Ce travail a été financé par des subventions des National Institutes of Health (AI079442 et AI091918) attribués à SEFD

1. Préparation de la gélose sélective des médias (BHI / L + G) pour inhiber microbiote intestinal <ol><li> Peser 26 g de cerveau-coeur Infusion Agar (Difco), 7,5 g de LiCl et 5,0 g de glycine et le placer dans un ballon de 1 litre. Ajouter 500 ml d&#39;eau désionisée. </li><li> Chauffer sur un agitateur magnétique jusqu&#39;à ébullition d&#39;agar, en remuant continuellement. Prenez le ballon hors du feu, laissez les bulles s&#39;installer brièvement, puis ramener à ébullition. </li><li> . Autoclave pendant 30 min à 121 ° C sous 16-19 psi sur un cycle liquide REMARQUE: Laisser le barreau d&#39;agitation dans le ballon. </li><li> Amener les médias à 55 ° C dans un bain d&#39;eau ou laisser refroidir à température ambiante. Ne pas laisser la solution se refroidir à 55 ° C ou cristaux se formeront dans l&#39;agar. Les cristaux ne freinent L. monocytogenes et n&#39;affecte pas les propriétés sélectives des médias. Toutefois, les cristaux seront semblables en apparence à de petites colonies et il sera difficile de compter CFU bactérienne. </li><li> Mélanger délicatement leagar pendant 1 min à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique. Éviter la formation de bulles d&#39;air. Verser l&#39;agar-agar dans des boîtes de Pétri (~ 25 ml / plaque). Note: Ce média ne supporte pas la croissance de tous L. souches monocytogenes. Par exemple, L. monocytogenes EGDe pousse bien sur cette gélose, avec des colonies visibles dans les 36-48 heures, mais 10403s ne pousse pas sur ce support. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;inoculum <ol><li> Couper le pain blanc tranché (Kroger) en petits (2-3 mm) cubes avec des ciseaux ora lame de bistouri stérile stérile. Ne pas utiliser les croûtes. Stocker des pièces individuelles dans des microtubes à -20 ° C jusqu&#39;à ce que le jour de l&#39;infection. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un scalpel stérile, couper des petits (0,5-1 cm) de morceaux de beurre salé (Kroger) et placer chacun dans un tube à centrifuger stérile. Chaque tube contient assez de beurre pour préparer 50 - 60 morceaux de pain. Conserver à -20 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Cultivez L. monocytogenes dans du bouillon BHI agitation à 30 &amp;deg; C jusqu&#39;à ce que la culture atteigne une DO 600 de ~ 0.8-1.0. Préparez 500 aliquotes dans des tubes à centrifuger, en prenant soin de vortex de l&#39;échantillon fréquemment de sorte que tous les tubes contiennent le même nombre de bactéries. Conserver à -80 ° C. </li><li> Pour titrer les portions bactériennes, décongeler un tube sur la glace, puis ajouter 500 ul de 9,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant 1,5 heures debout à 30 ° C. Plate dilutions en série sur gélose BHI. Attendez-vous à un titre de ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml. Remarque: Si portions homogènes sont préparés, peuvent s&#39;attendre à chacun des tubes pour conduire ce titre quand il est préparé d&#39;une manière similaire avec un écart de 2 à 4 fois. </li><li> Pour infecter des souris, préparer une aliquote de L. monocytogenes comme décrit dans l&#39;étape 2.4. Environ 20 min avant le L. culture monocytogenes est prêt, décongeler les morceaux de pain à température ambiante. Faire fondre une aliquote de beurre à 55 ° C et préchauffer un petit volume de PBS à 55 ° C. Préparer morceaux assez pain pour qu&#39;il y ait au moins un par sourisd&#39;être infectées et au moins une pièce supplémentaire permettant de déterminer le titre de l&#39;inoculum réelle. </li><li> Sur la base du titre prédéterminé de l&#39;aliquote bactérienne, calculer le volume total de L. culture monocytogenes nécessaire pour préparer l&#39;inoculum pour le nombre requis de morceaux de pain. Pellet les bactéries par centrifugation à 14000 g pendant 10 min Aspirer tous bouillon BHI et remettre en suspension les bactéries dans un petit volume de PBS préchauffé (2 pi / pain pièce). </li><li> Vortex le beurre fondu, ajouter des bactéries (en utilisant un volume total égal à 3 pl / pain pièce) et bien mélanger. Remarque: Ne pas tenter de préparer plus de 10-15 morceaux de pain à un moment ou le beurre va se solidifier. </li><li> En travaillant rapidement, 5 ul de la suspension bactérienne sur un seul morceau de pain dans un tube de centrifugation. La solution doit être complètement absorbée par le morceau de pain. </li><li> Pour déterminer le titre réel de l&#39;inoculum, ajouter 1 ml de PBS stérile à l&#39;un des piec de paines. Vortex vigoureusement pendant 1 min. Préparer des dilutions en série et la plaque à la fois BHI et BHI / L + G agar. </li><li> Autre procédure pour un titre élevé (&gt; 10 9 UFC) inoculum. Si le culot bactérien est trop grand, il peut être difficile à mettre en suspension dans un si petit volume, et le matériau résultant est très visqueux, comme une pâte, et une partie de l&#39;inoculum peut s&#39;en tenir aux côtés du tube de centrifugation. Dans ce cas, il est préférable d&#39;inoculer le pain dans un plat mm stérile 60 de culture, et d&#39;offrir à l&#39;ensemble du plat (sans le couvercle) de la souris (voir ci-dessous). Tout excédent inoculum qui n&#39;est pas absorbé par le pain peut être consommé directement par la souris. En général, il faut plus de temps pour les souris de manger tout le pain et lécher le plat propre que le protocole standard décrit ci-dessous, si ce n&#39;est que la méthode préférée lorsqu&#39;il s&#39;agit d&#39;inoculum très haut titre. </li></ol> 3. L&#39;infection de souris <ol><li> Achetez des souris BALB / c / By / J (Stock # 0010026) et C57BL/6/J (Stock# 000644) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et à utiliser à 6-9 semaines d&#39;âge. </li><li> Rapide les souris d&#39;une journée (24 heures) avant l&#39;infection par le retrait de l&#39;aliment et en plaçant la souris sur un plancher surélevé (1 pouce) de fil (# 3 mailles; Allentown) pour empêcher la coprophagie. Laisser une litière dans la cage pour absorber l&#39;urine, mais pas assez pour élever les excréments hangar. Autoriser l&#39;accès illimité à l&#39;eau. </li><li> Infecter la souris au début du cycle d&#39;obscurité, en travaillant sous une hotte à flux laminaire équipée d&#39;une ampoule de lumière rouge. Transfert d&#39;un simple clic de souris à un (sans literie) cage vide. Utilisation d&#39;une pince stérile, transférer le morceau de pain contaminé au fond de la cage vide. En règle générale, la souris va ramasser le morceau de pain et de le consommer entièrement dans 2-10 min. Si la souris ne mange pas le pain tout de suite, retourner la cage d&#39;accumuler et de laisser la souris au repos pendant 20-30 min. La majorité des animaux va manger le pain dans ce délai, toutefois, les souris peuvent être laissés au repos, sans accès à l&#39;OTsa nourriture ou de l&#39;eau pour un maximum de 2 heures. </li><li> Après l&#39;infection, retournez la souris dans sa cage d&#39;origine et de reconstituer le chow souris. Continuer à loger les souris sur planchers de fil soulevée pendant la durée de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Surveiller le niveau de bactéries excrétées dans les fèces <ol><li> tubes d&#39;étiquettes et de pré-pesée microcentrifuge à utiliser pour la collecte de matières fécales. </li><li> Travailler rapidement après avoir récupéré une cage de souris, placez chaque souris dans un bécher de 500 ml en plastique. En règle générale les souris expulser 1-4 boulettes de selles dans les 5 min. </li><li> Utilisez une pince stérile pour transférer les matières fécales de tubes correctement étiquetés. </li><li> Peser chaque tube et de calculer le poids des selles en soustrayant le poids du tube vide. Poids typiques de pelotes fécales vont de 10 à 30 mg. </li><li> Ajouter PBS dans chaque tube (200 mg μl/30 fèces) et utiliser un cure-dent stérile pour écraser les les pelotes fécales. </li><li> Vortex chaque tube pendant 30 secondes, puis préparer des dilutions en série et la plaque sur BHI / L+ G agar. Comptez le nombre de colonies et calculer UFC / mg fèces. </li></ol> 5. Traitement des tissus intestinaux infectés <ol><li> Euthanasier les souris, de façon aseptique récolter l&#39;estomac et les intestins de chaque souris comme un simple tissu et recueillir dans des plats vides mm 100 Pétri. </li><li> Séparer l&#39;intestin grêle, du caecum et du côlon et le placer dans des plats séparés 60 mm stockées sur la glace. L&#39;intestin grêle peuvent être divisés par longueur en trois parties égales rapprochant le duodénum, ​​le jéjunum et l&#39;iléon pour faciliter le retrait du contenu luminal. Les tiers de tissu peuvent alors être traitées soit ensemble (pour UFC par entières intestin grêle) ou séparément. Tissus humides avec ~ 0,5 ml de PBS stérile pour garder souple et prévenir les déchirures lors de la manipulation. </li><li> Remplir une seringue de 10 ml avec 8 ml de PBS stérile et attacher une aiguille de calibre 25. Utilisez des pinces stériles pour faire sortir le contenu luminal dans un bécher de déchets (ou un tube stérile de 50 ml si la collecte des bactéries luminales). Grippesh 4 ml de PBS à travers une extrémité du tissu, utilisez des pinces pour faire sortir le contenu, puis retournez le tissu et répéter à l&#39;autre bout. </li><li> Pour quantifier le nombre de Listeria dans le contenu luminal, centrifuger les bouffées regroupées pour 20 min à 12000 xg, suspendre le culot dans 0,5 à 1,0 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Pour quantifier le nombre total de quantité associée à la cellule Listeria, ouvert tous les tissus lavés en coupant longitudinalement avec lame de bistouri stérile, puis faire plusieurs coupes latérales de découper le tissu en petits fragments. Remarque: cette étape est essentielle pour veiller à ce que le tissu intestinal ne pas s&#39;enrouler autour de la lame d&#39;homogénéisation. Transférer les morceaux intestinaux dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 2 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Stériliser un homogénéiseur tissulaire (Fisher PowerGen 1000) en plaçant la sonde dans l&#39;éthanol à 70% à la puissance de 60% pendant 30 secondes. Attendez que l&#39;éthanol à l&#39;air sec, ou le processus dans l&#39;eau stérile pendant 10 sec. Homogénéiser chaque tiuestion pendant 1 min. Répéter le traitement avec de l&#39;eau stérile entre chaque échantillon, et d&#39;utiliser l&#39;éthanol à 70% entre les groupes d&#39;échantillons. </li><li> Préparer des dilutions en série de chaque échantillon dans de l&#39;eau stérile et la plaque sur BHI / L + G agar. </li></ol> 6. Traitement des personnes infectées dans les ganglions mésentériques <ol><li> ganglions lymphatiques récolte aseptique, placer dans un plat 60 mm stérile sur la glace, et d&#39;utiliser des pinces stériles pour enlever tout le gras ci-joint. Attendez-vous à trouver 3-6 nœuds par souris. </li><li> Préparer écrans en treillis métallique en coupant 1,5-2 pouces morceaux carrés d&#39;acier inoxydable # 80 mesh. Faire une petite incision dans chaque coin, et rabattre les quatre côtés, créant un lit surélevé. Trempez-les dans 95% d&#39;éthanol et ensuite la flamme pour stériliser, et les placer dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 0,75 ml d&#39;eau stérile. Après chaque utilisation, les écrans peuvent être recyclés en les trempant dans l&#39;éthanol à 70% pendant 20 minutes, frotter avec une brosse pour enlever les tissus inclus, ébullition pendant 20-30 min dans NaOH 2N, puis rincer abondamment à l&#39;eau. </li><li> Utilisez le pistonà partir d&#39;une stérile seringue de 3 ml pour écraser les nœuds à travers le tamis. Assurez-vous de pousser vers le bas sur l&#39;écran pour le fond du plat de sorte qu&#39;il entre en contact avec l&#39;eau dans le plat. </li><li> Passer de 0,75 ml d&#39;eau stérile à travers l&#39;écran, puis pipette de haut en bas plusieurs fois pour rincer l&#39;écran. Transfert suspension de cellules dans un tube de centrifugation. </li><li> Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Préparer des dilutions en série et la plaque soit sur BHI / L + G agar. </li></ol> 7. Le traitement des rates infectées, foies et de la vésicule biliaire <ol><li> Saisir la rate avec des pinces stériles et libérer en faisant deux entailles, une à chaque extrémité. Placer dans un tube de 15 ml contenant 2,5 ml d&#39;eau stérile. (Note: tubes à fond rond peuvent être plus faciles à utiliser avec le dispositif d&#39;homogénéisation.) </li><li> Localisez la vésicule biliaire (un petit sac rempli de liquide jaune attaché au foie) et snip soigneusement avec des ciseaux stériles à se détacher de foie sans éclater. Transfer à un microtube contenant 1 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Prélever stérilement le foie, en veillant à éliminer tous les lobes, et les transférer dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 2,5 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Homogénéiser la rate et le foie telles que décrites ci-dessus pendant 30 secondes sur la puissance de 60%. vessies Forgall, utiliser des ciseaux stériles pour déchirer dans le tube de centrifugation, puis vortex vigoureusement pendant 30 secondes. </li><li> Préparer des dilutions en série et la plaque de chaque échantillon de chaque BHI ou BHI / L + G agar. </li></ol> 8. Traitement des cerveaux infectés <ol><li> De travail à partir du côté arrière de la souris, couper la peau et du tissu au-dessus du goulot, et à travers les deux oreilles à un angle de 45 °. Utilisez une pince stérile pour détacher le volet en forme de U de la peau en tirant vers le nez et exposer le crâne et les os du visage. </li><li> Immobiliser le crâne en tenant la crête osseuse entre les yeux avec une pince, et utiliser des ciseaux pour faire des coupes profondes dans les bords latéraux du crâne. SoyezAttention à ne couper que le tissu cérébral et la moelle pas. Ensuite, couper la crête osseuse entre les yeux. Utilisez une pince pour tenir le sommet du crâne et tirez vers l&#39;arrière (vers le cou) pour exposer le cerveau. </li><li> Soulevez délicatement le cerveau de sa cavité en utilisant une pince stérile et les placer dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 1,5 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Homogénéiser pendant 20 secondes sur la puissance de 60% tel que décrit ci-dessus. Préparer des dilutions en série et la plaque soit sur BHI ou BHI / L + G agar. </li></ol> 9. Procédure complémentaire: fractionnement des tissus intestinaux 9.1 isolement de bactéries dans la fraction de mucus <ol><li> Pour chaque tissu intestinal, préparer 3 tubes contenant 3 ml de 6 mm N-acétylcystéine (NAC; Sigma # A-9165). </li><li> Placez la rougeur et couper longitudinalement tissus dans le premier tube pendant 1-2 min, en remuant vigoureusement toutes les 20-30 secondes. En utilisant des pinces stériles, ramasser le tissu et presser doucement sur le côté du tube pour enlever l&#39;excès de savon mouid. </li><li> Répétez l&#39;étape 9.1.2 deux fois plus en utilisant les tubes du CNA restants. Retirez le tissu intestinal et mettre de côté pour un traitement ultérieur. </li><li> Piscine du CNA lave (total de 9 ml) et centrifuger pendant 20 min à 12000 x g. </li><li> Reprendre le culot dans de l&#39;eau stérile, vortex pendant 30 secondes, préparer des dilutions en série et la plaque sur BHI / L + G. </li></ol> 9.2 isolement de bactéries dans la cellule épithéliale Fraction (CE) <ol><li> Découpez chaque tissu en petits morceaux avec des ciseaux stériles et les placer dans un tube de 50 ml contenant 5 ml de RPMI (Invitrogen # 21870) supplémenté avec 5% de FBS (RP-5), 5 mM EDTA et 1 mM DTT. Incuber ° C pendant 20 min sous agitation à 37. </li><li> Transférer les morceaux intestinales dans un nouveau tube contenant 5 ml RP5/EDTA/DTT et incuber pendant 20 min sous agitation à 37 ° C. Enregistrer le support du premier tube et mettre de côté à 37 ° C. Répétez ce processus une fois de plus pour un total de trois incubations 20 min dans RP5/EDTA/DTT. Si procéder à la lamina propria isoétape de règlement, transférer les morceaux restants dans l&#39;intestin vide tube de 50 ml. </li><li> Combiner les trois lavages de RP5/EDTA/DTT (volume total de 15 ml) et centrifuger à basse vitesse (1200 xg) à culot cellulaire. </li><li> Pour quantifier les bactéries extracellulaires, recueillir le surnageant et centrifuger pendant 20 min à 12000 x g. Reprendre le culot dans 0,5 à 1,0 ml d&#39;eau stérile et des dilutions en série de plaques sur BHI / L + G agar. </li><li> Pour énumérer les bactéries intracellulaires, remettre le culot CE dans 5 ml de RP-5 contenant 25 pg / ml de gentamicine. Incuber la suspension de cellules individuelles pendant 30 min à 37 ° C plus 7% de CO 2 de tuer tout reste extracellulaire L. monocytogenes. Laver les cellules deux fois dans du PBS, de suspendre dans 0,5 ml d&#39;eau stérile, et le vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Préparer des dilutions en série dans l&#39;eau et la plaque sur BHI / L + G. Note: Les cellules recueillies à ce stade seront également contenir des cellules à partir des plaques de Peyer le sous-jacent. Si vous le souhaitez, le Peyer visible estLes patches peuvent être éliminés des tissus intestinaux avant de curage et de coupe longitudinale. </li></ol> 9.3 isolement de bactéries dans la lamina propria (LP) Fraction <ol><li> Rincer l&#39;excès de DTT / EDTA à partir des morceaux intestinales par addition de 25 ml de PBS stérile au tube. Agiter vigoureusement, transférer dans un nouveau tube et répéter deux fois. </li><li> Transférer les morceaux intestinales dans un tube de 50 ml contenant 4 ml de solution de digestion composé de RP-5 additionné de 1 mg / ml collagénase de type IV et de 40 pg / ml DNAse I. incuber pendant 40 min sous agitation à 37 ° C. </li><li> Transférer les morceaux non digérés dans un nouveau tube contenant une solution de digestion de 4 ml et répéter une ou deux fois jusqu&#39;à ce que les morceaux de tissus sont complètement digérées. Enregistrer chacune des solutions de digestion, qui contiennent des cellules LP libérées, à 37 ° C. </li><li> Centrifuger les solutions de digestion communs à basse vitesse (1200 xg) à culot cellulaire. Traiter le surnageant et le culot cellulaire séparément comme le descrIBED ci-dessus pour énumérer les bactéries intracellulaires et extracellulaires, respectivement. </li></ol>

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	<li>Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+sigmaB+in+adaptation+of+Listeria+monocytogenes+to+growth+at+low+temperature.">Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature.</a> Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).</li><li>Neunlist, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salting+and+cold-smoking+on+the+culturability,+viability,+and+virulence+of+Listeria+monocytogenes+strain+Scott+A.">Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A.</a> Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).</li><li>Aureli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+febrile+gastroenteritis+associated+with+corn+contaminated+by+Listeria+monocytogenes.">An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes.</a> N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).</li><li>Dalton, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+gastroenteritis+and+fever+due+to+Listeria+monocytogenes+in+milk.">An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk.</a> N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).</li><li>Frye, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+febrile+gastroenteritis+associated+with+delicatessen+meat+contaminated+with+Listeria+monocytogenes.">An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes.</a> Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).</li><li>Salamina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foodborne+outbreak+of+gastroenteritis+involving+Listeria+monocytogenes.">A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes.</a> Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).</li><li>Mead, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food-related+illness+and+death+in+the+United+States.">Food-related illness and death in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).</li><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+Clinical+and+experimental+update.">Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update.</a> The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).</li><li>Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+CD8+T+cell+responses+with+Listeria+monocytogenes+infection.">Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection.</a> Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).</li><li>Disson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+listeriosis+in+natural+and+genetically+engineered+animals.">Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals.</a> Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).</li><li>Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A/J+mice+are+susceptible+and+C57BL/6+mice+are+resistant+to+Listeria+monocytogenes+infection+by+intragastric+inoculation.">A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation.</a> Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).</li><li>Gajendran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+IFNgamma+expression+is+insufficient+for+efficacious+control+of+food-borne+bacterial+pathogens+at+the+gut+epithelial+barrier.">Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier.</a> Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).</li><li>Lecuit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+model+for+listeriosis:+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier.">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li><li>Pron, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+the+intestinal+stage+of+listeriosis+in+a+rat+ligated+ileal+loop+system.">Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system.</a> Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).</li><li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design.">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li><li>Ghanem, B. o. u., N, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice.">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathogens. , (2012).</li><li>Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Day/night+food+consumption+in+mice+is+strain+and+age-dependent.">Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent.</a> Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).</li><li>Camejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arsenal+of+virulence+factors+deployed+by+Listeria+monocytogenes+to+promote+its+cell+infection+cycle.">The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle.</a> Virulence. 2, 379-394 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Toutes les expériences décrites ici ont été réalisées en conformité avec le Bureau de l&#39;Animal de Laboratoire Bien-être (OLAW) avec l&#39;approbation du ICAUC à l&#39;Université du Kentucky.

Souris consanguines sont pas uniformément réceptif à l&#39;alimentation, à tous les moments de la journée, et leur volonté de manger le pain contaminé dépendront à la fois sur le type de souche et l&#39;âge des souris 17. Dans notre expérience, 6-9 semaine vieilles souris B6 sont réceptifs à l&#39;alimentation, à tout moment de la journée, mais les souris BALB ne seront pas toujours manger le morceau de pain que si elle est offerte au cours de leur cycle sombre. Le cycle de la lumière de la pi...

Listeria monocytogenes sont facultatives bactéries pathogènes intracellulaires qui causent des infections d&#39;origine alimentaire chez les humains. Les bactéries sont résistantes à la plupart des processus utilisés pour protéger notre approvisionnement alimentaire, comme le séchage, le salage, ou 1,2 de réfrigération et les infections sont généralement liés aux traités », prêt-à-manger&quot; des aliments qui ne sont pas chauffés avant la consommation . Dans plusieurs épidémies précédentes, la source de L. nourriture monocytogenes contaminé a été identifié, et le groupe restreint d&#39;individus exposés a été étroitement surveillé 3-6. Dans ces exemples, la maladie clinique chez les individus en bonne santé varie d&#39;une légère gastro-entérite spontanément à des infections intestinales et systémiques plus graves ayant nécessité une hospitalisation. L. infections monocytogenes chez les individus immunodéprimés, y compris les nouveau-nés et les personnes âgées, ont été associés à un taux de mortalité élevé (25-30%), même avec un traitement antibiotique <sup&gt; 7,8. On en sait peu sur la dose infectieuse pour L. monocytogenes, ou les facteurs de l&#39;hôte qui régissent la susceptibilité à l&#39;infection après la transmission orale, principalement en raison de l&#39;absence d&#39;un petit modèle animal qui récapitule ce large éventail de résultats d&#39;infection. Le modèle le plus largement utilisé de la listériose soit par voie intraveineuse inoculation (iv) de souris. Le modèle IV est hautement reproductible, et a été extrêmement utile pour étudier les réponses des cellules T naïves à la fois et de la mémoire au cours de l&#39;infection par 9,10. L&#39;inconvénient du modèle IV est qu&#39;il contourne complètement la phase intestinale de l&#39;infection. Après la transmission d&#39;origine alimentaire, la muqueuse intestinale constitue une barrière qui ralentit et limite le nombre de bactéries qui peuvent continuellement diffuser vers les tissus périphériques sans doute. En revanche, l&#39;ensemble de l&#39;inoculum peut être trouvé dans la rate et du foie dans les minutes suivant l&#39;administration iv, et ce grand bol d&#39;organismes peut submerger d immunitaire innéefenses dans ces tissus. L&#39;infection orale par gavage des souris est utilisé moins souvent, parce que de fortes doses (10 9 -10 11 CFU) sont généralement nécessaires pour atteindre la colonisation intestinale 10. En outre, intragastrique (ig) inoculation avec une aiguille d&#39;alimentation ne génère pas une période reproductible d&#39;une infection gastro-intestinale avant dissémination systémique. Certains laboratoires ont rapporté que L. monocytogenes atteindre la rate et le foie dans les 4-12 heures après l&#39;infection (HPI), tandis que d&#39;autres n&#39;ont pas montré de propagation systémique jusqu&#39;à 48 HPI 11-15. Cette variation du laboratoire au laboratoire peut être une conséquence de la nature invasive de ig inoculation, ce qui peut entraîner un traumatisme mineur à la muqueuse de l&#39;œsophage, et de promouvoir invasion sanguine directe de la bactérie. Nous avons récemment développé un nouveau modèle de souris de oral L. infection monocytogenes qui imite de près toutes les phases de la maladie humaine 16. L&#39;infection survient lorsque les souris ingèrent des morceaux de contaminé alimentaire, un processus qui est non-traumatique, et ne nécessite pas de compétences spécialisées par des chercheurs de laboratoire. Pendant une période de temps discrète (36-48 h), L. monocytogenes reproductible colonisent seulement le tractus gastro-intestinal, permettant ainsi enquête sur les mécanismes utilisés par les pathogènes Listeria de translocation à travers la muqueuse de l&#39;intestin et de diffuser dans les tissus périphériques. Surtout, le modèle peut être utilisé pour étudier les différences dans la résistance innée de l&#39;hôte à l&#39;infection. Dans une étude précédente, nous avons montré que des souris BALB / c / par / J ont été très sensibles à la listériose d&#39;origine alimentaire, avec la réplication exponentielle de L. monocytogenes qui se produisent dans l&#39;intestin, la rate, le foie et la vésicule biliaire 16. En revanche, les souris C57BL / 6 étaient résistants à l&#39;infection d&#39;origine alimentaire, avec seulement colonisation transitoire de L. monocytogenes se produisant dans chacun de ces tissus. Une autre caractéristique du modèle d&#39;origine alimentaire qui imite de près la maladie humaine, c&#39;est que la diffusion naturelleau cerveau survenue pendant les derniers stades de l&#39;infection (5-7 dpi).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes sont facultatives bactéries pathogènes intracellulaires qui causent des infections d&#39;origine alimentaire chez les humains. Très peu est connu au sujet de la phase digestive de listériose en raison de l&#39;absence d&#39;un petit modèle animal qui reproduit fidèlement la maladie humaine. Ce document décrit un nouveau modèle de souris pour la transmission orale de L. monocytogenes. En utilisant ce modèle, les souris nourries L. monocytogenes-pain contaminés ont une phase discrète de l&#39;infection gastro-intestinale, suivie de degrés de dissémination systémique varier dans des souches de souris sensibles (BALB / c / par / J) ou résistants (C57BL / 6). Pendant les derniers stades de l&#39;infection, on observe la diffusion de la vésicule biliaire et le cerveau. Le modèle d&#39;origine alimentaire de la listériose est hautement reproductible, ne nécessite pas de compétences spécialisées, et peut être utilisé avec une grande variété de souches bactériennes et des souches de souris de laboratoire. En tant que tel, il est le modèle idéal pour étudier les stratégies de virulence utilisés par L. monocytogenes </em&gt; pour favoriser la colonisation intestinale, ainsi que la réponse de l&#39;hôte à l&#39;alimentation infection bactérienne supporté invasif.

Colonies de L. monocytogenes seront visibles sur BHI / L + G plaques après 36-48 heures d&#39;incubation à 37 ° C. Les colonies ont un aspect blanc crème en forme de dôme lisse (figure 1A). La croissance sera inhibée pour la majorité de la flore intestinale, mais il n&#39;est pas rare de voir des colonies qui ne sont pas L. monocytogenes, en particulier lorsque le placage de l&#39;intestin grêle ou du colon directement sans dilution significative (figure 1B). L...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Cet article décrit une nouvelle méthode pour infection orale de souris à l&#39;aide<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Aliments contaminés. Le protocole peut être facilement adapté pour être utilisé avec d&#39;autres bactéries pathogènes d&#39;origine alimentaire.

La transmission orale de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Chez la souris par l&#39;ingestion d&#39;aliments contaminés

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K vues.  University of Kentucky. Cet article décrit une nouvelle méthode pour infection orale de souris à l'aide Listeria monocytogenes Aliments contaminés. Le protocole peut être facilement adapté pour être utilisé avec d'autres bactéries pathogènes d'origine alimentaire.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Recherche

Immunologie et infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infection du cerveau

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagerie de la production gamma d'interféron in situ dans la rate de souris suite à l'infection à Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. Meningococcus is a transient colonizer of human nasopharynx of approximately 10% of healthy subject. In particular circumstances, it acquires an invasive ability to penetrate the mucosal barrier and invades the bloodstream causing septicaemia. In the latest case, fulminating sepsis could arise even without the consequent development of meningitis. Conversely, bacteria could poorly multiply in the bloodstream, cross the blood brain barrier, reach the central nervous system, leading to fulminant meningitis. The murine models of bacterial meningitis represent a useful tool to investigate the host-pathogen interactions and to analyze the pathogenetic mechanisms responsible for this lethal disease. Although, several experimental model systems have been evaluated over the last decades, none of these were able to reproduce the characteristic pathological events of meningococcal disease. In this experimental protocol, we describe a detailed procedure for the induction of meningococcal meningitis in a mouse model based on the intracisternal inoculation of bacteria. The peculiar signs of human meningitis were recorded in the murine host through the assessment of clinical parameters (e.g., temperature, body weight), evaluation of survival rate, microbiological analysis and histological examination of brain injury. When using intracisternal (i.cist.) inoculum, meningococci complete delivery directly into cisterna magna, leading to a very efficient meningococcal replication in the brain tissue. A 1,000-fold increase of viable count of bacteria is observed in about 18 h. Moreover, meningococci are also found in the spleen, and liver of infected mice, suggesting that the liver may represent a target organ for meningococcal replication.

Here, we describe a method to induce meningococcal meningitis through an intracisternal route of infection in adult mice. We present a step by step protocol of meningococcal infection from the preparation of inoculum to the intracisternal infection; then record the animal survival and evaluate the bacterial loads in murine tissues.