la boussole. &lt;/ Li&gt; <li> Sélectionnez la voie contenant la plus grande population des vecteurs CV parmi les 36 voies de conduction. Calculer le CV moyen de cette voie pour représenter le CV de la monocouche. </li></ol></li></ol> 6. Visualisation de la Propagation front d&#39;onde <ol><li> Normaliser l&#39;intensité du signal d&#39;un potentiel d&#39;action individuelle ou Ca transitoire à différents points par rapport à sa valeur maximale en utilisant un logiciel MATLAB de temps d&#39;enregistrement. </li><li> Stocker temporairement les données d&#39;intensité normalisées de tous les points de temps enregistrée dans une matrice de 16 x 16 intensité dans le logiciel MATLAB utilisé. </li><li> Construire une carte à code couleur intensité de la matrice d&#39;intensité stockées de chaque point de temps d&#39;enregistrement en utilisant la fonction de surf.m. NOTE: Dans la carte d&#39;intensité, rouge représente haute intensité des signaux Ca m V ou, et bleu reflète faible intensité des signaux de fluorescence. </li><li> Créer un fichier .avi en utilisant la fonction de avifile.m. </li><li> Conservez toutes les icartes ntensity à différents points de temps d&#39;enregistrement du potentiel d&#39;action ou Ca transitoire en utilisant la fonction de addframe.m. NOTE: A ce stade, deux fichiers avi séparés de V m et Ca propagation seront générés. </li></ol>

<ol>
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No conflicts of interest declared.

Cet article décrit les aspects clés de la cartographie optique dans une culture HL-1 auriculaire myocytes monocouche colorées avec calcium et de tension colorants fluorescents sensibles. Il comprend la culture d&#39;un HL-1 monocouche cellulaire optimale, la configuration de l&#39;équipement de la cartographie, la cartographie d&#39;une monocouche de culture, et l&#39;analyse des données. Pour cartographier avec succès des cellules en culture, l&#39;essentiel est de préparer une monoc...

Un uniques calcium (Ca) et la tension (V m) technique de cartographie optique double canal 1-5 est en train de devenir un outil efficace pour enregistrer simultanément V m et Ca signaux dans les deux coeurs intacts et des monocouches de cellules cultivées. Cette technique permet d&#39;obtenir des informations puissante concernant la relation entre les transitoires de calcium et potentiels d&#39;action afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents électrophysiologiques d&#39;arythmies cardiaques. Des monocouches de cellules cultivées se sont avérés être un modèle utile pour étudier cellulaire électrophysiologie cardiaque et le mécanisme sous-jacent d&#39;arythmies. 4,6-8 HL-1 sont des cellules d&#39;une ligne de culture des myocytes auriculaires bien caractérisé. cellules HL-1 maintiennent également un génotype et le phénotype différencié unique qui comprend morphologique, électrophysiologique, et les caractéristiques pharmacologiques de myocytes auriculaires adultes. Ces cellules expriment des gènes et des protéines cardiaques, y compris important canaux ioniques cardiaque (ce est à dire, L et canaux calciques de type T) 9 et matures isoformes de protéines contractiles sarcomériques trouvent normalement dans les myocytes auriculaires adultes que les autres et nous avons indiqué précédemment. 10-13 En outre, HL-1 cellules peuvent être cultivées pour former un 2 dimensions (2-D) myocytes monocouche. Ainsi, les avantages de l&#39;utilisation de culture des monocouches de HL-1 comprennent: 1) coût relativement bas et plus facile à maintenir une ligne de la culture des myocytes que d&#39;isoler et cultiver les myocytes néonataux primaires; 2) une monocouche confluente de cellules réduit la complexité de structure qui résultent de la structure 3-D du coeur; 3) une monocouche cellulaire peut éliminer l&#39;interférence de la fibrose interstitielle qui se produit dans le coeur intact. Ceci peut être utilisé pour disséquer les fonctions électrophysiologiques spécifiques d&#39;un groupe de myocytes sans interférence des fibroblastes et la matrice interstitielle; 4) l&#39;évaluation des conséquences fonctionnelles de la manipulation pharmacologique ou génétique en culmonocouches de cellules turés peuvent être effectivement atteints. Par conséquent, HL-1 cellules sont devenues un modèle cellulaire largement utilisé pour étudier divers aspects de la physiologie myocytes ainsi que les activités électriques anormales induite stimulation. 13-16 Cependant, un traitement spécial et des soins est requis à la culture des monocouches de cellules saines qui répondent à l&#39;extérieur la stimulation électrique pour les études de cartographie optiques. En outre, double procédure colorant fluorescent coloration peut facilement endommager l&#39;intégrité des monocouches de cellules confluentes cultivées. Ainsi, l&#39;exécution V m / CA double canal cartographie optique de culture HL-1 monocouches a été un grand défi. L&#39;objectif de cette méthode est de fournir les étapes clés pour effectuer avec succès cartographie optique double canal en culture HL-1 monocouches. Ici, nous avons fourni de nombreux détails sur un protocole optimisé pour une préparation monocouche HL-1 de la cellule, cartographie optique à deux canaux d&#39;une monocouche de cellules cultivées, et le traitement des données de cartographie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Cartographie optique se est avérée être une technique utile pour détecter l&#39;activité électrique cardiaque à la fois ex vivo intact cœurs et dans des monocouches de myocytes cultivés. cellules HL-1 ont été largement utilisés comme un modèle cellulaire 2 dimensions pour étudier divers aspects de la physiologie cardiaque. Cependant, il a été un grand défi à la carte optiquement calcium (Ca) transitoires et potentiels d&#39;action simultanément à partir du même champ de vision dans une culture cellulaire HL-1 auriculaire monocouche. Ce est parce que la manipulation spéciale et de soins est nécessaire pour préparer les cellules saines qui peuvent être capturées électriquement et optiquement mappés. Par conséquent, nous avons développé un protocole de travail optimal pour la cartographie optique double canal. Dans ce manuscrit, nous avons décrit en détail comment réaliser l&#39;expérience de cartographie optique double canal. Ce protocole est un outil utile pour améliorer la compréhension de l&#39;action potentielle propagation et la cinétique Ca dans le développement de l&#39;arythmie.

Une monocouche confluente culture présente un rythme intrinsèque régulière comme l&#39;a démontré dans Movie 1. Nous avons ensuite effectué V m / Ca cartographie optique double canal dans un cadre entièrement confluentes HL-1 monocouche. Figure 1A montre des exemples de traces de V m et signaux Ca à partir d&#39;une seule enregistrée battre. Cartes isochrones propagée uniformément représentatifs de m V et des signaux de Ca en utilisant le sy...

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.1K vues.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Entretien et nettoyage du microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Recherche

Biologie

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

Enregistrement optique de l&#39;activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Photoconversion de protéines purifiées fluorescentes et double-sonde optique dans Soulignant cellules vivantes

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...