我々は有用な議論のための技術支援とGerasimos P. Sykiotisためクリスティンソマーズ、フライ銘柄に対してレオPallanckに感謝します。この作品は、MCBにNIH訓練助成T32CA009363によって賄われていた

1。驚愕誘発される負の走地性アッセイ<ol><li>希望の遺伝子型のハエを選択し、それらは、20〜30の動物のコホート内のグループにランダムに、性によって、それらを分離し、2〜3日ごとに新しい食品バイアルにそれらを反転;テストハエの各セット（ つまり、年齢をマッチさせたコホート、1コホート/遺伝子型）は、少なくとも週に一回。 </li><li>負の走地性試験前の30分には、CO 2でハエを麻酔し、2つの空の食品バイアル（ 材料表を参照）（チャンバー寸法明確なテープとの開口部で結合で作られた前標識透明なプラスチックチューブにそれらを配置さ：19センチメートル×2.85センチメートル）。我々のアッセイでは、一般的に25ハエ/真空管を使用しています。 注意してください。回復時間を麻酔からは、数分から数時間まで変えることができる（ 例えば、O / N）および試験特定の遺伝子のために最適化されるべきである。 </li><li>垂直surfacの上に吸い取り紙やテープ紙に高さが異なる。（1 - 20件目をCMから）マーク電子、ベンチに垂直。 </li><li>紙の前にチューブを置きますチューブはすべて整列さと限り正確高さ測定を可能にするために紙にできるだけ近くにする必要があります。 </li><li>チューブの前に（ &quot;特別装備&quot;の表を参照）は、デジタルカメラを置き、紙20〜30センチメートルの距離で、スタンド（ピペットチップボックスなど ）に、 &quot;映画&quot;オプションを選択して開始録音が、この時点で、あなたはまた、連続した試験の間の時間を追跡するためにタイマーを開始する必要があります。 </li><li>ハエは数秒（ 例えば 10秒）のためにチューブをタップしてチューブの底に集めることができます。このステップは、実験全体を通して（ つまり 、同じ時間、同じ強さ、同じ演算子）一貫して実行する必要があります。 </li><li> 10秒のためのデジタルカメラでハエの動きを記録します。 </li><li> 1分間隔で、ステップ1.5から1.7まで14回繰り返します。 </li><li>データを分析する： <ol type="a"><li>を超えているハエの数を数える撮影した動画の目視検査により、10秒後、2センチマーク。 注：私達のアッセイ条件でハエ&#39;負の走地性の動作は驚くべき後の最初の10秒を超えて続かなかった（ つまり、ハエは、それらの後に驚くべきすべての方向に10秒を動かし始めた）。最小距離2 cmであったこの時間ウィンドウ内の制御ハエ（THGal4ドライバを表現すなわち 1週齢のハエ、 図1の凡例を参照）となりました。したがって、私たちは行動を開始した後、異なる年齢や遺伝子型10秒のハエの登山活動を分析するための基準として2センチメートルマークを使用していました。これらのパラメータは、（異なる遺伝的背景や実験条件に例えばのため）テストハエの動作の違いを説明するために調整が必要な場合があります。我々のアッセイ条件では、すべての遺伝子型が悪く行ったり、同様に制御遺伝子型のハエにテストされていることに注意してください。 </li><li> 15からの結果の平均を取る試験。 </li><li>チューブ内のハエの総数（=％が活動を登る）の割合としてエクスプレス平均、繰り返し数（N）は、各遺伝子型についてテスト独立コホートの数で与えられる</li><li>時間の経過とともに異なる遺伝子型間の統計的有意性を評価する。これは、スチューデントのt検定 （2遺伝子型を比較する場合）、またはそのようなグラフパッド（グラフパッドソフトウェア、Inc.Laホヤなどの商用ソフトを使ってボンフェローニ事後検定（多重比較を行うとき）に続いて2ウェイANOVA分析を行うことができますCA、USA）。 </li></ol></li></ol> 注意 私たちは、室温で、同じ光条件下で、一日の同じ時刻にすべての私たちのアッセイを行う。 12時間の明/暗サイクル環境でハエを保つことはハエ &#39;歩行行動に概日リズムの影響を制御することをお勧めします。 2。チロシン水酸化酵素の免疫全脳マウントの検定ソリューションおよびバッファ固定液：リン酸4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、緩衝生理食塩水（PBS） 洗浄バッファー：0.1％トリトンX-100 PBS中ブロッキング緩衝液：0.1 Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA マウントメディア：MOWIOL-ダブコ（ハーロウE、レーンD.、抗体 - 実験室マニュアル、コールド·スプリング·ハーバー研究所プレス、コールド·スプリング·ハーバー、NY、アメリカ、10:418（1988で説明されたプロトコルを参照）） 手順<ol><li>キューティクルワックスを除去するため、約1分間、70％EtOHでいっぱい解剖皿にハエを入れて。 </li><li>転送は氷冷PBSでいっぱい別の解剖皿に飛ぶ。 </li><li>脳を解剖： <ol type="a"><li> （：削除翼と脚オプション）腹側を上にしてフライを置きます。 </li><li>離れて身体から頭を引っ張っ：鉗子への1セットを使用身体と脳の損傷を防ぐために、目の下キューティクルを保持するために別のものにしがみつく</li><li>口先を取り外します。 </li><li>スリットの反対側に頭のキューティクルにしがみつく口吻を除去した後、開いたままにし、脳が頭部カプセルから削除されるまで反対方向に引っ張る。 </li><li>脳からすべてのキューティクルを削除します。 </li><li>すべての空気で満たされた気管組織を除去するが、これは次のインキュベーションステップ中に浮遊するから脳を防ぐことができます。 </li></ol></li><li> P-200ピペットチップの先端から数ミリをカットし、0.1％トリトンX-100/PBSソリューションとそれを平衡</li><li>準備されたP-200ピペットチップを使用して、4％PFA / PBSを0.5mlで満たさ0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに脳を転送し、解剖が完了するまで氷上に保つ。 </li><li> 20分間室温で頭脳を修正：ラックにエッペンドルフチュー​​ブを入れてnutatorにラックを配置することによって、穏やかに回転を適用します。 </li><li>固定液を削除P-1000マイクロピペットを用いて、0.1％トリトンX-100/PBS 0.5 mlを加える反転によってミックスと1分間インキュベートさせ、一度この洗浄工程を繰り返します。 </li><li>第二の洗浄からバッファを削除し、0.1％トリトンX-100/PBSを0.5mlを加え、20分間室温でインキュベートしてみましょう、このステップを二回繰り返す。 </li><li>洗浄緩衝液を取り出し、脳はRTで1時間（0.1Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA）ブロッキングバッファーでインキュベートすることができます。 </li><li> 4で、二日間、ブロッキング溶液に抗TH抗体の1:100希釈（ &quot;特定の試薬の表&quot;を参照）で脳をインキュベート穏やかに回転し（ステップ2.6を参照してください。）とC、。 </li><li>洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 .. </li><li>穏やかな回転と、4℃で、二日間、二次antibodyinブロッキング溶液の1:200希釈で脳を平衡化します。 </li><li>洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 .. </li><li> 図2Aに示すように、マウントスライドを準備します。 <ol type="a"><li> ADD 2カバーガラス（24×60ミリメートル、ない。1.5）への取り付け、メディアのX25μlの滴。 </li><li>スライドの真ん中に隙間を残して取り付けメディアの上に置いて2つのカバーガラス（サイズ18×18ミリメートル、ない。2）、乾燥させます。 </li></ol> 注意してください。あなたの共焦点顕微鏡のステージ上にサンプルホルダーを確認してください。あなたは、カバーガラスの端部の一方（マニキュアやテープを使用）に22×22ミリメートル1.5カバーガラスを取り付けることにより25×75ミリメートルスライドの同じ大きさにすることができます。 </li><li>洗浄バッファーを外し、マウントメディアを50μlを加え、脳が上下にピペッティングすることにより、それに平衡化することができます。 </li><li>カットP-200ピペットチップ（ステップ2.4​​を参照）2カバーガラスの間の空間にスライドに脳を転送しないカバースリップでそれらをカバーを使用した。 1.5（ 図2Aを参照してください。向きにスライド上の脳は7を参照）。 注：サンプルは、前方および局留め両方の視覚化を可能にする2つのカバーガラスとの間に取り付けられている脳のrior側。 </li><li>マウントメディアとカバーガラスの間に空間全体を埋め、すべての空気を除去するための一つの角からピペット;マニキュアを乾燥したシールができます。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて1.0μmのステップサイズ（ ショウジョウバエ成体脳内のドーパミン作動性クラスターの解剖識別のための7を参照）、z軸に沿って光のセクションのシリーズを取得し、特定のクラスタ内のドーパミン作動性ニューロンの数を評価する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

我々は我々は競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

アッセイは、経路または異なる疾患連動型遺伝的背景（5件）で同様に高齢化でDAニューロンの維持に小さな化合シグナリング、特定の遺伝子の役割を研究するための有用なアプローチを提供し、ここで説明。 ショウジョウバエの驚愕誘発される負の走地性の動作が広く、特にPD連動型変異の存在下で異なる遺伝的背景におけるDAニューロンの機能のための?...

ここに記載されるアッセイの特異性は、ドーパミン作動性ニューロン3における特異的発現を達成するために、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の調節配列を利用したGal4フライラインの使用に依存している。チロシンヒドロキシラーゼは、ドーパミン合成の最初と律速段階を触媒する。ドーパミンのそれと成人のハエの脳の重なりでTH免疫反応性は、（実施例6を参照）、in vivoで DAニューロンを同定するために良い候補TH作る。また、THGal4の発現パターンは、ドーパ脱炭酸酵素遺伝子から調節配列が含まれており、DAニューロンだけでなく、トランスジェニック発現を駆動するようDdcGal4など他Gal4のラインのそれよりもより具体的であるだけでなく、3グリア細胞のセロトニン作動性ニューロンのサブセットで。 Feanyとベンダー（2000）最初のPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の汎神経表現は、STAの漸進的損失を加速することが観察さショウジョウバエのRTLE誘発性陰性走地性の動作が。我々はexpressionofα-シヌクレイン導入遺伝子10を駆動するためにDA-ニューロン特異THGal4ラインを使用して同様の結果を観察し、この中でNrf2の経路の神経保護の役割を研究するために、この機能の読み出しに使用されているPD 14のショウジョウバエモデル。ここで説明する特定のアッセイは、2および3から適合される。 ショウジョウバエの脳は、共焦点顕微鏡で脳全体のマウントに可視化することができる、少なくとも5つの異なるクラスタ（PPL1、PPL2、PAL、PPM1 / 2、PPM3）（実施例11と7を参照）に配置された100以上のDAニューロンが含まれています。それは11、9歳とショウジョウバエ脳の下落でDAニューロンの数かどうかはまだ議論の余地があるが、年齢依存性神経変性は、PD-リンクされた遺伝子がヒトの疾患をモデル化するために変異/過剰発現されたハエで観察される5。 DAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの発現は、そのような効果を有し、したがって、PDのモデルとして用いられている。ここでは、DAニューロンが細胞マーカーとしてTHを使用してマウントし、脳全体でカウントするためのアッセイを記述します。このアッセイは、13と10から適応されています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

キイロショウジョウバエは、神経系の老化と病的変性過程を研究するための貴重なモデル生物である。実験系としてのハエの利点はその遺伝扱いやす、短寿命と複雑な行動を観察し、定量的に分析するための可能性を含む。 ショウジョウバエの脳の特定の神経集団における疾患にリンクされた遺伝子の発現は、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー5、ヒト神経変性疾患をモデル化するために使用することができる。 ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、高齢化、人間の脳の中で最も脆弱な神経細胞集団の一つである。パーキンソン病では（PD）、最も一般的な神経変性運動障害は、DAニューロンの加速された損失は運動機能が徐々にかつ不可逆的な衰退につながる。年齢および環境毒素への曝露に加えて、DAニューロンの損失を符号化における特定の突然変異によって悪化するいくつかの遺伝子のまたはプロモーター領域。そのようなPD関連対立遺伝子の同定は、in vivoでの DAニューロンの神経変性を研究するためのモデルとしてのショウジョウバエの使用のための実験的な基礎を提供しています。例えば、 ショウジョウバエ DAニューロンの反復するヒトの疾患のいくつかの機能、DAニューロンの例えば進行性消失と減少し運動機能2におけるPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現。したがって、このモデルは正常PD 20.32潜在的な治療標的を同定するために使用されている。 ここでは、一般的にショウジョウバエのDAニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために使用されている2つのアッセイを説明：大人になって脳の驚愕誘発される負の走地性応答およびチロシン水酸化酵素の免疫染色に基づいて登山 ​​アッセイは、DAニューロンの数を監視するためにマウント異なる年齢で。どちらの場合も、UAS、tのインビボ発現具体的にはDAのニューロンにおけるransgenesは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター-Gal4のドライバ線3、10を使用することによって達成することができる。

我々は、PD 14のショウジョウバエモデルにおけるストレス保護Nrf2の経路の役割を研究するためにここに記載のアッセイを使用している。このモデルは、TH Gal4のドライバ2,10を用いてDAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現に依存する。 図1は TH Gal4のドライバの制御下に別の導入遺伝子を発現しているオスのハエに驚愕...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;：登山/ DAニューロンの変性と脳全体のマウントのDAニューロンを特定し、カウントするために使用されているチロシン水酸化酵素の免疫の機能的効果を研究することができます驚愕誘発性の負の走地性アッセイ。

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K ビュー.  University of Rochester Medical Center. ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述するショウジョウバエ：登山/ DAニューロンの変性と脳全体のマウントのDAニューロンを特定し、カウントするために使用されているチロシン水酸化酵素の免疫の機能的効果を研究することができます驚愕誘発性の負の?...

ビデオ: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

神経科学

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

免疫沈降およびアシル-ビオチン所（阿部）による培養海馬神経細胞におけるタンパク質パルミトイル化の検出

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

神経変性疾患のマウスモデルのための嗅覚アッセイ

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.