Nous remercions John Darga du MGH ADN de base pour la préparation de la bibliothèque de dépistage de l&#39;ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer a fourni un soutien inestimable pour notre Wallac 1420 luminomètre. Steven Ciacco et Martin Thomae de Agilent fourni un appui pour le robot Bravo. Nous remercions Ron Johnson et Steve Titus au NIH pour offrir généreusement leur protocole de dosage de la luciférase double lueur.

Pour une vue d&#39;ensemble expérimental, voir Figure 1. 1. Préparer plasmides rapporteurs contenant l&#39;alpha-synucléine Promoteur Les éléments de régulation du gène de l&#39;alpha-synucléine (Figure 2) couvrent environ 10 kb, du PNLS (non-Un composant bêta de peptide amyloïde) séquence de répétition dinucléotide amont 1,2 par l&#39;intron 2 3. Nous incluons une partie de cette région notre construction de rapporteur. Nous avons constaté que les plasmides contenant l&#39;intron 2 procédures spéciales requises pour la croissance, comme décrits ci-dessous. Les plasmides de luciférase, et pGL4.10 pGL4.75 (figure 3), sont disponibles dans le commerce auprès de Promega et peuvent être propagées en utilisant des protocoles classiques de biologie moléculaire. <ol><li> Amplifier les deux composantes du promoteur d&#39;alpha-synucléine dans les RAP séparés en utilisant la recette dans le tableau 1 et les amorces dans le tableau 2. </li><li> Verify produits de PCR sur un gel d&#39;agarose et propre en utilisant le kit de purification PCR Qiaquick (Qiagen), en éluant dans 50 ul de TE (Tris-EDTA). Rangez le fragment élue 0,9 kb à -20 ° C pour une utilisation future. </li><li> Digérer la totalité du volume du fragment de PCR de 3,4 kb, ainsi que 5 ug de pGL4.10, avec Sacl et Xhol. Traiter le vecteur de phosphatase alcaline d&#39;intestin de veau (Roche) et gel purifier en utilisant le kit PureLink Gel Extraction rapide (Invitrogen). </li><li> Ligaturer le fragment et le vecteur en utilisant la T4 ADN ligase (NEB). Nettoyez la réaction terminée en utilisant le kit Micro PCR PureLink (Invitrogen), en éluant à 10 tampon TE pi. </li><li> Transformer 2 ul de la réaction de ligature a nettoyé dans 20 pl de cellules compétentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) et l&#39;électroporation selon les instructions du fabricant. Agiter dans un incubateur à 30 ° à 225 tours par minute pendant 90 min. Etaler deux volumes sur des plaques LB contenant 100 mg / ml d&#39;ampicilline et incuber à 30 ° C pendant 2 jours. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cure-dent, sélectionnez 4-6 petites colonies pour l&#39;inoculation dans 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultiver ces cultures miniprep dans un shaker 30 ° C O / N. </li><li> Purifier l&#39;ADN plasmidique à partir de 1,5 ml de chaque culture de miniprep en utilisant le kit Plasmid Miniprep PureLink HiPure (Invitrogen). </li><li> Digérer les minipreps avec BamHI et par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Le clone correct devrait produire des fragments de 2,8 kb et 4,9 kb. </li><li> Restreak la culture restante miniprep à partir du clone correct sur un milieu LB (Luria Broth) plaque fraîche et de croître à 30 ° C pendant 2 jours. </li><li> Choisissez une petite colonie et ensemencer une culture de départ de 1,5 ml de la tuberculose. Secouez O / N à 30 ° C. Ne laissez pas la culture de départ pousser à saturation. </li><li> Diluer le levain entier dans 150 ml de tuberculose préchauffé et agiter à 30 ° C pendant 2 jours. Avant de procéder à l&#39;étape suivante, en utilisant 1,5 ml de cette culture pour une mini-préparation et la digestion supplémentaire pour confirmer que le clone n&#39;a pas muté pendant replicati<html> sur. </li><li> Purifier l&#39;ADN plasmidique de la culture restante en utilisant le kit Plasmid Maxiprep PureLink HiPure (Invitrogen). Les rendements attendus de ce plasmide intermédiaire sont 50-150 mg par 150 ml de culture. </li><li> Décongeler le fragment de 0,9 kb figé dans l&#39;étape 1.2. Répétez les étapes 1.3 à 1.12 pour cloner le fragment de 0,9 kb dans le plasmide intermédiaire, la digestion place avec Kpnl et Sacl. Ligate, transformer, sélectionner et développer pour Maxipreps comme ci-dessus. Digestion avec BamHI devrait donner des fragments de 5,8 kb et 2,8 kb. C&#39;est le plasmide qui sera utilisé pour l&#39;écran. </li></ol> 2. Préparer les cellules 293T, Reporter plasmides, et une bibliothèque d&#39;ADN pour le dépistage Des cellules 293T sont d&#39;abord ensemencées dans des plaques à 96 puits et transfectées le lendemain. plasmides rapporteurs et des ADN de la bibliothèque sont dilués dans des plaques à 96 puits. Nous avons obtenu des plaques d&#39;ADN de la bibliothèque transfection qualité de l&#39;ADN de base à l&#39;Hôpital général du Massachusetts (obtenir = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Ce protocole transfecte une plaque bibliothèque unique en 2 plaques identiques de cellules 293T (figure 1), donc 2 plaques de cellules doivent être ensemencées pour chaque plaque bibliothèque à être projeté. Remarque: Cultiver les cellules dans les médias sans rouge de phénol ou des antibiotiques, car ils interfèrent avec les tests de la luciférase et augmentent la toxicité pendant la transfection, respectivement. <ol><li> Pour chaque plaque de bibliothèque à cribler, des cellules 293T trypsinisées de remettre en suspension à une concentration de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans du DMEM contenant 14% de FBS. Verser dans un réservoir stérile (Axygen). </li><li> Placez le réservoir, 2 à fond transparent, des plaques à 96 puits (Corning), et une boîte de conseils filtre de pipette (Agilent) sur la plate-forme de robot. Déposer 100 pi de cellules dans chaque puits de deux plaques, pour une densité de 1,5 x 10 4 cellules par puits. </li><li> Centrifuger les plaques de cellules à 50 g pendant 2 min, en utilisant de faibles vitesses de rampe pour assurer l&#39;égalitédensité de cellules tout au long de chaque puits. Incuber à 37 ° C et 10% de CO 2 O / N. </li><li> Diluer la luciole et de Renilla plasmides rapporteurs à 5 ng / ul dans un milieu sans sérum. Combiner les dilutions dans un rapport de 05:03 à luciole Renilla plasmide (en volume) dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Pipet les plasmides combinés dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits, distribution de 17 pi par plaque bibliothèque, plus 2-10 ul excès, dans chaque puits. </li><li> Obtenir des plaques de la bibliothèque de la transfection d&#39;ADN de qualité comme ci-dessus et complétez à 13,3 ng / ul avec de l&#39;eau exempte d&#39;endotoxines. Le volume minimum par puits devrait être de 28 pi. </li></ol> 3. Effectuer Transfections Le jour 2 de l&#39;écran, plasmides rapporteurs et d&#39;ADN de la bibliothèque sont transfectées dans des cellules 293T. <ol><li> Pour chaque plaque bibliothèque, mélangez 107,5 pi de RT Optifect (Invitrogen) avec 4,3 ml de milieu sans sérum (01h40 dilution) dans un tube de polystyrène. Incuber pendant 5 min à température ambiante, et l&#39;n distribuer 44 pi (par plaque bibliothèque) dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits, polystyrène fond en V (Greiner). </li><li> Placer la plaque de dilution Optifect, plasmides rapporteurs (étape 2.5), les ADN de la bibliothèque (étape 2.6), et une boîte de pointes de pipette sur la plate-forme de robot. </li><li> Aspirer 17 pi de plasmides rapporteurs, 43 pi de dilution Optifect, et 26 ul d&#39;ADN bibliothèque, en insérant un espace d&#39;air de 5 pi entre chaque aspiration. L&#39;ADN de la banque doit être aspiré dernier pour empêcher la contamination croisée. Verser le contenu des conseils dans une nouvelle plaque de fond en V polystyrène, mélanger, couvrir et mettre de côté pendant 20 minutes pour permettre complexes lipides / ADN pour former. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, de remplacer les embouts de pipette et plaque de la bibliothèque, et répéter. </li><li> Découvrez la plaque de mélange Optifect / ADN et le placer sur la plate-forme de robot avec 2 plaques de cellules 293T. En utilisant une seule boîte de pointes de pipette, aspirer 80 pi de la Optifect: mélange d&#39;ADN et passer lentement 40 pi sur chaque plaque de cellules. Si transfecting plusieurs plaques de bibliothèque, répétez l&#39;opération pour tous Optifect: plaques d&#39;ADN. Couvrir cellules. </li><li> Centrifuger les plaques de cellules à 1200 g pendant 30 min. Couvrir et retourner à l&#39;incubateur. </li><li> Incuber les cellules pendant 4-6 heures. Pendant cette incubation, préparer du milieu frais par mélange de 12 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 10 ug / ml de ciprofloxacine (Cellgro) pour chaque plaque de bibliothèque transfectée. Verser milieu frais dans un réservoir stérile. </li><li> Placez 2 boîtes de conseils de robot, une seule plaque de cellules, le réservoir contenant un milieu frais, et un réservoir de déchets sur la plate-forme de robot. Aspirer 100 pi de milieu à partir des cellules et distribuent dans le réservoir de déchets partiellement rempli d&#39;éthanol à 70%. En utilisant des pointes frais, aspirer 100 pi de milieu frais et distribuer lentement sur les cellules. Répétez l&#39;opération pour toutes les plaques de cellules. </li><li> Plaques revenir à l&#39;incubateur pendant 48 heures. </li></ol> 4. Effectuez double luciférase-dosages Au jour 4 de l&#39;écran, l&#39;luciole et de Renilla essais luciférase sont effectuées. Remarque: Le dosage à double luciférase nécessite l&#39;addition séquentielle de deux tampons de dosage, 3X tampon luciole dosage et un tampon d&#39;essai 3X Renilla, comme décrit dans le tableau 3 de luciole et de Renilla luciférases ne sont pas sécrétées, ainsi les cellules doivent être lysées avant de mesurer l&#39;activité luciférase. . Tampon de dosage Firefly lyse des cellules et fournit substrat pour la luciférase de luciole, tampon de dosage Renilla éteint le signal luciole et fournit substrat pour la luciférase Renilla. <ol><li> Pour chaque plaque de bibliothèque, préparer 8 ml de tampon 3X luciole dosage à partir de solutions mères comme décrit dans le tableau 3, et se dispenser 82 pi dans chaque puits d&#39;une plaque à fond en V à 96 puits. </li><li> Pour chaque plaque de bibliothèque, également préparer 12 ml de tampon de dosage 3X Renilla et dispenser 122 pi dans chaque puits d&#39;une plaque à fond en V à 96 puits. Mettez de côté à la fois leluciole et de Renilla tampons de dosage. </li><li> Placez une boîte de pointes de pipette, un réservoir de déchets, et 2 plaques de cellules (transfectées dans la même assiette bibliothèque) sur la plate-forme de robot. </li><li> Aspirer 60 pi de milieu de chaque assiette, et jetez les dans le réservoir de déchets partiellement rempli d&#39;éthanol à 70%. Les plaques de recouvrement et mettre de côté. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l&#39;opération pour tous les jeux de plaques. </li><li> Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon 3X luciole dosage, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot. </li><li> Aspirer 40 pi de tampon 3X luciole dosage et l&#39;ajouter à la première plaque de cellules, bien mélanger. Le passage à de nouveaux embouts de pipette, répétez l&#39;opération pour la seconde plaque de cellule. Placer les cellules à la température ambiante pendant 10 min pour compléter la lyse. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, remplacer les boîtes de conseils et de plaques de cellules, et répéter. </li><li> luminescence d&#39;enregistrement de chaque puits de chaque plaque de cellule sur un luminomètre, enregistrement pendant 1 seconde par puits. Plaques Retour au robotpont. </li><li> Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon de dosage 3X Renilla, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot. </li><li> Aspirer 60 ul de tampon de dosage 3X Renilla, et l&#39;ajouter à la première plaque de cellules, en mélangeant soigneusement. Le passage à une nouvelle boîte de pointes de pipette, répétez l&#39;opération pour la seconde plaque de cellule. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l&#39;opération pour tous les jeux de plaques cellulaires. </li><li> luminescence d&#39;enregistrement de toutes les plaques sur un luminomètre, l&#39;enregistrement de chaque bien pour 1 sec comme ci-dessus. Jeter plaques. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Calculer la luciole: rapport Renilla de luminescence (&quot;F: rapport R&quot;) pour chaque puits en divisant les chiffres de signal de luciole par les comtes de signal de Renilla. </li><li> Calculer la valeur de l&#39;induction en divisant le rapport F: R de chaque puits par la moyenne F: rapport R de la plaque, à l&#39;exclusion de la plus haute et la plus basse de 25% des puits. </li><li> La moyenne des valeurs d&#39;induction dans les répétitionspour une seule plaque de bibliothèque transfectées. Gènes induisant ou réprimant l&#39;alpha-synucléine plus de trois plis sont considérés comme des &quot;hits&quot; sur cet écran et sont soumis à une validation supplémentaire et des écrans secondaires. </li></ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson's+disease.">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. -. 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USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

Ce travail a été soutenu par les redevances obtenues par BacMamreagents de licence (brevet US 5,731,182).

L&#39;alpha-synucléine a été impliquée dans la maladie de Parkinson (PD) en tant que composant de corps de Lewy, des inclusions intracellulaires 4 considérés pathognomonique de cette maladie. De nombreuses études d&#39;association pangénomiques ont lié polymorphismes de nucléotides simples dans l&#39;alpha-synucléine à un risque accru pour sporadique PD 5,6,7. Bien que moins fréquente que PD sporadique, maladie de Parkinson familiale peut aussi être causée par des mutations dans l&#3...

La capacité à identifier des éléments régulateurs génétiques clés et les facteurs qui agissent sur eux est fondamental pour l&#39;exploration de nombreux processus biologiques. Toutefois, l&#39;identification des facteurs qui régulent l&#39;expression de gènes dans des types de cellules rares, telles que les populations neuronales spécifiques, peut être difficile. Ici, nous présentons un protocole pour identifier de nouveaux régulateurs de la transcription de l&#39;alpha-synucléine (SNCA), un gène associé à la maladie de Parkinson et exprimé dans les neurones dopaminergiques dans la substantianigra la pars compacta de la région du cerveau moyen. Nous accomplissons cela en utilisant un écran à haut débit, double-luciférase, in vitro reporter à déconstruire expression alpha-synucléine dans les cellules 293T. Le promoteur d&#39;alpha-synucléine est d&#39;abord clone dans un plasmide rapporteur contenant le gène de la luciférase de luciole. Un plasmide disponible dans le commerce contenant de la luciférase de Renilla sous le contrôle d&#39;un promoteur constitutivement actif sert de contrôle interne. The constructions rapporteurs sont co-transfectés dans des cellules 293T avec les plasmides dans des microplaques à partir d&#39;une banque d&#39;expression d&#39;ADN, de telle sorte que chaque puits est transfectée avec un plasmide unique de la bibliothèque. Après 48 heures, l&#39;activité de la luciférase pour chaque rapporteur est mesurée séquentiellement en utilisant un dosage double lueur. L&#39;expression relative de l&#39;alpha-synucléine en réponse à chaque gène bibliothèque est déduite par le rapport de la luciole: l&#39;activité de la luciférase de Renilla dans chaque puits (F: rapport R) après normalisation sur la base de plaque. Ce protocole permet de cribler un grand nombre de gènes (~ 2 500 par semaine) pour leur capacité à transactiver un gène rapporteur en utilisant un minimum de personnel (1-2 personnes) et un coût minime (environ 3 $ le coût d&#39;un réactif par essai de microplaques). Régulateurs de la transcription de gènes neuronaux (par exemple, l&#39;alpha-synucléine), qui sont difficiles à étudier dans des cultures de neurones réfractaires à la manipulation génétique, peuvent être comparés côte à côte dans cette analyse fonctionnelle directe. Nous incluons dans notreprotocole une méthode détaillée pour le clonage et la croissance des plasmides contenant le promoteur alpha-synucléine, car nous avons constaté que les plasmides contenant cette région sont instables lorsqu&#39;elles sont cultivées avec les procédures classiques (voir Discussion). Nous incluons également une alternative peu coûteuse à des réactifs disponibles dans le commerce à double luciférase pour tests à haut débit. Ce protocole peut être facilement adaptée pour cibler d&#39;autres éléments de régulation d&#39;intérêt, ou à tout processus exigeant à haut débit transfections transitoires.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

Nous présentons un protocole de criblage à haut débit rapide et peu coûteux pour identifier des régulateurs transcriptionnels de l&#39;alpha-synucléine, un gène associé à la maladie de Parkinson. Des cellules 293T sont transfectées de manière transitoire avec des plasmides provenant d&#39;une banque d&#39;expression de l&#39;ORF parée, en même temps que les plasmides rapporteurs de luciférase, dans un format de microplaque à un gène par puits. L&#39;activité de la luciférase de luciole est analysée après 48 heures pour déterminer les effets de chaque gène de la bibliothèque sur l&#39;alpha-synucléine transcription, normalisée à partir d&#39;un produit d&#39;assemblage d&#39;expression de contrôle interne (un promoteur hCMV diriger la luciférase de Renilla). Ce protocole est facilitée par un robot de paillasse enfermé dans une enceinte de sécurité biologique, qui exécute une manipulation de liquide aseptique en format 96 puits. Notre protocole de transfection automatisé est facilement adaptable à la production de la bibliothèque de lentiviral à haut débit ou d&#39;autres protocoles de dépistage fonctionnels nécessitant une triple-transfections de grands nombres de plasmides de la banque uniques dans conjunction avec un ensemble commun de plasmides auxiliaires. Nous présentons également une alternative peu coûteuse et validé à disponibles dans le commerce, deux réactifs luciférase qui emploie PTC124, EDTA, et le pyrophosphate de supprimer l&#39;activité luciférase de luciole avant la mesure de Renilla. En utilisant ces méthodes, nous avons criblé 7670 gènes humains et identifié 68 organismes de réglementation de l&#39;alpha-synucléine. Ce protocole est facilement modifiable pour cibler d&#39;autres gènes d&#39;intérêt.

Valeurs de luciférase typiques, F: ratios R et les valeurs d&#39;induction pour une seule demi-plaque sont présentés dans la figure 4 Notez le succès dans bien H2, un inducteur 32 fois.. Les gènes produisant une toxicité excessive (par exemple, bien E3), ou les puits qui ont été mal transfectées, produisent de faibles valeurs pour luciole et luciferases Renilla, mais une valeur moyenne de l&#39;induction. Les gènes provoquant l&#39;induction non spécifique de l&#39;activité de la lu...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l&#39;aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d&#39;intérêt.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K vues.  Massachusetts General Hospital.  Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt. 

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Recherche

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...