この作品はSEFDに​​授与国立衛生研究所（AI079442とAI091918）からの補助金によって支えられて

1。腸内細菌叢を抑制するために選択寒天培地の調製（BHI / L + G） <ol><li> 26グラムブレインハートインフュージョン寒天（Difco社製）、7.5グラムのLiClと5.0グラムのグリシンと1リットルのフラスコで行わ秤量。脱イオン水500mlを加える。 </li><li>マグネチックスターラー上の熱は寒天が沸騰するまで、継続的に攪拌。熱からフラスコを取り、泡が簡単に和解させてから、再度沸騰に持ち帰る。 </li><li> 。液体サイクルで16-19 psiの下に121℃で30分間のためにオートクレーブ注意：フラスコに攪拌棒を残す。 </li><li> ℃の水浴中で55にメディアを平衡または室温で冷ます。ソリューションは°Cまたは結晶が寒天で形成することになる55より涼しい取得することができないようにしてください。結晶はL.を阻害しないリステリアは、成長やメディアの選択的特性に影響を与える。しかし、結晶は小さなコロニーに外観が似ていますし、それが困難な細菌CFUをカウントするようになります。 </li><li>優しく混ぜるマグネチックスターラーを用いて1分間寒天。気泡の形成を避ける。ペトリ皿（〜25ミリリットル/プレート）に寒天を注ぐ。 注：このメディアは、すべてLの成長をサポートしていませんリステリア菌株 。例えば、L.リステリアの EGDEは36-48時間以内に目に見えるコロニーと、この寒天でよく育つが、10403s、このメディアに成長しない。 </li></ol> 2。接種の調製<ol><li>小にスライス白パン（クローガー）をカット（2-3 mm）の滅菌ハサミORA無菌手術用メスの刃を使用してキューブ。痂皮を使用しないでください。感染の日まで-20℃でマイクロチューブ内の個々の作品を保管してください。 </li><li>滅菌メスを使用し、バター（クローガー）の小（0.5-1 cm）の塊をカットし、滅菌マイクロチューブにそれぞれを配置。 60パンの部分 - 各チューブは、50を準備するのに十分なバターが含まれています。 -20℃で保存し、必要になるまで。 </li><li> L.を育てる30＆で振盪BHIブロス中のリステリア度、文化まで、Cは〜0.8〜1.0のOD 600に達した。サンプルは頻繁にそうチューブのすべての細菌の同じ数が含まれている渦に世話をして、マイクロチューブに500μlのアリコートを準備します。 -80℃で保存</li><li>細菌のアリコートを滴定するには、9.5ミリリットルBHIブロスに500μlを添加し、その後、チューブを氷上に解凍。 30℃で1.5時間立ってインキュベート℃、 BHI寒天上で平板希釈系列。 。均質アリコートを調製する場合、2〜4倍の分散と同様にして調製したときに、チューブの各々は、この力価を得ることが期待できる。〜1-5×10 8 CFU / mlの力価の注意を期待する。 </li><li>マウスに感染するには、Lのアリコートを準備ステップ2.4で説明したようにリステリア 。 L.前に約20分リステリア文化は室温でのパンの部分を解凍し、準備ができている。 55でバターのアリコートを溶かし℃、55℃でPBSのプレ暖かい少量少なくとも一つあたりのマウスが存在するように十分にパン片を作製感染しており、実際の接種の力価を決定するための少なくとも1つの余分な部分する。 </li><li>細菌のアリコートを、所定の力価に基づいて、L.の総体積を計算するリステリア培養物は、パン片に必要な数の接種を準備する必要があった。 10分間、14,000×gで遠心分離によってペレット細菌はすべてBHIブロスを吸引し、予め温めておいたPBS（2μL/パン個）少量の細菌を再懸濁します。 </li><li>渦溶かしバターを、細菌（3μL/パン部分に等しい総量を使用して）追加し、徹底的にミックス注：一度やバター固化うに複数10-15パン片を作製しようとしないでください。 </li><li>素早く作業、マイクロ遠心チューブ内の単一のパンの部分に細菌懸濁液5μlのピペット。溶液が完全にパンの部分で吸収されるべきである。 </li><li>接種の実際の力価を決定するために、パンPIECのいずれかに1ミリリットル滅菌PBSを追加ES。 1分間激しくボルテックス。段階希釈し、プレートの両方BHIとBHI / L + G寒天を準備します。 </li><li>高力価（&gt; 10 9 CFU）接種の代替手順。細菌ペレットが大きすぎる場合、そのような少量の中断が困難になることができ、得られた材料は、ペーストのように、非常に粘稠であり、接種材料の一部がマイクロチューブの側面に付着してもよい。この場合には、滅菌を60mm培養皿にパンを接種すると、（下記参照）は、マウス全体を皿（蓋なし）を提供することをお勧めします。パンに吸収されていない任意の過剰接種は、その後、マウスで直接食べることができる。非常に高力価接種を扱う場合、一般的に、それはパンのすべてを食べて、下記の標準プロトコルよりクリーンな皿をなめるようにマウスでは時間がかかりますので、これは唯一の方法をお勧めします。 </li></ol> 3。マウスの感染<ol><li> / J（株＃0010026）で雌のBALB / cの/を購入しC57BL/6/J（株式＃000644）ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から生後6-9週で使用しています。 </li><li>ファーストフードを取り外して、上げ（1インチ）ワイヤー床（＃3メッシュ;アレン）にマウスを配置することによる感染の前にマウスの1日（24時間）食糞防止のため。必要なだけの尿を吸収するためにケージ内の寝具が、小屋の糞を昇格するのに十分ではないままにしておきます。水への無制限のアクセスを許可します。 </li><li>赤色の電球を装備層流フードで働く、暗サイクルの開始時にマウスに感染。空（無寝具）ケージにシングルマウスを転送します。滅菌ピンセットを使用して、空のケージの底に汚染されたパンの部分を転送します。通常、マウスはパンの部分をピックアップしますと2-10分以内にそれを完全に消費する。マウスはすぐにパンを食べていない場合は、20〜30分間ラックとマウスが邪魔されないままにケージを返す。動物の大半はこの時間内にフレームが、しかし、マウスがOTにアクセスせず、静置することができたパンを食べるようになる最大2時間までのための彼女の食料や水。 </li><li>感染後、元のケージにマウスを返すとマウス餌を補充。実験期間上げワイヤーの床にマウスを収容するために続けています。 </li></ol> 4。糞便中のシェッド細菌のレベルを監視<ol><li>糞の収集に使用されるラベルと事前計量マイクロチューブ。 </li><li>マウスのケージを取得した後すぐに働いて、500ミリリットルのプラスチックビーカーに各マウスを置きます。通常のマウスは5分以内に1-4糞便ペレットを追放します。 </li><li>適切にラベルしたチューブに糞便を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。 </li><li>各チューブに秤量し、取チューブの重量を差し引くことにより糞便の重量を計算する。糞の典型的な重量は10から30 mgの範囲。 </li><li>各チューブ（200μl/30MGの糞）にPBSを加え、マッシュ糞に滅菌爪楊枝を使用しています。 </li><li> 30秒間ボルテックス各管を、その後BHI / L上で段階希釈し、プレートを準備+ G寒天。コロニー数をカウントし、CFU / mgの糞便を計算します。 </li></ol> 5。感染した腸管組織の処理<ol><li>マウスを安楽死させる、無菌的に単一の組織と​​して、各マウスから胃や腸を収穫し、空の100mmペトリ皿に集める。 </li><li>小腸、盲腸、そして氷の上に格納され独立した60ミリメートルの皿にコロンと場所を分ける。小腸はさらに、管腔内容物の除去を容易にするために、十二指腸、空腸、回腸とを近似する3つの等しい部分に長さで割ったものとすることができる。組織分は、その後いずれか一緒に（全体の小腸あたりCFUの場合）、または別々に処理することができます。柔軟を維持し、取り扱い中の涙を防ぐために〜0.5ミリリットル滅菌PBSでウェットティッシュ。 </li><li> 8ミリリットル滅菌PBSで10ミリリットルの注射器を記入し、25グラムの針を取り付ける。廃棄物のビーカー（または滅菌を50mlチューブ内腔の細菌を収集している場合）に管腔の内容物を絞り出すように滅菌ピンセットを使用してください。なflus組織の一方の端を通してH 4 mlのPBSは、中身を絞り出すために鉗子を使用してから、もう一方の端に組織を裏返して繰り返す。 </li><li> 1.0ミリリットル滅菌水を-腔内容におけるリステリアの数を定量化するために、0.5でペレットを中断、12,000×gで20分間、プールされたフラッシュを遠心。 </li><li> リステリア細胞関連量の合計数を定量化するために、より小さな断片に組織をスライスするには、いくつかの横方向のカットを作るその後滅菌メス刃で縦方向に切断することによって、それぞれの洗浄した組織を開き、 注：このステップでは、確実にするために不可欠である腸組織ホモジナイザー刃を包み込むことはありません。 2ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルの遠心管に腸の部分を転送します。 </li><li> 30秒間、60％のパワーで70％エタノールにプローブを配置することによって、組織ホモジナイザー（フィッシャーパワージェン1000）滅菌する。 10秒間乾燥した空気、または滅菌水の処理にエタノールを待ちます。各TIを均質1分間ssue。各サンプル間の滅菌水での処理を繰り返し、サンプルグループ間の70％エタノールを使用する。 </li><li>滅菌水及びBHI / L + G寒天上のプレートに各サンプルの希釈系列を用意します。 </li></ol> 6。感染した腸間膜リンパ節の処理<ol><li>収穫のリンパ節を無菌、氷の上に滅菌60ミリメートル皿に配置し、接続されているすべての脂肪を除去するために滅菌ピンセットを使用しています。マウス当たり3-6ノードを見つけることを期待する。 </li><li>ステンレス＃80メッシュの1.5-2インチの正方形の部分を切断することにより、ワイヤメッシュスクリーンを準備します。各コーナーに小さなカットを行い、上げ床を作成し、四辺を倒します。 95％エタノール、その後滅菌する炎に浸し、および0.75 mlの滅菌水を含む60ミリメートルペトリ皿で​​開催。それぞれの使用後、スクリーンは、20分間、70％エタノールに浸漬埋組織を除去するためにブラシで擦る、2NのNaOHで20〜30分間煮沸し、次いで水で広範囲に洗浄して再利用することができる。 </li><li>プランジ​​ャーを使用してくださいメッシュスクリーンを通して無菌3ミリリットルの注射器からマッシュへのノード。それは皿に水と接触するように、皿の底には、画面を下に押してください。 </li><li>画面をすすぎを数回上下にピペッティングし、画面を通して0.75ミリリットル滅菌水を渡すと。マイクロチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>ボルテックス細胞を溶解するために30秒間、激しく各サンプル。どちらBHI / L + G寒天上で段階希釈し、プレートを準備します。 </li></ol> 7。感染脾臓、肝臓、および胆嚢の処理<ol><li>滅菌ピンセットで脾臓をつかみ、2カット、それぞれの端に1つにすることによって解放する。 2.5ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルチューブに場所。 （ 注：ラウンドボトムスとチューブホモジナイザーで使用する方が簡単かもしれません。） </li><li>胆嚢（肝臓に取り付ける小さな黄色の液体で満たされた嚢）と破裂することなく、肝臓からデタッチする滅菌ハサミで丁寧にスニップを探します。 TRANSF1ミリリットル滅菌水を含むマイクロチューブへえー。 </li><li>無菌的にすべての葉を削除することを確認し、肝臓を除去し、滅菌水2.5 mlを入れた15ミリリットルの遠心チューブに移す。 </li><li>として、60％の電源を30秒間上記脾臓と肝臓をホモジナイズする。 Forgallの膀胱は、30秒間、激しくボルテックス後、遠心チューブに引き裂くために滅菌ハサミを使用して、。 </li><li>どちらBHIまたはBHI / L + G寒天上で段階希釈し、プレートの各サンプルを準備します。 </li></ol> 8。感染した脳の処理<ol><li>マウスの裏側からの作業は、45°の角度で首の上の皮膚と組織を切断し、両耳を越え。鼻の方に引っ張って皮膚のU字型のフラップ剥離に滅菌ピンセットを使用して、頭蓋骨と顔の骨を公開します。 </li><li>ピンセットで目の間に骨の尾根を保持することによって頭蓋骨を固定し、頭蓋骨の側縁部を越え浅い切り傷を作るハサミを使用しています。ある骨のみではなく、脳組織を切断するように注意してください。次に、目の間に骨の尾根を切った。脳を露出させるために（首に向かって）頭蓋骨の上部を保持し、後方に引っ張るために鉗子を使用してください。 </li><li>ゆっくり1.5ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルの遠心チューブに滅菌ピンセットと場所を使用して、その空洞から脳を持ち上げます。 </li><li>上述したように、60％のパワーで20秒間ホモジナイズする。 BHIまたはBHI / L + G寒天のいずれかで段階希釈し、プレートを準備します。 </li></ol> 9。補足手順：腸組織の分画粘液画分中の細菌の単離9.1 <ol><li>各腸組織の場合は、6 mMのN-アセチルシステイン（;シグマ＃-9165 NAC）の3ミリリットルを含む3チューブを準備します。 </li><li>紅潮を配置し、縦方向に積極的にすべての20〜30秒を渦巻く、1〜2分間の最初のチューブに組織を切断。滅菌ピンセットを使用して、組織をピックアップし、優しく余分な液体石鹸を削除するには、チューブの側面に絞るイド。 </li><li>残りNACチューブを使用してさらに2回のステップ9.1.2を繰り返します。腸組織を削除し、さらに処理するために脇に置きます。 </li><li>プールNACの洗浄（9ミリリットルの合計）と、12,000×gで20分間遠心する。 </li><li>滅菌水、30秒間ボルテックスでペレットを再懸濁し、BHI / L + Gで段階希釈し、プレートを準備</li></ol>上皮細胞（EC）フラクション中の細菌の単離9.2 <ol><li> 5％FBS（RP-5）、5mMのEDTA、および1mM DTTを補充したRPMIを5ml（Invitrogen社＃21870）を含む50ミリリットルチューブに滅菌ハサミと場所の小さな断片に各組織をカット。 °C 20分間37℃で振とう培養する。 </li><li> 5ミリリットルのRP5/EDTA/DTTを含む新しいチューブに腸の部分を移し、37℃で振とうし℃で20分間インキュベートする。第1のチューブからメディアを保存して、37℃で取っておく℃にRP5/EDTA/DTT三20分インキュベーションの合計のためもう一度、このプロセスを繰り返します。粘膜固有層のisoに進む場合lation工程は、空の50mlチューブに残った腸の部分を転送する。 </li><li> 3 RP5/EDTA/DTTの洗浄（15ミリリットルの合計体積）、ペレット細胞に低速（1,200×g）でで遠心分離機を兼ね備えています。 </li><li>細胞外の細菌を定量化するために、12,000×gで20分間遠心上清を収集します。 0.5でペレットを再懸濁し - 1.0ミリリットル滅菌水とプレートBHI / L + G寒天上で連続希釈。 </li><li>細胞内細菌を列挙するには、25μgの/ミリリットルゲンタマイシンを含むRP-5 5mlのECペレットを再懸濁します。残りの細胞を死滅させるL.°C +7％CO 2、37℃で30分間、単一細胞懸濁液をインキュベートするリステリア 。細胞を溶解するために30秒間0.5ミリリットル滅菌水、そして渦にサスペンド、PBSで細胞を2回洗浄します。 BHI / L + G上の水とプレートに希釈系列を準備 注：この段階で収集された細胞はまた、基礎となるパイエル板由来の細胞が含まれています。所望であれば、可視パイアーパッチはフラッシュし、縦方向に切断する前に腸の組織から削除することができます。 </li></ol>粘膜固有層（LP）フラクション中の細菌の単離9.3 <ol><li>チューブに25ミリリットル滅菌PBSを追加することで、腸の部分から余分なDTT / EDTAをすすぐ。激しく振り、新鮮なチューブに移し、二回繰り返します。 </li><li> 40分間37℃で振とう1 mg / mlのIV型コラゲナーゼおよび40μgの/ mlのDNアーゼIでインキュベートを補ったRP-5から成る消化溶液4mlを含む50ミリリットルチューブに腸の部分を転送します。 </li><li> 4ミリリットル消化溶液を含む新鮮なチューブに未消化の部分を移し、組織片が完全に消化されるまで一度か二度繰り返す。 37で解放されたLPの細胞を含む消化液、それぞれ、℃に保存し</li><li>ペレットに低速（1,200 XG）で細胞をプールした消化液を遠心分離。 descrを上清と細胞ペレットを別々に処理するそれぞれ、細胞外と細胞内細菌を列挙するために、上記のアイベッド。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。ここで説明するすべての実験は、ケンタッキー大学のICAUCの承認を得て実験動物福祉（OLAW）のためのオフィスを遵守して行われた。

近交系マウスは、一日のすべての回で餌に均一に受容されず、汚染されたパンを食べるために彼らの意欲は、両方の歪みタイプとマウス17の年齢によって異なります。我々の経験では、6-9週齢のB6マウスは、一日中いつでも餌を受け入れているが、それは彼らの明暗サイクルの間に提供されていない限り、BALBマウスは一貫して、パンの部分を食べることはありません。暗期は検査室の...

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介感染症を引き起こす通性細胞内細菌の病原体である。細菌が私たちの食糧供給を保護するために使用されるプロセスの多くに耐性があり、乾燥、塩漬け、または冷凍1,2及び感染症などは、一般的に処理するためにリンクされている、消費前に加熱されていない食品を&quot;すぐに食べる&quot; 。いくつか前の流行、L.のソースでリステリア ·汚染された食品が確認された、露出した個人の制限されたグループは密接に3-6をモニターした。これらの例では、そうでない健常者における臨床疾患が軽度、自己制限胃腸炎からより重度の腸と全身感染する必要が入院。L.まで変化新生児や高齢者の両方を含む免疫妥協個人、、におけるリステリア感染症であっても抗生物質治療で、高い死亡率（25〜30％）と関連している<s7,8&gt;まで。リトルはL.のため感染量についてはほとんど知られていないリステリア 、または反復するその小さな動物モデルの不足が主な原因口頭伝達した後、感染症への感受性を支配する宿主因子、感染成果のこの幅広い。 リステリア症の最も広く使用されるモデルは、マウスの静脈内（iv）の接種である。 IVモデルは高い再現性で、感染9,10時に両方ナイーブおよびメモリーT細胞応答を研究するために非常に有用であった。静脈モデルの欠点は、それが完全に感染の腸相をバイパスすることである。食品媒介送信後、腸粘膜はおそらく遅くなり、継続的に末梢組織に広めることができる細菌の数を制限する障壁を提供する。これとは対照的に、全体の接種は静脈内投与から数分以内に脾臓と肝臓で見つけることができ、かつ生物のこの大ボーラスは自然免疫Dを圧倒することがこれらの組織におけるefenses。大用量（10 9〜10 11 CFU）は、典型的には10腸管定着を達成するために必要とされるため、強制経口投与によるマウスの経口感染はあまり一般的に使用される。また、給餌針で胃内（IG）接種は、全身普及に先立って胃腸感染の再現期間を生成しません。いくつかのラボでは、L.ことを報告している他の人が48 HPI 11-15までは全身の広がりを示さなかったリステリアは 、4-12時間感染後（HPI）以内に脾臓や肝臓に達する。このラボツーラボ変動は食道の粘膜に軽度の外傷をもたらすことができた、IG接種の侵襲性の結果である、と細菌の直接血流の侵入を促進する可能性がある。 我々は最近、経口L.の新規マウスモデルを開発しました密接に人間の病気16のすべての段階を模倣リステリアは、感染症。マウスは続きの部分を摂取する際に感染症が発生します食品、非外傷性のある​​プロセスを、アミノ化および実験室の研究者によって専門的なスキルを必要としません。時間の離散時間（36-48時間）については、L.リステリアは再現こうして腸粘膜を越え転位および末梢組織に広めるためにリステリア病原性によって使用されるメカニズムの調査を可能にする、唯一の消化管にコロニーを形成する。重要なのは、モデルが感染に対する宿主生来の抵抗の相違を調査するために使用することができる。以前の研究では、BALB / C / Jマウス/ BYはLの指数レプリケーションでは、食品媒介性リステリア症の影響を非常に受けやすいことが示された腸、脾臓、肝臓、胆嚢16で発生したリステリア 。これとは対照的に、C57BL / 6マウスはL.の唯一の一時的な植民地で、食品媒介感染症に耐性であったこれらの組織の各々に発生したリステリア 。密接に人間の病気を模倣食品媒介モデルの追加の特徴は、自然な普及です脳への感染（5-7 DPI）の後期段階中に発生しました。

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介感染症を引き起こす通性細胞内細菌の病原体である。ほとんど密接に人間の病気を模倣小さな動物モデルの不足によるリステリア症の胃腸の段階についてはほとんど知られていない。本論文では、Lの口頭伝達のための新規なマウスモデルを説明リステリア 。マウス飼育L.は 、このモデルを使用リステリア汚染されたパンは、感受性（BALB / C / J / BY）または耐性（C57BL / 6）マウス系統で全身の広がりの程度を変化させることによって、続いて胃腸感染の離散位相を、持っている。感染の後期段階の間に、胆嚢および脳への普及が観察される。リステリア症の食品媒介性モデルは、非常に再現性がある特殊な技術を必要とせず、細菌の単離および実験マウス系統の多種多様な使用することができる。このように、L.によって使用される病原性戦略の両方を研究するための理想的なモデルであるリステリア </em&gt;の腸の植民地化と同様、侵襲食品媒介性細菌感染に対する宿主応答を促進する。

リステリア菌のコロニーは、37℃で36から48時間のインキュベーション後BHI / L + Gプレート上で表示されますコロニーは、滑らかな、ドーム状のクリーミーな白色の外観（ 図1A）を持っています。成長は腸の細菌叢の大半を阻害したが、それはL.ないいくつかのコロニーを見ることが一般的であるされます著しい希釈（ 図1B）せずに直接、小腸または大腸?...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

本稿で使用して、マウスの経口感染のための新規な方法を説明します<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品。プロトコルは容易に他の食品媒介性病原細菌での使用に適合させることができる。

の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K ビュー.  University of Kentucky. 本稿で使用して、マウスの経口感染のための新規な方法を説明しますリステリア菌汚染された食品。プロトコルは容易に他の食品媒介性病原細菌での使用に適合させることができる。

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

免疫・感染学

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

リステリア菌脳の感染症

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...