Ce protocole permet à l’utilisateur d’étudier l’impact des interventions chirurgicales invasives utilisées dans la clinique sur les comportements tumoraux cellulaires, tels que la migration, l’invasion et la prolifération. Cette méthode permet uniquement la visualisation de la même tumeur avant et après une procédure invasive, fournissant un aperçu qui pourrait être manqué dans une approche non longitudinale. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris adulte anesthésiée, monter la souris sur un cadre stéréotaxique et fixer la tête avec une pince nasale et deux barres d’oreille.
Utilisez une lampe chauffante pour préserver la température corporelle et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. À l’aide de ciseaux pointus, raser la fourrure sur le crâne des yeux à la base du crâne, et utiliser 70% d’éthanol pour stériliser la peau exposée. Couper la peau d’une manière circulaire, et utiliser un coton-tige pour gratter le périoste exposé.
Traitez la zone chirurgicale avec une baisse de 1% de lidocaïne, et une concentration de 1:100 000 d’épinéphrine pendant cinq minutes avant d’enlever la solution excédentaire avec un coton-tige. Utilisez de la colle cyanoacrylate pour coller les bords de la peau au crâne, et placez le cadre stéréotaxique sous un microscope stéréo dissection avec un grossissement 4x. Ensuite, percez soigneusement une rainure circulaire superficielle de cinq millimètres de diamètre sur l’os pariétal droit.
Et appliquez une goutte de tampon de cortex sur la rainure. Utilisez des forceps minces pour soulever le rabat d’os pour visualiser la surface du cerveau, et utilisez des forceps incurvés, coniques et très fins pour enlever le dura mater. Si le saignement se produit, utilisez une éponge de gélatine absorbable pour atteindre l’hémostase.
Pour l’injection de cellules tumorales, chargez environ trois microlitres des cellules dans une seringue étanche au gaz de cinq microlitres équipée d’une aiguille de type point deux. Fixez l’aiguille sur le bras manipulateur stéréotaxique et retirez le tampon du cortex du tissu exposé. Placez la pointe de la seringue au milieu de la craniotomie et insérez l’aiguille à une profondeur de 0,5 millimètre de la surface du crâne.
Ensuite, ajoutez une goutte de cortex tampon à la craniotomie, et utilisez un injecteur de pompe à microsyringe pour livrer les cellules à un taux de 250 à 400 nanolitres par minute. Pour préparer la fenêtre d’imagerie crânienne, remplacez le tampon du cortex par une goutte d’huile de silicone au site de craniotomie pour éviter les bulles d’air sous la fenêtre. Sceller le cerveau exposé avec un coverslip de six millimètres, et appliquer de la colle cyanoacrylate entre le coverslip et le crâne.
Ensuite, utilisez de fines pinces à épiler pour appuyer doucement sur le coverslip contre le crâne. Au point de temps expérimental approprié, placez la souris face vers le haut dans une boîte d’imagerie, et réglez l’objectif d’eau 25x à la position z la plus basse. Ajoutez une grande goutte d’eau à l’objectif et transférez la boîte d’imagerie dans la chambre climat sombre de 37 degrés Celsius du microscope.
Apportez l’objectif à la fenêtre d’imagerie crânienne coverslip jusqu’à ce que la goutte d’eau touche le coverslip. Et en utilisant le mode d’épifluorescence, observez la tumeur à travers l’oculaire pour mettre les cellules au point. Réglez le laser à la longueur d’onde correcte et sélectionnez le mode live.
Après avoir sélectionné plusieurs postes d’intérêt pour l’imagerie, enregistrez leurs coordonnées dans le logiciel. Définissez une z-stack pour chaque position pour acquérir le volume maximal de cellules tumorales sans compromettre la résolution des cellules tumorales, avec la taille de l’étape entre les images réglées à trois micromètres. Ensuite, acquérir des images du volume tumoral à différentes positions toutes les 20 minutes pendant deux heures, en ajoutant de l’eau à l’objectif avant chaque acquisition d’image.
Après l’acquisition de la dernière image, transférez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Un jour après la première séance d’imagerie, fixez la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique comme démontré, et utilisez un coton-tige imbibé d’acétone pour essuyer les bords du coverslip jusqu’à ce que la colle soit ramollie. Faites glisser une aiguille de calibre 25 sous le coverslip et utilisez des forceps à point mince pour la soulever, et hydratez la craniotomie avec un tampon de cortex frais.
Perforer la tumeur à une profondeur d’un millimètre avec une aiguille de calibre 25, arrêter tout saignement avec une éponge de gélatine stérile, et sceller la surface du cerveau avec de l’huile de silicone frais. Collez ensuite une nouvelle couverture de six millimètres sur la plaie. Pour l’analyse d’image, ouvrez le fichier LIF en accéléré dans le logiciel microscope et sélectionnez le processus d’onglet, les outils de processus et la fusion.
Sélectionnez la première image de la séquence de temps et cliquez en premier. Sélectionnez la deuxième image de la séquence de temps et cliquez sur deuxième. Dans Merge Dimensions, sélectionnez t pour le temps, puis cliquez sur appliquer.
Un nouveau fichier avec deux points de temps sera généré. Après avoir suivi chaque série time-lapse pour trois z-stacks consécutifs séparément, faites glisser le dossier contenant les images time-lapse à ImageJ. Sélectionnez l’onglet Plugins, Tracking et MtrackJ.
Pour suivre chaque cellule, sélectionnez Ajouter et cliquez sur chaque cellule à chaque point de temps. Cliquez ensuite sur mesurer, et enregistrer le fichier pour extraire la mesure des pistes. La migration des cellules tumorales individuelles peut être déterminée en suivant la trajectoire de migration au fil du temps dans différents plans xy de la pile z et tracée en pourcentage des cellules migratrices avant et après biopsie.
Le taux de prolifération des cellules tumorales peut être quantifié en fonction de la condensation Dendra2 taguée H2B sur la mitose et tracée en pourcentage des cellules de division avant et après biopsie. La comparaison de la distribution de la vitesse de migration avant et après la biopsie dans la même tumeur, révèle que le nombre de cellules migratrices augmente après l’intervention, avec une diminution associée du nombre de cellules lentes à nonmigratoires. En moyenne par tumeur, une augmentation de 1,75 fois du pourcentage de cellules migratrices est observée lorsqu’une lésion de la biopsie est effectuée, par rapport aux souris témoins non biopsiées.
Bien que le pourcentage de cellules tumorales migratrices diminue par la suite chez les souris témoins et biopsiées, les souris biopsiées présentent toujours une capacité migratoire plus élevée que les souris témoins dans l’ensemble. Le comportement prolifératif de cellules de tumeur démontre également une augmentation de 1,52 fois du nombre d’événements mitotiques sur la biopsie au fil du temps, par rapport aux souris témoins non biopsied. De noter qu’aucune induction de la migration ou de la prolifération des cellules tumorales n’est observée après le remplacement de la fenêtre d’imagerie crânienne sans biopsie, ce qui indique que l’augmentation des taux de prolifération et de migration des cellules tumorales est spécifiquement déclenchée par les lésions de la biopsie.
Il est important de travailler avec une grande précision et des compétences chirurgicales pendant les étapes d’imagerie crânienne, d’implantation et de remplacement. Une pratique extensive peut être nécessaire.
