אנו מודים לליאו Pallanck למניות זבובים, כריסטין סומרס לקבלת סיוע טכני וגרסימוס פ Sykiotis לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי NIH אימוני המענק T32CA009363 לMCB

1. Assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זבובים של הגנוטיפ הרצוי, להפריד ביניהם על פי מין, באופן אקראי קבוצתם בקבוצות של 20-30 חיות ולהעיף אותם לתוך צלוחיות מזון חדשות כל 2-3 ימים; בדיקה כל קבוצה של זבובים (קבוצות גיל בהתאמה כלומר, עוקבה / אחד גנוטיפ) לפחות פעם בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושים דקות לפני בדיקת geotaxis השלילית, להרדים את הזבובים עם CO 2 ולמקם אותם בצינורות פלסטיק שקופים שכותרתו מראש שנעשו עם שני בקבוקוני מזון ריקים (ראה טבלת חומרים) הצטרפו בפתחיהם עם קלטת ברורה (קאמריים ממדים: 19 ס&quot;מ על 2.85 ס&quot;מ). במבחנים שלנו בדרך כלל אנו משתמשים 25 זבובים / צינור. הערה. זמן ההתאוששות מהרדמה יכול להיות מגוון מכמה דקות לכמה שעות (לדוגמה: O / N) וצריך להיות מותאמת לגנוטיפים הספציפיים שנבדקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן גבהים שונים (מ -1 עד 20 ס&quot;מ) על פיסת נייר וקלטת נייר סופג בsurfac אנכידואר, בניצב לספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות בראשונים של העיתון: הצינורות צריכים להיות כל מיושרים וקרובים ככל האפשר לנייר כדי לאפשר מדידת גובה מדויקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה הדיגיטלית (ראה טבלת &quot;ציוד המיוחדת&quot;) בחזית של הצינורות, במרחק של 20-30 ס&quot;מ מהנייר, על מעמד (למשל תיבת קצה פיפטה), בחר באפשרות &quot;הסרט&quot; ולהתחיל הקלטה; בשלב זה אתה גם צריך להתחיל טיימר כדי לעקוב אחר הזמן בין משפטים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לזבובים לאסוף בחלק התחתון של הצינור על ידי הקשה על הצינור לכמה שניות (לדוגמא 10 שניות). צעד זה צריך להתבצע באופן עקבי (כלומר אותו משך זמן, אותו כוח, אותו מפעיל) לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועות &quot;זבובים להקליט עם המצלמה הדיגיטלית עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.5-1.7 ארבעה עשר פעמים במרווחים חד min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הזבובים שהם מעלסימן 2 ס&quot;מ לאחר 10 שניות על ידי בדיקה ויזואלית של סרטים המוקלטים. הערה: בתנאי assay שלנו התנהגות geotaxis השלילית של הזבובים לא נמשכת מעבר ל10 שניות הראשונה לאחר מפתיע (כלומר זבובים החלו לנוע לכל הכיוונים 10 שניות לאחר שהבהיל אותם). המרחק המינימאלי טיפס על ידי זבובי בקרה (כלומר 1 זבובים ישנים בשבוע המבטאים את נהג THGal4, ראה אגדה של איור 1) בחלון זמן זה היה 2 ס&quot;מ. לכן, השתמשנו בסימן 2 ס&quot;מ כהפניה לניתוח פעילות הטיפוס של זבובים של גילים וגנוטיפים 10 שניות לאחר שיזם את ההתנהגות שונים. פרמטרים אלה עשויים לדרוש התאמה לחשבון להבדלים בהתנהגותם של הזבובים שנבדקו (בשל למשל לרקע גנטי שונה או בתנאי מעבדה). שים לב שבתנאי assay שלנו, את כל גנוטיפים נבדקו ביצע גרוע או בדומה לזבובים של גנוטיפ השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הממוצע של התוצאות מהחמש עשרניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע מפורש כאחוז מהמספר הכולל של זבובים בצינור (= פעילות טיפוס%); מספר החזרות (N) ניתן על ידי מספר הקבוצות עצמאיות שנבדקו עבור כל גנוטיפ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המשמעות סטטיסטית בין גנוטיפים שונים לאורך זמן. זה יכול להיות מושלם עם מבחן t של סטודנט (כאשר משווים שני גנוטיפים) או ניתוח ANOVA-2 דרך ואחריו Bonferroni פוסט הוק בדיקה (בעת ביצוע השוואות מרובות) באמצעות תוכנות מסחריות כגון GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc.La הויה, קליפורניה, ארה&quot;ב). </li></ol></li></ol> פתק אנו מבצעים את כל מבחני שלנו באותו הזמן של היום, ב RT ותחת אותם תנאי האור. שמירה על הזבובים בסביבת מחזור אור / חושך 12 שעות רצוי לשלוט על ההשפעה של מקצבי היממה על ההתנהגות של תנועה של הזבובים. 2. Immunofluorescence hydroxylase טירוזיןAssay של Mounts המוח כל פתרונות וחוצצים פתרון מקבע: paraformaldehyde 4% (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוח (PBS) כביסה חיץ: 0.1% טריטון X-100 ב PBS חסימת מאגר: 0.1% טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ &#39;NaCl, 0.1 טריטון X-100 ו 0.5% BSA תקשורת הרכבה: Mowiol-Dabco (ראה פרוטוקול המתואר בארלו E, ליין ד, נוגדנים-מעבדה ידני, מעבדות קולד ספרינג הרבור עיתונות, קולד ספרינג הארבור, ניו יורק, ארה&quot;ב, 10:418 (1988)) נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים זבובים בצלחת לנתיחה מלאות EtOH 70% לכ - 1 דקות כדי להסיר את השעווה לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה עפה לצלחת לנתיחה נוספת מלאות קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את המוח: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הזבוב עם הצד עד הגחון (אופציונלי: כנפיים ורגליים סרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הראש מהגוף: להשתמש בסט אחד של מלקחייםלשמור על הגוף ועוד אחד להחזיק בציפורן תחת עיינותיו כדי למנוע נזק למוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק בציפורן את הראש בצדדים מנוגדים של החריץ שנותרו פתוח לאחר הסרת החוטם ומושך בכיוונים מנוגדים, עד שהמוח הוא להסיר את הקפסולה בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הציפורן מהמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הרקמות קנה הנשימה אוויר מלאה, זה ימנע מהמוח צף בשלבי הדגירה הבאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כמה מילימטרים מחוץ לקצה של קצה P-200 פיפטה ולאזן אותו עם 0.1% פתרון X-100/PBS טריטון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה P-200 פיפטה המוכן, להעביר את המוח לצינור Eppendorf 0.5 מ&quot;ל מלא 0.5 מ&quot;ל של PFA 4% / PBS ולשמור על קרח עד לנתיחה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח על RT במשך 20 דקות: להחיל סיבוב עדין על ידי לשים את צינורות Eppendorf על מדף ומיקום המדף על nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבעבאמצעות P-1000 מיקרו פיפטה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של X-100/PBS טריטון 0.1%, מערבב על ידי היפוך ולתת דגירה דקות 1; חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החוצץ מלשטוף את השני, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של X-100/PBS טריטון 0.1% ולתת לדגור על RT במשך 20 דקות, לחזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ הכביסה ולתת למוח של דגירה בחיץ חסימה (0.1 מ &#39;טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ&#39; NaCl, 0.1% טריטון X-100 ו 0.5% BSA) עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את המוח עם דילול 1:100 של נוגדן אנטי-TH (ראה &quot;טבלה של חומרים כימיים ספציפיים&quot;) בפתרון חסימה, במשך יומיים, בשעת 4 ° C, עם סיבוב עדין (ראה שלב 2.6.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את המוח עם דילול 1:200 של פתרון חסימת antibodyin המשני, במשך יומיים, ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שקופיות הרכבה כפי שמודגם באיור 2 א: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">dd 2 X 25 טיפות של μl תקשורת הרכבה למכסה זכוכית (24 מ&quot;מ X 60, לא. 1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שתי כוסות כיסוי (גודל 18 x 18 מ&quot;מ, לא. 2) על תקשורת ההרכבה עוזבת פער באמצע השקופית ולתת להתייבש. </li></ol> שים לב. בדקו את בעל המדגם על הבמה של מיקרוסקופ confocal שלך. אתה יכול לעשות את מכסה הזכוכית באותו גודל של 25 x 75 מ&quot;מ שקופית על ידי הצמדת זכוכית 22 x 22 מ&quot;מ 1.5 כיסוי לאחד הקצוות (להשתמש בלק וקלטת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ הכביסה, להוסיף 50 μl של תקשורת הרכבה ולאפשר למוח כדי לאזן עם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חתך P-200 פיפטה קצה (ראה שלב 2.4) להעביר את מוחות לשקופית במרחב שבין שתי coverslips ולכסות אותם עם coverslip לא. 1.5 (ראה איור 2 א; כדי לכוון את מוחם בשקופית רואה 7). הערה: את הדגימות הם רכובים בין שתי כוסות כיסוי כדי לאפשר הדמיה של שניהם הקדמי וPosteצד rior של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את כל החלל שבין משקפיים לכסות עם תקשורת הרכבה; פיפטה מפינה אחת כדי להסיר את כל האוויר; לתת יבש וחותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך את המספר של נוירונים דופאמין באשכול ספציפי לרכוש סדרה של קטעים אופטיים לאורך ציר ה-Z עם 1.0 מיקרומטר גודל צעד באמצעות מיקרוסקופ confocal (לזיהוי האנטומי של אשכולות דופאמין במוח הבוגר תסיסנית לראות 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

אנו מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים.

מבחני מתוארים כאן לספק גישה כדאי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים, מסלולי איתות או תרכובות קטנות בתחזוקה של נוירונים תובע בהזדקנות, כמו גם ברקע גנטי הקשורים למחלות שונות (הנסקרת ב 5). התנהגות geotaxis השלילית הנגרמת בהלה של דר?...

את הספציפיות של מבחני המתוארות כאן מסתמכת על השימוש בקו זבוב Gal4 המנצל את רצפי הרגולטורים של גן hydroxylase טירוזין כדי להשיג ביטוי ספציפי בדופאמין נוירונים 3. hydroxylase טירוזין מזרז את הצעד הראשון ושער הגבלת בסינתזת דופמין. immunoreactivity בעולם בחופף במוח זבוב בוגר עם זה של דופמין, מה שהופך TH מועמד טוב לזהות נוירונים DA in vivo (ראה, למשל, 6). יתר על כן, את דפוס הביטוי של THGal4 הוא יותר ספציפי מזה של Gal4 קווים אחרים כגון DdcGal4, המכיל רצפים רגולטוריים מגן decarboxylase dopa ומניע את הביטוי מהונדס לא רק בתאי עצב DA, אלא גם בתאי עצב serotoninergic ותת קבוצות של תאי גלייה 3 . Feany והנדר (2000) נצפו לראשונה כי ביטוי הפאן עצבי של גן פ&quot;ד הצמוד האנושי α-synuclein מאיץ את האובדן ההדרגתי של STAהתנהגות geotaxis שלילית מושרה rtle בדרוזופילה. יש לנו נצפתה תוצאות דומות באמצעות THGal4 הקו הספציפי DA-נוירון לנהוג expressionof α-synuclein transgene 10 והשתמשה בזה תפקודי קריאה החוצה כדי ללמוד את תפקיד neuroprotective של מסלול Nrf2 בזה מודל של דרוזופילה פ&quot;ד 14. Assay הספציפי המתוארים כאן הוא עיבוד 2 ו -3. מוח תסיסנית מכיל יותר מ -100 נוירונים DA, מסודרים בלפחות 5 אשכולות שונים (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) אשר יכולה להיות דמיינו בmounts כל המוח על ידי מיקרוסקופיה confocal (ראה למשל 11 ו -7). זה עדיין שנוי במחלוקת או לא מספר הנוירונים DA בירידות במוח תסיסנית עם גיל 9, 11, עם זאת, ניוון מוחיים תלוי גיל הוא ציין בזבובים שבו גני פ&quot;ד צמודים כבר מוטציה / overexpressed למודל מחלות אנושיות5. הביטוי של אדם α-DA synuclein בנוירונים יש השפעה כזו, ולכן, כבר משמש כמודל למחלת פרקינסון. כאן אנו מתארים assay לנוירונים DA לספור במוח כולו עולה באמצעות TH כסמן תא. assay זה הותאם מ -13 ו -10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

תסיסנית היא אורגניזם מודל חשוב ללמוד הזדקנות ותהליכים ניווניים פתולוגיים במערכת העצבים. היתרונות של הזבוב כמערכת ניסיונית כוללים עקיבותיה גנטיות, תוחלת חיים קצרה ואת האפשרות להתבונן ולנתח כמותית התנהגויות מורכבות. הביטוי של גני מחלה צמודים באוכלוסיות עצביות מסוימות במוח דרוזופילה, יכול לשמש מודל למחלות אנושיות ניווניות כגון פרקינסון ואלצהיימר 5 של. דופאמין (DA) נוירונים הם בין האוכלוסיות העצביות הפגיעות ביותר במוח האנושי ההזדקנות. במחלת הפרקינסון (PD), ההפרעה בתנועת ניווניות השכיחה ביותר, האובדן המואץ של תובע הנוירונים מוביל לירידה הדרגתית ובלתי הפיכה בתפקוד של תנועה. בנוסף לגיל וחשיפה לרעלים סביבתיים, אובדן DA נוירונים מחריף על ידי מוטציות ספציפיות בקידודאזורי האמרגן או של מספר גנים. זיהוי אללים כאלה PD-נלווים מספק את הבסיס הניסיוני לשימוש בדרוזופילה כמודל ללמוד ניוון מוחיים של נוירונים DA in vivo. לדוגמה, הביטוי של גן α-synuclein האנושי פ&quot;ד הצמוד בתסיסנית משחזר DA נוירונים תכונות מסוימות של המחלה בבני האדם, למשל אובדן הדרגתי של נוירונים DA ותפקוד של תנועה 2 במגמת ירידה. בהתאם לכך, מודל זה שימש בהצלחה לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בפ&quot;ד 8. כאן אנו מתארים שני מבחני שיש בדרך כלל נעשה שימוש כדי ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של נוירונים DA בדרוזופילה: assay טיפוס המבוסס על התגובה הנגרמת בהלה השלילית geotaxis וimmunostaining hydroxylase טירוזין של כל המוח בוגר mounts כדי לפקח על מספר הנוירונים DA בגילים שונים. בשני המקרים, בביטוי vivo של כטב&quot;מ לאransgenes במיוחד בנוירונים DA יכול להיות מושגת על ידי השימוש בhydroxylase טירוזין (TH) אמרגן Gal4 קו נהג 3, 10.

יש לנו בשימוש במבחנים שתוארו כאן כדי ללמוד את התפקיד של מסלול Nrf2 מגן מתח במודל של דרוזופילה פ&quot;ד 14. מודל זה מסתמך על הביטוי של גן α-synuclein האנושי בנוירונים תובע באמצעות Gal4 נהג TH 2, 10. איור 1 מראה תוצאת נציג ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA) בנוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt;: הטיפוס / assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה המאפשר ללמוד את ההשפעות הפונקציונליות של תאי עצב וניוון DA immunostaining hydroxylase טירוזין המשמש לזיהוי וספירת תאי עצב DA בmounts כל המוח.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K Views.  University of Rochester Medical Center. כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA) בנוירונים דרוזופילה: הטיפוס / assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה המאפשר ללמוד את ההשפעות הפונקציונליות של תאי עצב וניוון DA immunostaining hydroxylase טירוזין המשמש לזיהוי וספירת תאי עצב DA בmounts כל המוח....

Video: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

מבחני חוש הריח למודלי עכבר של ניווניות מחלות

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.