Ce protocole fonctionne avec des échantillons provenant de cœurs humains et animaux, même après des heures de temps de transport. Jusqu’à 200 myocytes par milligramme peuvent être isolés à partir de tranches de tissu coupées en vibratome. L’analyse électrophysiologique, structurale et biochimique des cardiomyocytes, aide à découvrir et à mieux comprendre, les mécanismes de la maladie cardiaque.
Après avoir rempli un plat de culture tissulaire de 100 millimètres, avec 20 millilitres de solution de coupe à froid, placez l’échantillon de tissu dans le plat de culture. Garder le plat de culture dans une assiette refroidie à 4 degrés Celsius. Gardez à l’esprit que les échantillons de tissus vivants provenant d’animaux et surtout d’humains sont potentiellement infectieux.
Utilisez des ciseaux ou du scalpel, pour éliminer l’excès de tissu fibreux et de graisse épicurienne, de l’échantillon. Pour un traitement vibratome optimal des échantillons de tissus plus gros, utilisez le scalpel pour couper huit cubes millimétriques du tissu. Pour les échantillons plus petits provenant de biopsies, ce n’est pas nécessaire.
On peut identifier l’épidardium par la couche épidérien de graisse. Après avoir enlevé l’excès de graisse, placer le bloc tissulaire, dans le plat, avec l’épidardium face vers le bas. Pour se préparer à l’intégration des tissus, faire bouillir 400 milligrammes de point de fusion faible agarose en dix millilitres de solution de coupe.
Remplir une seringue de dix millilitres avec le gel d’agarose dissous chaud. Sceller la seringue et la placer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes, pour permettre à l’agarose d’équilibrer. À l’aide de forceps, déplacez le spécimen de garniture dans un plat propre de culture tissulaire de 35 millimètres, avec l’épidardium orienté vers le bas.
Ensuite, retirez l’excès de liquide de l’échantillon, à l’aide d’un écouvillon stérile. Sécurisez le spécimen contre le mouvement, en le tenant avec des forceps. Et vider la seringue d’agarose au-dessus de celui-ci, en s’assurant d’immerger complètement le spécimen.
Placez immédiatement le plat sur la glace et laissez l’agarose se solidifier pendant 10 minutes. Montez une lame de rasoir inutilisée sur le porte-lame du vibratome. Si possible, calibrez le vibratome en ajustant la déviation Z de la lame.
Utilisez un scalpel pour exciser un bloc de tissu agarose qui s’adapte au porte-spécimen du vibratome. Pour assurer la stabilité, assurez-vous que le tissu est encore suffisamment immergé dans l’agarose. Avec des marges agarose, d’au moins huit millimètres.
Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate sur le porte-spécimen. Et appuyez doucement sur le bloc de tissu agarose, sur le support. Construire un bain vibratoire, avec solution de coupe.
Ensuite, remplissez le réservoir de refroidissement extérieur du vibratome de glace concassée, pour maintenir une température de quatre à six degrés Celsius, tout au long du processus de coupe. Placez le porte-spécimen, contenant le bloc de tissu agarose, dans le bain vibratoire. À l’aide des paramètres vibratoires décrits dans le manuscrit, générer 300 tranches épaisses de microlitres.
Il est crucial de créer des sections dans l’épidardium parallèle parce que c’est ainsi que les fibres de cardiomyocyte sont alignées dans la paroi ventriculaire. Sinon, il y aura trop de dégâts. Utilisez un microscope léger standard, pour vérifier l’alignement des cardiomyocytes et des tranches de tissu.
Pour éviter d’endommager le tissu, maintenez l’agarose, au lieu du tissu lui-même. Une fibre de cardiomyocyte, doit être uniformément alignée et les myocytes, ne devraient pas être contractés. Placez une plaque chauffante sur le shaker de laboratoire et réchauffez-la à 37 degrés Celsius.
Démarrez le shaker de laboratoire à 65 RPM. Dissoudre la proteinase en deux millilitres de solution 1. Et dissoudre la collagène, en deux millilitres de solution 1.
Mais ne mélangez pas la proteinase et la collagène. Ajouter du chlorure de calcium à la solution de collagène, pour une concentration finale, de cinq micromolaires. Incuber les deux solutions à 37 degrés Celsius.
Utilisez des forceps pour transférer une tranche de tissu dans un plat propre de culture tissulaire de 60 millimètres. Avec cinq millimètres de solution de coupe pré-réfrigérée. En gardant le plat sur de la glace ou une assiette froide, retirez soigneusement l’agarose du tissu, à l’aide d’une lame ou de forceps.
Pour effectuer le lavage initial des tranches de tissu, placez un plat propre de culture tissulaire de 35 millimètres sur la lame de chaleur. Et remplissez-le, avec deux millimètres de solution préchauffée un. Transférer une ou deux tranches de tissu dans le plat préparé.
Ensuite, utilisez une pipette d’un millimètre, pour les étapes de lavage. Après avoir lavé les tranches, retirer la solution une du plat et ajouter deux millilitres de la solution proteinase. Incuber les tranches pendant 12 minutes sur la lame de chaleur, avec le shaker à 65 RPM.
Lavez les tranches de tissu deux fois plus, avec deux millilitres de solution préchauffée un. Ensuite, retirez la solution un du plat et ajoutez deux millilitres de solution de collagène. Incuber les tranches pendant au moins 30 minutes sur la lame de chaleur, en secouant à 65 rPM.
Après 15 minutes d’incubation, vérifiez les myocytes individuels gratuits, en examinant le plat au microscope léger. Continuez à vérifier toutes les cinq minutes, jusqu’à ce que les myocytes individuels soient visibles. Puis, alt digestion en lavant les tranches deux fois, avec deux millilitres de solution préchauffée deux.
Et remplissez le plat, avec deux millilitres de solution deux. Tirez soigneusement les fibres de la tranche de tissu à part, à l’aide de forceps fins. Continuez à travailler prudemment, pour éviter d’endommager les cardiomyocytes.
Et pipette plusieurs fois, avec une seule utilisation passé votre pipette. Ensuite, confirmez que les cardiomyocytes en forme de tige se sont séparés, en examinant le plat, sous un microscope léger. Remettre le plat sur la plaque chauffante à 37 degrés Celsius et agiter en secouant.
En ajoutant des solutions de stock de chlorure de calcium de 10 millimoirs et de 100 millimlaires, augmentez lentement la concentration en calcium de la suspension tissulaire de cinq micromolaires à 1,5 millimolaire. Lorsque l’augmentation du calcium est terminée, utilisez des forceps pour enlever les morceaux de tissu non digérés restants. Tout d’abord, arrêter l’agitation de la suspension.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, retirez lentement 1/3 de la solution, du haut de la suspension. Évitez l’aspiration des cardiomyocytes. Puis ajouter 700 microlitres de solution trois, aux cellules.
Après 10 minutes d’agitation, répétez ces étapes de lavage. Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Et permettre aux cardiomyocytes de sédimenter à température ambiante, pendant au moins 10 minutes et un maximum de 30 minutes.
Retirer complètement le surnatant. Et résuspendez la pastille dans la solution tyrode modifiée ou le tampon d’expérimentation désiré. À l’aide d’un microscope léger, vérifiez la qualité des cellules.
30 à 50% des cardiomyocytes doivent être en forme de tige, lisses sans saignements membranaires. Et affichage, striations croisées claires. Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été appliqué au myocarde du rat.
Et comparé à l’isolement par perfusion coronaire et isolement, de petits morceaux de tissu. Une proportion plus faible de cellules en forme de tige a été observée lors de l’utilisation du protocole, puis après l’isolement par perfusion. Mais le nombre total était encore élevé.
En revanche, l’isolement des morceaux de tissu, a donné moins de cellules en forme de tige. Cytométrie de flux, a été utilisé pour comparer les résultats quantitativement. L’isolement des cardiomyocytes des tranches de tissu, n’atteint pas le rendement obtenu par perfusion coronaire.
Mais fournit, des rendements significativement plus élevés que l’isolement des myocytes, à partir de morceaux de tissu. Ensuite, le protocole a été appliqué au myocarde humain. L’isolement des tranches myocardiques, a donné des nombres hyde et une grande proportion de myocytes humains en forme de tige.
Et seulement une petite proportion de cardiomyocytes arrondis. L’isolement des tranches myocardiques, a eu comme conséquence un nombre étonnamment plus élevé de myocytes tige-formés, que l’isolement des morceaux de tissu. La quantification photométrique a confirmé une viabilité sensiblement plus élevée de myocyte après isolement des tranches myocardiques.
Les cellules humaines, isolées avec le protocole décrit, peuvent faire l’objet d’une analyse structurelle. La coloration d’actinine d’Alpha, a indiqué un modèle régulier dense de ligne de Z et une longueur moyenne de sarcomere de 1.92 micromètres, dans les cardiomyocytes de repos. La coloration de LTCC et de RyR, a montré l’amas clair est co-localisé près de la membrane cellulaire et des tubules de T.
Les cardiomyocytes isolés étaient excitables et pouvaient être utilisés pour des études sur l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage de contraction d’excitation. La forme et la durée potentielles d’action, étaient dans la gamme rapportée par d’autres, pour des cardiomyocytes ventriculaires, des coeurs humains défaillants. Les transitoires de calcium enregistrés par balayage de ligne vocale de Khan, ont montré une upstroke claire après stimulation.
Et, un rapport signal/bruit acceptable. Le raccourcissement des cardiomyocytes par contraction peut être vu à partir de la déviation de la bordure cellulaire inférieure. En raison du nombre élevé de cardiomyocytes isolateurs obtenus par ce protocole, la culture cellulaire est possible.
Cela peut permettre le transfert de gènes, les tests pharmacologiques et l’ingénierie tissulaire des cardiomyocytes humains. Une application importante, est la vérification des résultats, à partir de modèles animaux dans les cellules humaines. L’insuffisance cardiaque est un syndrome clinique avec des options thérapeutiques très limitées.
L’amélioration des techniques d’isolement des cardiomyocytes aidera à identifier les cibles cellulaires pour le diagnostic et les thérapies futures.
