Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

Préparation de l&#39;échantillon 1 <ol><li> Obtenir des échantillons contenant des virus exprimant la luciférase (ci-VSVΔ51 Fluc, par exemple) pour le titrage et le transfert dans des plaques à 96 puits. Sinon, effectuer les infections dans des plaques 96 puits de culture de tissus et utilisation surnageants directement. </li><li> Laisser deux colonnes non traitées pour l&#39;inclusion de courbes standards. Pour les expériences effectuées directement dans des plaques à 96 puits, titre à la fin de l&#39;expérience (40 heures post-infection) ou conserver à -80 ° C et le titre à une date ultérieure. </li></ol> 2 Préparation des cellules permissives pour le virus de titrage <ol><li> 24 heures avant le titrage, préparer une suspension de cellules Vero à une concentration de 2,5 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), HEPES 30, et 1% de pénicilline / streptomycine. REMARQUE: Bien que ce protocole utilise des cellules Vero, une lignée cellulaire permissive approprié pour infection par le VSV pourrait be utilisée. </li><li> Graine 2,5 x 10 4 cellules (100 ul) dans des plaques à fond plat à 96 puits solides blancs à l&#39;aide d&#39;un distributeur de microplaques. <ol><li> Préparez 12 ml de suspension cellulaire par plaque plus 5 ml pour l&#39;amorçage. </li><li> Clean microplaque distributeur de cassette par le tube de rinçage avec 50 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Remplissez les lignes microplaque de distribution avec suspension cellulaire et laissez 5 ml de suspension cellulaire traversent. </li><li> Sélectionnez un programme qui va se passer 100 pi dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits murs blancs. Distribuer, et répéter au besoin pour les plaques supplémentaires. SEED a aussi quelques puits dans une plaque à fond plat de 96 puits clairement si les plaques aux murs blancs opaques-bas sont utilisés pour la vérification de la santé des cellules et de la densité. </li><li> Lorsque vous avez terminé, les cellules Rincer de nouveau dans le conteneur original. Nettoyer la cassette en cours d&#39;exécution par 50 ml d&#39;éthanol à 70% puis 50 ml d&#39;eau stérile chaude à travers le tube. </li><li> Assurez-vous que la cassette et le tube sont appropriée nettoyé entre chaque utilisation. </li></ol></li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% humidifié un incubateur à CO 2. </li></ol> 3 Préparation de la courbe standard virale <ol><li> Préparer une courbe d&#39;étalonnage de VSVΔ51-Fluc dans du milieu DMEM sans sérum de telle sorte que la concentration finale d&#39;unités formant des plages (PFU) par ml, après transfert sur ​​des cellules Vero est la suivante: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml et une 10 pfu / ml. Préparer 50 pi de chaque concentration par plaque de cellules Vero, plus un supplément de 10%. REMARQUE: titre de la luciférase stock de virus devra être évalué de façon classique 10 afin de générer une courbe standard qui permettra de quantification absolue. Sinon quantification relative peut être réalisée sans l&#39;information de titre précis en réglant arbitrairement titre viral basésur les mesures de dilution. Par exemple la première dilution de la courbe d&#39;étalonnage peut être réglé à 10 8 unités virales et la dilution 1/10 à 10 7 suivant et ainsi de suite. Dans ce contexte, il faut exprimer les valeurs en tant que facteur de variation par rapport à un échantillon pré-déterminé la quantification absolue ne seront pas exactes. </li></ol> 4 Transfert des exemples surnageants sur des cellules permissives <ol><li> Vérifiez cellules Vero plaqués dans la plaque de 96 puits à fond transparent sous un microscope optique à confirmer que les monocouches sont au moins 95% de confluence. </li><li> Transférer 25 ul de surnageant de l&#39;échantillon sur cellules Vero ensemencées dans des plaques aux murs blancs. Ne pas transférer les surnageants dans les 2 colonnes désignées pour les courbes standard. NOTE: Ceci peut être fait en même temps pour tous les puits sur une plaque unique en utilisant un manipulateur de liquides à canal 96. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette multi-canaux à 8 ou 12 canaux, ajouter 25 ul de chaque dilution de la courbe d&#39;étalonnage préparée à l&#39;étape 3 pour les cellules Vero dansles deux colonnes désignées. </li><li> Plaques de centrifugation pour 5 min à 430 xg à la température ambiante. </li><li> Incuber pendant 5 heures à 37 ° C dans 5% humidifié un incubateur à CO 2. </li></ol> 5. évaluation de la viabilité cellulaire <ol><li> Remarque: Lors du démarrage à partir des surnageants obtenus à partir des expériences d&#39;infection par le fait dans des plaques à 96 puits claires, viabilité de l&#39;échantillon peut être évaluée avant la quantification avec un colorant indicateur de viabilité cellulaire tels que la résazurine. </li><li> Ajouter resazurine d&#39;un montant égal à 10% du volume dans chaque puits de la plaque de 96 puits d&#39;échantillons contenant des virus et des cellules. Inclure cellule ne contrôle ainsi que le contrôle des médias uniquement à déterminer les valeurs de 100% et 0% respectivement viabilité. </li><li> Après 2-4 heures (temps d&#39;incubation varie en fonction du type de cellule et de la concentration de poudre de colorant disponible ou reconstitué dans le commerce), de lire et d&#39;enregistrer le signal en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence (530 à 560 d&#39;excitation, 590 émissions). Rapport cellule viabilité pour un échantillon selon la formule relative Activité métabolique = ((signal de l&#39;échantillon d&#39;essai - signal de contrôle négatif) / (cellulaire seulement le signal de commande - signal de contrôle négatif)) x 100% </li></ol> 6 Préparation du substrat luciférine <ol><li> 30 min avant la fin de l&#39;incubation de 5 heures, préparer la luciférine pour obtenir une solution / ml à 2 mg dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Préparer 2,5 ml par plaque, plus un supplément de 2 ml. Protéger la solution de la lumière. REMARQUE: La luciférine peut également être préparé plus tôt dans la journée, et stocké à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 7. lecture bioluminescence <ol><li> Après la période d&#39;incubation de 5 heures, ajouter 25 pl de luciférine à chaque puits de cellules Vero dans des plaques solides blancs. Ajouter luciférine manuellement ou avec un distributeur automatique intégré dans le luminomètre. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;un instrument avec seulement un seul point et à la fin se lit peut nécessiter l&#39;ajout d&#39;une lyse buf compatible luciférasefer avant d&#39;ajouter le substrat luciférine d&#39;améliorer la cohérence. </li><li> Lire les plaques avec les paramètres suivants: <ol><li> Agiter pendant 5 sec. </li><li> Attendez 30 secondes. </li><li> Lire luminescence à une valeur fixe appropriée sensibilité / exposition. Si l&#39;option est disponible sur l&#39;instrument, utilisez multi-point lit (par exemple, 3 x 3 matrice) pour améliorer la précision. </li></ol></li><li> Enregistrer et enregistrer l&#39;intensité de bioluminescence quantifié. </li><li> Si un distributeur automatique a été utilisé pour ajouter luciférine purger la luciférine et amorcer les lignes à l&#39;eau chaude stérile. </li></ol> Analyse 8. données <ol><li> Pour des résultats précis, résoudre la régression non linéaire pour générer une équation de Hill à partir des courbes standards. Appliquer cette équation pour les échantillons titrés pour calculer les unités d&#39;expression viraux. Certains virus ou situations ne peuvent produire une courbe standard avec une relation linéaire; dans ce cas résoudre une équation linéaire. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

L&#39;approche basée sur la luciférase décrit ici fournit un certain nombre d&#39;avantages par rapport à d&#39;autres méthodes existantes, y compris la facilité, la rapidité, la nécessité d&#39;un minimum d&#39;équipement, et un coût relativement faible. Un contributeur clé pour cela est l&#39;évitement d&#39;une étape de dilution en série. Néanmoins, les dérivés à base de dilution-série de ce protocole sont certainement faisable et ont récemment été utilisées pour évaluer les titres Ebola luciférase exprimant dans un écran de antiviral à haut débit 11. Bien que par nature plus de temps et plus cher, ces adaptations peuvent offrir une plus grande gamme dynamique pour la quantification virale lorsque cela est nécessaire. En plus d&#39;être particulièrement bien adapté pour évaluer les titres viraux dans le contexte d&#39;écrans à haut débit, notre méthode de quantification sur la base virale à une seule étape de la luciférase produit des estimations précises des virions infectieux dans le cas de la multiplication de virus. En outre, des lectures de luminescence ainsi que des données de cytotoxicité de la même expérience donnent un plusimage complète de l&#39;effet des conditions expérimentales sur des cellules cibles, ce qui est particulièrement utile dans le contexte du virus oncolytiques et les écrans de médicaments. L&#39;exemple illustré ici utilise un virus répliquant à ARN simple brin négatif; Cependant, ce protocole peut être adapté à un nombre de réplication et les virus ne se répliquant pas avec quelques ajustements mineurs de protocole. Cela comprend des virus à ADN tels que la vaccine, HSV, et AAV (voir figure 5). Les échantillons infectés par des virus intracellulaires, tels que le virus de la vaccine, par exemple, nécessitent une étape de libération de virus avant quantification (par exemple, au moins un cycle de congélation-décongélation). Lors de l&#39;application de cette technique à d&#39;autres virus, il est nécessaire d&#39;optimiser le temps d&#39;incubation du transfert du surnageant viral ou lysat à la lecture des plaques par le luminomètre. Ce paramètre dépend principalement sur le cycle de replication du virus dans la lignée cellulaire permissive et la force de la pimpresario conduite expression de la luciférase. Ceci est mieux fait en utilisant la courbe d&#39;étalonnage complète dans l&#39;étape d&#39;optimisation. Pour ce faire, il faut infecter la lignée cellulaire permissive appropriée avec diverses répétitions de la courbe standard préparé et lu chaque répétition à un autre moment des points post-transfert. Idéalement, un point de temps d&#39;incubation est choisi qui mène à une relation linéaire entre LOG (AVC) et LOG (titre) couvrant la gamme échantillon de titre prévu. Pour VSVΔ51-Fluc, elle est généralement de 10 4 pfu / ml à 10 7 pfu / ml pour un temps d&#39;incubation de 5 heures. Si les titres plus faibles ou plus fortes sont attendues à partir d&#39;échantillons, on peut simplement augmenter ou de réduire le temps d&#39;incubation respectivement. Alternativement, les échantillons peuvent être dilués à tomber dans la gamme beaucoup comme on le fait généralement pour ELISA. Comme mentionné ci-dessus, ce procédé est bien adapté pour effectuer des écrans de médicaments à haut débit utilisant des banques de drogues comme la plupart des étapes peuvent être automatisées. Les cellules peuvent être étalées efficiently l&#39;aide d&#39;un distributeur automatique de microplaque, la bibliothèque de médicaments peuvent être ajoutés à l&#39;aide d&#39;un gestionnaire de canaux de liquide 96, le virus peut être ajouté à l&#39;aide d&#39;un distributeur de plaques de microplaque et lue à l&#39;aide d&#39;un luminomètre automatique. En théorie, cela peut également être adapté à 384 puits et de petits formats; Toutefois, la limitation à cette fin est le nombre de cellules qui peuvent être étalées, moins de cellules données conduit à une gamme plus étroite dans la linéarité du LOG ​​(AVC) à LOG relation (titre). Enfin, l&#39;évaluation de la viabilité des cellules en utilisant la résazurine ou d&#39;autres colorants métaboliques peut être facilement incorporé dans le flux de production, ce qui permet la discrimination des composés cytotoxiques dans les écrans antiviraux ou identifier des composés qui conduisent à la mise à mort synergique en combinaison avec des virus 12. Néanmoins, les limites de ce procédé comprennent l&#39;exigence d&#39;un virus transgénique exprimant la luciférase, ce qui n&#39;est pas toujours possible, et la disponibilité d&#39;une lignée cellulaire permissive suffisamment. Cependant, il est possible d&#39;adapter probableProcédé pour l&#39;utilisation avec d&#39;autres gènes rapporteurs (par exemple, GFP) à condition que le procédé de quantification reporter a une linéarité appropriée et le rapport signal sur bruit. Dans l&#39;ensemble, la méthode à haut débit décrit peut être modifié pour convenir à de nombreux virus différents et adaptés à diverses applications.

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive &#8220;plaquing&#8221; cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9. 
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV&#8710;51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbeccos&#39; Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NorthBio Inc.</td>
			<td>NBSF-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:136px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310-1</td>
			<td style="width:251px;">Prepare a&#160; 1mM solution, pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alamarBlue&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>BUF012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Luciferin potassium salt</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3917</td>
			<td style="width:251px;">384-well plates can also be used for higher throughput</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy Mx</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>SMTBL</td>
			<td>Monochromator microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquidator96</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>LIQ-96-200</td>
			<td>96 tip manual pipetting system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:136px;">LQR-200F</td>
			<td style="width:251px;">Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microflo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>111-206-21</td>
			<td>Used to plate cells in a 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5210450</td>
			<td>Microplate fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

Un résumé de la description de flux du procédé à haut débit est illustrée sur la figure 1. Figure 2 montre les résultats d&#39;une courbe standard typique ofVSVΔ51-Fluc. Quatre paramètres de l&#39;analyse de régression non linéaire généré une courbe à partir de laquelle la Colline inconnu pfu d&#39;entrée (estimation du titre viral) peut être interpolée. Ces titres estimés sont appelées unités d&#39;expression viraux (VEU). Figure 3A montre VeUS et les titres obtenus en effectuant un essai de plaque standard avec les mêmes échantillons 10. Les échantillons provenaient d&#39;une expérience où divers produits chimiques ont été utilisés pour améliorer la réplication et la propagation de VSVΔ51-Fluc en cellules 786-0. VeUS interpolée à partir de la courbe d&#39;étalonnage doit être multipliée par un facteur qui est basé sur la dilution du surnageant de l&#39;échantillon est transféré à des cellules Vero (dans ce cas, le facteur de dilution est de 5). La corrélation linéaire entre les titres et VEU est représenté sur la figure 3B </strong&gt; Avec un R 2 de 0,8083 et r le score de Pearson de 0,899 (p &lt;0,0001). Sur la figure 4, les données typiques de cytotoxicité cellulaire obtenues à partir d&#39;une analyse métabolique est signalée 786-0 pour les cellules traitées avec des produits chimiques avant l&#39;infection avec VSVΔ51-Fluc. Enfin, la figure 5 montre des courbes typiques de standards obtenus avec différents virus (Herpes Simplex Virus (HSV), le virus de la vaccine, et virus adéno-associé (AAV), tout en exprimant la luciférase Firefly) et décrit les temps d&#39;incubation et des cycles de gel-dégel, selon les besoins. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Flux de travail de haut débit virus titrage et test de cytotoxicité utilisant VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 cellules Vero par puits (100 pi) et incuber à 37 ° C. (B) 24h transfert plus tard 25 pi de courbe standard sur de cellules Vero (2 colonnes par plaque). (C) de transfert de 25 ul d&#39;échantillons à titré sur des cellules Vero restants. plaques de centrifugation et incuber à 37 ° C. (D) d&#39;un montant égal à 10% du volume dans le puits, ajouter réactif REMA à la plaque contenant les échantillons originaux. Incuber les plaques à 37 ° C. (E) Après 3 heures, lire et enregistrer la fluorescence et d&#39;évaluer la cytotoxicité. (F) Après 5 h, ajouter 25 ul de solution à 2 mg / ml de luciférine dans chaque puits de cellules Vero. Lire luminescence et de calculer les parts de l&#39;expression virale. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2 attendu courbe standard de VSV Δ 51-Fluc. Expression de la luciférase moi étaitasured 5 transfert, après surnageant h en cinq points différents dans un puits à l&#39;aide d&#39;un luminomètre et bioluminescence a été exprimée en unités relatives de lumière moyennes (RLU). Moyenne RLU a été tracée en fonction de l&#39;entrée connue pfu / ml pour résoudre la régression non linéaire et générer une équation de Hill. La moyenne des deux courbes répétées et les barres d&#39;erreur standard sont affichés (r 2 = 0,9993). <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3: Comparaison des titres de standards de dosage sur plaque avec ceux obtenus par la méthode à haut débit. (A) Les titres viraux en pfu / ml obtenue par dosage de plaque standard sur des cellules Vero ont été comparés aux titres viraux calculées (VEU / ml) à partir des mêmes échantillons titrés en utilisant l&#39;analyse à haut débit de la luciférase (B). Relation linéaire entre VEU / ml et le titre obtenu par standard ptest laque. Courbe de régression linéaire et le coefficient de détermination (R 2) sont affichés. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 Exemple de viabilité. Viabilité de l&#39;échantillon avant le transfert de surnageant sur ​​des cellules Vero a été déterminée par l&#39;évaluation de l&#39;activité métabolique cellulaire en utilisant une solution résazurine disponible dans le commerce. Valeurs de fluorescence brutes ont été normalisées à celle des non traités, des puits non infectées. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 attendus courbes standard avec HSV, la vaccine et les virus AAV. Expression de la luciférase a été mesurée en cinq points différents dans un puits à l&#39;aide d&#39;un luminomètre et bioluminescence a été exprimée en rela moyennesunités légères tifs (AVC). (A) courbe standard HSV a été ajouté sur cellules Vero plaqué 24 heures plus tôt, à une densité de 2,5 x 10 4 cellules par puits (100 pi) et la mesure de la luciférase a été faite 17 h transfert post surnageant (R 2 = 0,9489, n = 1). Une équation de Hill a été généré en résolvant la régression non-linéaire. Courbe de référence (B) de la vaccine a été ajouté sur les cellules Vero plaqué 24 h plus tôt une densité de 2,5 x 10 4 cellules par puits (100 pl) et on incube pendant 2,5 heure à 37 ° C, après quoi les mesures de luciférase ont été prises (R2 = 0,9892). Une équation linéaire est généré en résolvant la régression linéaire (C). AAV courbe standard a été ajouté sur les cellules de carcinome de poumon humain (A549) plaqué 24 heures plus tôt à une densité de 2,5 x 10 4 cellules par puits (100 ul) et de la mesure de la luciférase a été faite 24 h post infection. Une équation de Hill a été généré en résolvant la régression non-linéaire. La moyenne desde cinq courbes répétées et les barres d&#39;erreur standard sont affichés (R 2 = 0,9926).

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High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

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12.8K vues.  Ottawa Hospital Research Institute. This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

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Biologie

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...