Ringraziamo Leo Pallanck per gli stock mosca, Christine Sommers per l&#39;assistenza tecnica e Gerasimos P. Sykiotis per le discussioni utili. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH formazione concessione T32CA009363 di MCB

1. Trasalimento indotta Negativo geotassi Assay <ol><li> Selezionare mosche del genotipo desiderato, separarli per sesso, in modo casuale raggrupparli in coorti di 20-30 animali e li lanciano in nuovi flaconi cibo ogni 2-3 giorni; test di ogni set di mosche (cioè coorti di pari età, una coorte / genotipo) almeno una volta alla settimana. </li><li> Trenta minuti prima della prova geotassi negativo, anestetizzare le mosche con la CO 2 e metterli in tubi di plastica trasparente pre-etichettati fatti con due fiale di cibo vuote (vedi Materiali Tavolo) unite alle loro aperture con nastro adesivo trasparente (Dimensioni camera: 19 cm x 2,85 cm). Nei nostri test Usiamo tipicamente 25 mosche / tubo. Nota. Il tempo di recupero dall&#39;anestesia può variare da pochi minuti a diverse ore (ad esempio O / N) e dovrebbe essere ottimizzato per i genotipi specifici testati. </li><li> Segna diverse altezze (1-20 cm) su un pezzo di carta assorbente e nastro di carta su un surfac verticalee, perpendicolare al banco. </li><li> Posizionare i tubi davanti alla carta: i tubi devono essere tutti allineati e il più vicino possibile alla carta per consentire la misurazione dell&#39;altezza precisa. </li><li> Posizionare la fotocamera digitale (vedi il &quot;Veicoli speciali&quot; Table) di fronte ai tubi, ad una distanza di 20-30 cm dalla carta, su un supporto (ad esempio una scatola di punta della pipetta), selezionare l&#39;opzione &quot;film&quot; e iniziare a registrazione, in questo momento si dovrebbe anche avviare un timer per tenere traccia del tempo tra prove consecutive. </li><li> Lasciare le mosche per raccogliere sul fondo della provetta toccando il tubo per alcuni secondi (es. 10 sec). Questo passaggio deve essere eseguito in modo coerente (cioè stessa durata, stessa forza, lo stesso operatore) durante l&#39;intero esperimento. </li><li> Movimenti record mosche con la fotocamera digitale per 10 sec. </li><li> Ripetere i passaggi 1,5-1,7 quattordici volte a intervalli di un minuto. </li><li> Analizzare i dati: <ol type="a"><li> Contare il numero di mosche che si trovano al di sopra della2 cm segno dopo 10 secondi con l&#39;ispezione visiva dei filmati registrati. Nota: Nelle nostre condizioni di saggio comportamento geotassi negativo delle mosche non durò oltre il primo 10 secondi dopo il sorprendente (cioè mosche hanno cominciato a muoversi in tutte le direzioni 10 sec dopo il sorprendente di loro). La distanza minima è salito da mosche di controllo (cioè 1 settimana fa mosche che esprimono il conducente THGal4, vedi legenda della Figura 1) in questa finestra di tempo era 2 cm. Così, abbiamo usato il segno di due centimetri come riferimento per analizzare le attività di arrampicata di mosche di diverse età e genotipi 10 secondi dopo l&#39;inizio del comportamento. Questi parametri possono richiedere la regolazione per tenere conto di differenze di comportamento delle mosche testati (dovuto ad esempio a diversi background genetici o condizioni di laboratorio). Si noti che nelle nostre condizioni di analisi, tutti i genotipi testati eseguita peggio o in modo simile alle mosche del genotipo di controllo. </li><li> Prendere la media dei risultati del quindiciprove. </li><li> Media espressa come percentuale del numero totale di mosche nel tubo (=% dell&#39;attività climbing), il numero di ripetizioni (N) è data dal numero di coorti indipendenti testate per ciascun genotipo </li><li> Valutare la significatività statistica tra i diversi genotipi nel tempo. Questo può essere realizzato con il test t di Student (confrontando le due genotipi) o un 2 vie ANOVA seguita dal test di Bonferroni post-hoc (quando si eseguono confronti multipli) usando software commerciali quali GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA). </li></ol></li></ol> Nota Eseguiamo tutti i nostri saggi allo stesso tempo del giorno, a RT e alle stesse condizioni di luce. Mantenere le mosche in una luce / buio dell&#39;ambiente ciclo di 12 ore si consiglia di controllare l&#39;effetto dei ritmi circadiani sul comportamento motorio delle mosche. 2. Tirosina idrossilasi immunofluorescenzaSaggio dei Monti intero cervello Soluzioni e tamponi Soluzione fissativa: 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (PBS) Lavaggio buffer: 0.1% Triton X-100 in PBS Tampone bloccante: 0.1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 e 0,5% di BSA Supporti di montaggio: Mowiol-DABCO (vedi protocollo descritto in Harlow E, Lane D., Anticorpi-Un manuale di laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988)) Procedura <ol><li> Mettere mosche in un piatto dissezione riempito con 70% EtOH per circa 1 minuto per eliminare la cera cuticola. </li><li> Trasferimento vola a un altro piatto dissezione pieno di ghiaccio-freddo PBS. </li><li> Sezionare il cervello: <ol type="a"><li> Posizionare la mosca con l&#39;up lato ventrale (opzionale: ali Rimuovere e gambe). </li><li> Tirare la testa dal corpo: utilizzare un set di pinze permantenere il corpo ed un altro per trattenere la cuticola sotto l&#39;occhio per evitare di danneggiare il cervello </li><li> Rimuovere la proboscide. </li><li> Trattenere la cuticola testa su lati opposti della fessura lasciata aperta dopo aver rimosso la proboscide e tirare in direzioni opposte fino a quando il cervello viene rimosso dalla capsula testa. </li><li> Rimuovere tutta la cuticola dal cervello. </li><li> Rimuovere tutto il tessuto tracheale piena d&#39;aria, per evitare che il cervello da variabile durante le seguenti fasi di incubazione. </li></ol></li><li> Tagliare alcuni millimetri largo della punta di una punta di pipetta P-200 ed equilibrare con una soluzione 0,1% Triton X-100/PBS </li><li> Usando la punta P-200 pipetta preparati, trasferire il cervello per una provetta Eppendorf da 0,5 ml riempita con 0,5 ml di 4% PFA / PBS e mantenere in ghiaccio fino alla dissezione è completa. </li><li> Fissare il cervello a temperatura ambiente per 20 min: applicare una rotazione dolce mettendo le provette Eppendorf su una griglia e l&#39;immissione del rack su un nutator. </li><li> Togliere il fissativoutilizzando un P-1000 micro pipette, aggiungere 0,5 ml di 0,1% X-100/PBS Triton, mescolare per inversione e lasciare incubare per 1 min; ripetere questa fase di lavaggio una volta. </li><li> Rimuovere il tampone dal secondo lavaggio, aggiungere 0,5 ml di 0,1% X-100/PBS Triton e lasciare incubare a temperatura ambiente per 20 min; ripetere questo passaggio due volte. </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio e lasciare che i cervelli incubate in tampone di bloccaggio (0.1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 e 0,5% BSA) per 1 ora a RT. </li><li> Incubare il cervello con una diluizione 1:100 di anticorpi anti-TH (vedi la &quot;Tabella di reagenti specifici&quot;) in soluzione di bloccaggio, per due giorni, a 4 ° C, con rotazione delicata (vedi punto 2.6.). </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio 2.7. e 2.8 .. </li><li> Equilibrare il cervello con una diluizione 1:200 di soluzione di blocco antibodyin secondario, per due giorni, a 4 ° C, con lieve rotazione. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio 2.7. e 2.8 .. </li><li> Preparare i vetrini di montaggio come illustrato nella Figura 2A: <ol type="a"><li> Agg 2 x 25 gocce microlitri di supporti di montaggio per un vetro di copertura (24 x 60 mm, n. 1.5). </li><li> Posto due bicchieri di copertura (dimensioni 18 x 18 mm, n. 2) sul supporto di montaggio lasciando un vuoto al centro della diapositiva e lasciare asciugare. </li></ol> Nota. Controllare il supporto del campione sul palco del microscopio confocale. È possibile effettuare il vetro di copertura delle stesse dimensioni di un x 75 mm diapositiva 25 ed accompagnato da una x 22 mm 1.5 vetro di copertura da 22 a una delle estremità (usare smalto e nastro). </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio, aggiungere 50 ml di mezzi di montaggio e consentono il cervello per equilibrare con esso pipettando su e giù. </li><li> Utilizzando un taglio P-200 punta di pipetta (vedi passo 2.4) trasferire i cervelli alla slitta nello spazio tra i due coprioggetto e coprire con coprioggetto no. 1.5 (vedere la Figura 2A; orientare i cervelli sul vetrino vedi 7). Nota: i campioni sono montate tra due vetri di copertura per permettere la visualizzazione sia del anteriore e posterior lato del cervello. </li><li> Riempire l&#39;intero spazio tra i vetri di copertura con mezzi di montaggio; pipetta da un angolo per rimuovere tutta l&#39;aria, lasciare asciugare e sigillare con smalto. </li><li> Per valutare il numero di neuroni dopaminergici in uno specifico cluster acquisire una serie di sezioni ottiche lungo l&#39;asse z con un 1,0 micron step-size utilizzando un microscopio confocale (per l&#39;identificazione di cluster anatomica dopaminergici nel cervello adulto Drosophila vedi 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Sottolineamo che non abbiamo interessi finanziari concorrenti.

I saggi qui descritti forniscono un approccio utile per studiare il ruolo di specifici geni, vie di segnalazione o piccoli composti nella manutenzione di neuroni DA nell&#39;invecchiamento e in diversi contesti genetici malattie collegate (recensione in 5). Il comportamento trasalimento indotta geotassi negativo di Drosophila è stato ampiamente utilizzato come funzionale read-out per la funzionalità dei neuroni DA in diversi contesti genetici, in particolare in presenza...

La specificità dei saggi descritti qui si basa sull&#39;utilizzo di una linea di volo GAL4 che sfrutta le sequenze regolatorie del gene della tirosina idrossilasi raggiungere espressione specifica in neuroni dopaminergici 3. Tirosina idrossilasi catalizza la prima e fattore limitante nella sintesi della dopamina. Immunoreattività TH Nell&#39;adulto mosca sovrappone cervello con quello della dopamina, rendendo TH un buon candidato per identificare neuroni DA in vivo (vedi per esempio 6). Inoltre, il modello di espressione di THGal4 è più specifico di quella di altri GAL4 linee come DdcGal4, che contiene sequenze regolatrici dal gene della dopa decarbossilasi e pilota l&#39;espressione transgenica non solo nei neuroni DA, ma anche nei neuroni serotoninergici e sottoinsiemi di cellule gliali 3 . Feany e Bender (2000) in primo luogo osservato che l&#39;espressione di pan-neuronale del gene PD-linked α-sinucleina umana accelera la perdita progressiva di startle indotta comportamento geotassi negativo in Drosophila. abbiamo osservato risultati simili utilizzando la specifica linea di DA-neurone THGal4 per guidare il expressionof un α-sinucleina transgene 10 e utilizzato questa funzionalità read-out per studiare il ruolo neuroprotettivo del percorso Nrf2 in questo Drosophila modello di PD 14. Il dosaggio specifico qui descritto è adattato da 2 e 3. Il cervello Drosophila contiene più di 100 neuroni DA, disposte in almeno cinque diversi cluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) che può essere visualizzato in supporti interi cerebrali mediante microscopia confocale (vedi per esempio 11 e 7). E &#39;ancora controverso se il numero di neuroni DA nel Drosophila cervello diminuisce con l&#39;età 9, 11, tuttavia, neurodegenerazione età-dipendente si osserva in linea in cui sono stati mutati geni PD-linked / overexpressed per modellare malattie umane5. L&#39;espressione di α-sinucleina umana in DA neuroni ha un tale effetto e, quindi, è stata usata come modello per PD. Qui si descrive un saggio di neuroni DA contano in tutto il cervello monta utilizzando TH come marker delle cellule. Questo test è stato adattato da 13 e 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster è un modello valido organismo per studiare invecchiamento e processi degenerativi patologici nel sistema nervoso. I vantaggi del volo come un sistema sperimentale comprendono la sua trattabilità genetica, vita breve e la possibilità di osservare ed analizzare quantitativamente comportamenti complessi. L&#39;espressione dei geni delle malattie legate a specifiche popolazioni neuronali del cervello Drosophila, può essere usato per modellare le malattie neurodegenerative come il Parkinson e l&#39;Alzheimer 5. Dopaminergici (DA) i neuroni sono tra le popolazioni più vulnerabili neuronali nel cervello umano di invecchiamento. Nella malattia di Parkinson (PD), il disturbo più comune movimento neurodegenerativa, la perdita accelerata di DA neuroni porta ad un declino progressivo e irreversibile nella funzione locomotoria. Oltre all&#39;età e l&#39;esposizione a tossine ambientali, perdita di neuroni DA è esacerbata da mutazioni specifiche nella codificao regioni promotrici di diversi geni. L&#39;identificazione di tali alleli PD-associati fornisce la base sperimentale per l&#39;utilizzo di Drosophila come modello per studiare neurodegenerazione dei neuroni DA in vivo. Ad esempio, l&#39;espressione del gene umano α-sinucleina PD-linked in Drosophila neuroni DA ricapitola alcune caratteristiche della malattia umana, come ad esempio la perdita progressiva di neuroni DA e declino della funzione locomotoria 2. Di conseguenza, questo modello è stato utilizzato con successo per identificare potenziali target terapeutici nel PD 8. Qui descriviamo due saggi che sono stati comunemente usati per studiare neurodegenerazione età-dipendente dei neuroni DA in Drosophila: un saggio di scalata in base alla risposta di trasalimento indotta geotassi negativo e tirosina idrossilasi immunoistochimica di tutto il cervello adulto monta per monitorare il numero di neuroni DA in età diverse. In entrambi i casi, l&#39;espressione in vivo di UAS transgenes specificamente in neuroni DA possono essere ottenuti utilizzando una tirosina idrossilasi (TH) promotore-GAL4 driver di linea 3, 10.

Abbiamo utilizzato i saggi descritti qui per studiare il ruolo della sollecitazione protettiva Nrf2 percorso in un modello di Drosophila PD 14. Questo modello si basa sull&#39;espressione del gene α-sinucleina umana in neuroni DA utilizzando un TH GAL4 pilotaggio 2, 10. La figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un geotassi negativi trasalimento indotte (climbing) del saggio in mosche maschio che esprimono diversi transgeni sotto il co...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni in<em&gt; Drosophila</em&gt;: L&#39;arrampicata / saggio geotassi negativo trasalimento indotta che consente di studiare gli effetti funzionali di neuroni DA degenerazione e l&#39;immunoistochimica della tirosina idrossilasi, che viene utilizzato per identificare e contare i neuroni DA in monta tutto il cervello.

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K Views.  University of Rochester Medical Center. Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni in Drosophila: L'arrampicata / saggio geotassi negativo trasalimento indotta che consente di studiare gli effetti funzionali di neuroni DA degenerazione e l'immunoistochimica della tirosina idrossilasi, che viene utilizzato per identificare e contare i neuroni DA in monta tutto il cervello.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

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Neuroscienze

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Saggi olfattive per modelli murini di malattia di Neurodegenerative

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.