Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AI079442 und AI091918) verliehen SEFD unterstützt

1. Herstellung von Selektivagar Medien (BHI / L + G) zu sperren Darmflora <ol><li> Abwiegen 26 g Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g und 5,0 g LiCl Glycin und in einen 1-Liter-Kolben. In 500 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Wärme auf einem Magnetrührer bis der Agar kocht, unter ständigem Rühren. Nehmen Sie die Flasche vor der Hitze, lass die Blasen kurz absetzen, und dann wieder zu einem nochmals aufkochen. </li><li> . Autoklav für 30 min bei 121 ° C unter 16-19 psi auf einer Flüssigkeit Zyklus Hinweis: Lassen Sie den Rührstab in den Kolben. </li><li> Equilibrieren die Medien bis 55 ° C in einem Wasserbad oder lassen bei RT cool. Lassen Sie die Lösung, um kühler als 55 ° C oder Kristalle in den Agar zu bilden. Die Kristalle nicht hemmen L. monocytogenes Wachstum oder beeinflussen die selektiven Eigenschaften der Medien. Allerdings werden die Kristalle im Aussehen ähnlich sein, um kleine Kolonien und machen es schwierig, bakteriellen CFU zählen. </li><li> Vorsichtig mischen dieAgar für 1 min mit einem Magnetrührer. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Gießen Sie das Agar in Petrischalen (~ 25 ml / Platte). Hinweis: Diese Medien nicht unterstützt das Wachstum von allen L. monocytogenes Stämme. Zum Beispiel L. monocytogenes EGDe wächst gut auf diesem Agar, mit sichtbaren Kolonien innerhalb 36-48 Stunden, aber 10403S nicht auf diesem Medium wachsen. </li></ol> 2. Vorbereitung des Inokulums <ol><li> Schneiden Sie Scheiben Weißbrot (Kroger) in kleine (2-3 mm) Würfel mit einer sterilen Schere ora sterilen Skalpell. Verwenden Sie nicht die Krusten. Bewahren Sie einzelne Stücke in Reaktionsgefäße bei -20 ° C bis zu dem Tag der Infektion. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell, klein geschnitten (0,5-1 cm) Stücke von gesalzener Butter (Kroger) und legen jeweils in einem sterilen Reaktionsgefäß. Jedes Röhrchen enthält genügend Butter bis 50 vorbereiten - 60 Stück Brot. Lagerung bei -20 ° C bis zum Gebrauch. </li><li> Wachsen L. monocytogenes in BHI-Bouillon Schütteln bei 30 &amp;deg; C bis die Kultur eine OD 600 von ~ 0,8-1,0 erreicht. Bereiten Sie 500 ul Aliquots in Reaktionsgefäße, wobei darauf zu achten Wirbel die Probe häufig so alle Rohre die gleiche Anzahl von Bakterien enthalten. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Um die bakterielle Aliquots Titer auftauen ein Rohr auf Eis, dann fügen Sie 500 ul bis 9,5 ml BHI-Bouillon. Inkubation für 1,5 Std. Stehen bei 30 ° C. Teller serielle Verdünnungen auf BHI-Agar. Erwarten einen Titer von ca. 1-5 x 10 8 CFU / ml. Hinweis: Wenn homogenen Aliquots hergestellt werden, erwartet jedes der Rohre, um diese Titer zu erhalten, wenn sie in einer ähnlichen Weise mit einer Abweichung von 2 bis 4-fachen hergestellt. </li><li> Um Mäuse infizieren, bereiten ein Aliquot von L. monocytogenes wie in Schritt 2.4 beschrieben. Etwa 20 Minuten vor der L. monocytogenes Kultur ist bereit, tauen Sie die Stücke Brot bei RT. Melt ein Aliquot der Butter auf 55 ° C vorwärmen und ein kleines Volumen von PBS bei 55 ° C Planen genug Brot Stücke, so dass es mindestens eine pro Mausinfiziert und mindestens ein zusätzliches Stück zur Bestimmung des Titers der tatsächlichen Inokulum. </li><li> Basierend auf der vorbestimmten Titer des bakteriellen Aliquot berechnet das Gesamtvolumen des L. monocytogenes Kultur benötigt, um die Inokula für die erforderliche Anzahl von Brot Stücke herzustellen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 14.000 g für 10 min absaugen alle BHI-Bouillon und resuspendieren die Bakterien in einem kleinen Volumen vorgewärmten PBS (2 ul / Stück Brot). </li><li> Vortex die geschmolzene Butter, um Bakterien (mit einem Gesamtvolumen in Höhe von 3 ul / Stück Brot) hinzufügen und gründlich mischen. Hinweis: Versuchen Sie nicht, mehr als 10-15 Stück Brot auf einmal, oder die Butter verfestigen vorzubereiten. </li><li> Arbeiten schnell, Pipette 5 ul der Bakteriensuspension auf einem einzigen Stück Brot in einem Reaktionsgefäß. Die Lösung sollte vollständig vom Brot Stück aufgenommen werden. </li><li> Um die tatsächliche Titer des Inokulums bestimmen, 1 ml steriler PBS auf eine der Brot pieces. Vortex kräftig für 1 min. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte sowohl BHI und BHI / L + G-Agar. </li><li> Alternative Verfahren für hohe Titer (&gt; 10 9 CFU) Inocula. Wenn das bakterielle Pellet zu groß ist, kann es schwierig sein, in einem so kleinen Volumen auszusetzen, und das erhaltene Material ist sehr viskosen, wie eine Paste, und einige der Inokulum kann an den Seiten des Mikrozentrifugenröhrchen haften. In diesem Fall ist es besser, das Brot in einem sterilen 60 mm Kulturschale inokulieren, und die gesamte Schale (ohne Deckel) an der Maus bieten (siehe unten). Überschüssiges Inokulum, die nicht durch das Brot aufgenommen werden dann direkt von der Maus gegessen werden. Im Allgemeinen ist es mehr für die Mäuse, um alle dem Brot essen und lecken die Teller sauber als das Standardprotokoll beschrieben nimmt, so ist dies nur die bevorzugte Methode, wenn es um sehr hohe Titer Inocula. </li></ol> 3. Infektion von Mäusen <ol><li> Kauf weibliche BALB / c / By / J (stock # 0010026) und C57BL/6/J (stock# 000644) von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) und verwenden sie 6-9 Wochen alt sind. </li><li> Schnell die Mäuse einen Tag (24 Stunden) vor der Infektion durch das Entfernen der Lebensmittel und platzieren die Mäuse auf erhöhten (1 Zoll) Draht Bodenbelag (# 3 mesh; Allentown) zu coprophagy verhindern. Lassen Sie nur genug Betten in den Käfig, um Urin zu absorbieren, aber nicht genug, um Schuppen Fäkalien zu erheben. Erlauben Sie unbeschränkten Zugang zu Wasser. </li><li> Infect die Mäuse zu Beginn der Dunkel-Zyklus, die in einem Laminarströmungshaube mit einer roten Glühbirne ausgestattet. Übertragen einer einzigen Mausklick auf eine leere (kein Bettzeug) Käfig. Mit einer sterilen Pinzette, übertragen Sie die kontaminierten Brot Stück auf den Boden des leeren Käfig. Typischerweise wird die Maus abholen das Brot Stück und verbrauchen es vollständig innerhalb 2-10 min. Wenn die Maus nicht essen das Brot sofort, geben Sie den Käfig zu zerbrechen und verlassen Maus ungestört für 20-30 min. Die Mehrheit der Tiere wird das Brot innerhalb dieses Zeitrahmens zu essen, jedoch können die Mäuse ungestört gelassen werden, ohne Zugang zu otihre Nahrung oder Wasser für bis zu 2 Stunden. </li><li> Nach der Infektion der Maus zurück in seine ursprüngliche Käfig und füllt die Mäusefutter. Weiter, um die Mäuse auf erhöhten Draht Bodenbelag für die Dauer des Experiments zu beherbergen. </li></ol> 4. Überwacht den Grad der Bakterien Schuppen in Kot <ol><li> Etiketten-und pre-wiegen Mikrozentrifugengefäße für Sammlung von Kot verwendet werden. </li><li> Arbeiten schnell nach dem Abrufen eines Käfigs von Mäusen, platzieren Sie jede Maus in einem 500 ml Kunststoffbecher. Typischerweise werden die Mäuse 1-4 Hocker Pellets innerhalb von 5 min zu vertreiben. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Pinzette Kot auf entsprechend gekennzeichneten Röhrchen übertragen. </li><li> Wiegen Sie jedes Rohr und berechnet das Gewicht der Fäkalien, indem das Gewicht der leeren Hülse. Typische Gewichte für fäkale Pellets reichen von 10 bis 30 mg. </li><li> In PBS in jedes Röhrchen (200 mg μl/30 Kot) und eine sterile Zahnstocher Maische die fäkalen Pellets. </li><li> Vortex jedes Röhrchen für 30 Sekunden, dann bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf BHI / L+ G Agar. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien und berechnen KBE / mg Kot. </li></ol> 5. Verarbeitung von Infected Darmgewebe <ol><li> Euthanize die Mäuse, aseptisch ernten den Magen und Darm von jeder Maus als ein einzelnes Gewebe und sammeln in leer 100 mm Petrischalen. </li><li> Trennen Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm und in getrennten 60 mm Schalen auf Eis gelagert. Dünndarm kann weiter durch Länge werden in drei gleiche Stücke Annähern der Duodenum, Jejunum, Ileum und um die Entfernung der luminalen Inhalte erleichtern unterteilt. Die Gewebe Drittel kann dann entweder gemeinsam verarbeitet werden (CFU pro ganzen Dünndarm) oder getrennt. Feuchttachentücher mit ~ 0,5 ml sterilem PBS zu halten und zu verhindern, biegsam Tränen während der Handhabung. </li><li> Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit 8 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 25 g Nadel. Mit einer sterilen Pinzette den Squeeze-out der luminalen Inhalt in ein Becherglas Abfall (oder einer sterilen 50-ml-Tube, wenn das Sammeln der luminalen Bakterien). Grippenh 4 ml PBS durch ein Ende des Gewebes, verwenden Sie die Zange den Squeeze-out der Inhalte, und dann drehen Sie das Gewebe über und auf der anderen Seite wiederholen. </li><li> Um die Anzahl der Listerien in der luminalen Inhalte quantifizieren, zentrifugieren Sie die gepoolten spült für 20 min bei 12.000 xg, aussetzen das Pellet in 0,5 - 1,0 ml sterilem Wasser. </li><li> Um die Gesamtzahl der Zell-assoziierten Menge Listeria quantifizieren, öffnen Sie die gewaschenen Gewebe durch Schneiden in Längsrichtung mit sterilem Skalpell, und dann mehrere seitliche Schnitte, um das Gewebe in kleinere Fragmente schneiden. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Darmgewebe nicht um den Homogenisator Klinge wickeln. Übertragen der Darm-Stücke in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2 ml sterilem Wasser. </li><li> Sterilisieren eine Gewebehomogenisator (Fisher PowerGen 1000), indem Sie die Sonde in 70% Ethanol bei 60% Leistung für 30 Sekunden. Warten Ethanol an der Luft trocknen, oder Verfahren in sterilem Wasser für 10 Sekunden. Homogenisieren jedes tiusgabe für 1 min. Wiederholen Sie die Behandlung mit sterilem Wasser zwischen jeder Probe, und verwenden 70% Ethanol zwischen Probe Gruppen. </li><li> Bereiten serielle Verdünnungen jeder Probe in sterilem Wasser und Teller auf BHI / L + G-Agar. </li></ol> 6. Verarbeitung von Infected Mesenteriallymphknoten <ol><li> Ernte Lymphknoten aseptisch, in eine sterile 60 mm-Schale auf Eis, und verwenden sterilen Pinzette, um alle angeschlossenen Fett zu entfernen. Erwarten Sie, um 3-6 Knoten pro Maus zu finden. </li><li> Bereiten Drahtsiebe indem 1,5-2 cm quadratische Stücke aus Edelstahl # 80 mesh. Machen Sie einen kleinen Schnitt in jeder Ecke, und klappen Sie die vier Seiten, die Schaffung eines Hochbeet. Tauchen Sie in 95% Ethanol und dann Flamme zu sterilisieren, und in eine 60 mm Petrischale mit 0,75 ml sterilem Wasser. Nach jedem Gebrauch, können die Bildschirme durch Einweichen in 70% Ethanol für 20 min, Schrubben mit einer Bürste zu eingebetteten Geweben zu entfernen, Kochen für 20-30 min in 2N NaOH und dann ausgiebig mit Wasser spülen recycelt werden. </li><li> Verwenden Sie den Kolbenaus einer sterilen 3 ml Spritze Maische die Knoten durch das Sieb. Achten Sie darauf, drücken Sie auf dem Bildschirm, um den Boden der Schale, damit es Kontakt mit dem Wasser in der Schale macht. </li><li> Pass 0,75 ml sterilem Wasser durch das Sieb und dann und Abpipettieren mehrmals, um den Bildschirm zu spülen. Übertragen Zellsuspension auf eine Mikrozentrifugenröhrchens. </li><li> Vortex jede Probe kräftig für 30 sec die Zellen zu lysieren. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf beiden BHI / L + G-Agar. </li></ol> 7. Verarbeitung von infizierten Milz, Leber, Gallenblase und <ol><li> Fassen Milz mit einer sterilen Pinzette und befreien, indem sie zwei Schnitte, eine an jedem Ende. Platz in einem 15 ml Röhrchen mit 2,5 ml sterilem Wasser. (Hinweis: Gefäße mit rundem Boden kann einfacher sein, mit dem Homogenisator verwendet werden.) </li><li> Suchen Sie die Gallenblase (ein kleiner gelber Flüssigkeit gefüllten Sack an der Leber) und snip vorsichtig mit einer sterilen Schere aus Leber, ohne zu platzen lösen. Transf.er in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem Wasser. </li><li> Aseptisch entfernen Sie die Leber, und achten Sie auf alle Lappen entfernen, und übertragen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2,5 ml sterilem Wasser. </li><li> Homogenisieren Milz und Leber, wie oben für 30 sec auf 60% Leistung beschrieben. Forgall Blasen, sterile Schere zu zerreißen in der Mikrozentrifugenröhrchens und dann kräftig vortexen für 30 Sekunden. </li><li> Bereiten serielle Verdünnungen und Platte jede Probe auf beiden BHI oder BHI / L + G-Agar. </li></ol> 8. Verarbeitung von Infected Brains <ol><li> Ausgehend von der Rückseite der Maus, schneiden die Haut und das Gewebe über dem Hals und über beide Ohren in einem 45 °-Winkel. Verwenden Sie eine sterile Pinzette abziehen des U-förmigen Hautlappen durch Ziehen in Richtung der Nase und setzen den Schädel und Gesichtsknochen. </li><li> Unbeweglichkeitseffekt den Schädel durch Halten des knöchernen Kamm zwischen den Augen mit einer Zange und mit einer Schere flach quer durch den seitlichen Rändern des Schädels machen. Seien SieAchten Sie darauf, nur die Knochen und nicht das Gehirn Gewebe zu schneiden. Dann schneiden die knöcherne Kamm zwischen die Augen. Verwenden Sie eine Zange, um die Oberseite des Schädels zu halten und nach hinten ziehen (Richtung Hals), um das Gehirn freizulegen. </li><li> Heben Sie das Gehirn aus seinem Hohlraum mit einer sterilen Pinzette entnommen und in einen 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml sterilem Wasser. </li><li> Homogenisieren für 20 sec auf 60% Leistung, wie oben beschrieben. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf beiden BHI oder BHI / L + G-Agar. </li></ol> 9. Supplemental Vorgehensweise: Fraktionierung von Darmgewebe 9.1 Isolierung von Bakterien im Schleim Fraction <ol><li> Für jede Darmgewebe vorzubereiten 3 Röhrchen mit 3 ml 6 mM N-Acetylcystein (NAC, Sigma # A-9165). </li><li> Legen Sie die gerötete und längs geschnitten Gewebe in der ersten Röhre für 1-2 min, energisch wirbelnden jede 20-30 sek. Mit einer sterilen Pinzette, abholen das Gewebe und leicht gegen die Seite der Röhre quetschen, um überschüssige liqu entfernenID. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 9.1.2 noch zweimal mit den verbleibenden NAC Rohre. Entfernen Sie das Darmgewebe und beiseite stellen für die weitere Verarbeitung. </li><li> Pool der NAC wäscht (insgesamt 9 ml) und Zentrifuge für 20 min bei 12.000 x g. </li><li> Das Pellet in sterilem Wasser, Wirbel für 30 sec, bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf BHI / L + G. </li></ol> 9.2 Isolierung von Bakterien in den Epithelzellen (EG) Fraction <ol><li> Schneiden Sie die einzelnen Gewebe in kleine Stücke mit einer sterilen Schere und in einem 50 ml Röhrchen mit 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) mit 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA und 1 mM DTT ergänzt. Inkubieren unter Schütteln bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Übertragen Sie die Darm-Stücke in ein frisches Röhrchen mit 5 ml RP5/EDTA/DTT und Inkubation unter Schütteln bei 37 ° C für 20 min. Speichern Sie die Medien aus dem ersten Rohr und beiseite stellen bei 37 ° C Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal mehr für insgesamt drei 20 min Inkubation in RP5/EDTA/DTT. Wenn Sie mit dem Lamina propria isonung Schritt, übertragen Sie die verbleibenden Darm-Stücke in den leeren 50-ml-Tube. </li><li> Kombinieren Sie die drei RP5/EDTA/DTT Wäschen (Gesamtvolumen 15 ml) und Zentrifuge bei niedriger Geschwindigkeit (1.200 xg) zur Pelletierung der Zellen. </li><li> Um extrazellulären Bakterien zu quantifizieren, den Überstand und Zentrifuge für 20 min bei 12.000 x g. Das Pellet in 0,5 - 1,0 ml steriles Wasser und Platte serielle Verdünnungen auf BHI / L + G-Agar. </li><li> Um intrazelluläre Bakterien aufzuzählen, suspendieren die EG-Pellet in 5 ml RP-5 mit 25 ug / ml Gentamicin. Inkubieren Sie die einzigen Zellsuspension für 30 min bei 37 ° C plus 7% CO 2 zu töten alle verbleibenden extrazellulären L. monocytogenes. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, aussetzen in 0,5 ml sterilem Wasser und Vortex für 30 Sekunden, um die Zellen zu lysieren. Bereiten serielle Verdünnungen in Wasser und Teller auf BHI / L + G. Hinweis: Die Zellen in dieser Phase gesammelt werden auch Zellen aus dem zugrunde liegenden Peyer-Patches. Falls gewünscht, ist die sichtbare PeyerPatches können vom Darmgewebe entfernt werden, bevor Spülen und Schneiden in Längsrichtung. </li></ol> 9.3 Isolierung von Bakterien in der Lamina propria (LP) Fraction <ol><li> Spülen Sie die überschüssige DTT / EDTA von den Darm Stücke durch Zugabe von 25 ml sterilem PBS auf das Rohr. Kräftig schütteln, in ein frisches Röhrchen übertragen und zweimal wiederholen. </li><li> Übertragen der Darm-Stücke in ein 50 ml Röhrchen mit 4 ml Aufschlusslösung aus RP-5 mit 1 mg / ml Kollagenase Typ IV und 40 ug / ml DNase I inkubieren ergänzt Schütteln bei 37 ° C für 40 min. </li><li> Übertragen Sie die unverdaute Stücke in ein frisches Röhrchen mit 4 ml Lösung Verdauung und wiederhole noch einmal oder zweimal, bis die Gewebestücke vollständig verdaut werden. Speichern jeder der Verdauung Lösungen, die befreit LP Zellen enthalten, bei 37 ° C </li><li> Zentrifugieren Sie die gepoolten Aufschlusslösungen bei niedriger Geschwindigkeit (1.200 xg) zur Pelletierung der Zellen. Verarbeiten Sie den Überstand und Zellpellet getrennt als descroben, um extra-und intrazellulären Bakterien aufzuzählen bzw. ibed. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Amt für Laboratory Animal Welfare (olaw) mit Zustimmung des ICAUC an der University of Kentucky durchgeführt.

Inzuchtmäuse nicht gleichmäßig empfänglich für Fütterung zu allen Zeiten des Tages, und ihre Bereitschaft, das kontaminierte Brot essen wird sowohl auf dem Stamm Art und dem Alter der Mäuse 17 abhängen. Nach unserer Erfahrung sind 6-9 Wochen alten B6 Mäuse empfänglich für Fütterung zu jeder Zeit des Tages, aber BALB Mäusen nicht konsequent von dem Brot essen Stück, wenn es während der Dunkel-Zyklus angeboten wird. Die Licht-Zyklus des Raumes verwendet werden, um die Tiere aufnehmen kann geände...

Listeria monocytogenes sind fakultativ intrazelluläre bakterielle Erreger, die durch Lebensmittel übertragenen Infektionen beim Menschen verursachen. Die Bakterien sind resistent gegen viele der Prozesse verwendet werden, um unsere Versorgung mit Lebensmitteln, wie z. B. dem Austrocknen zu schützen, Salzen oder Kälte 1,2 und Infektionen sind in der Regel zu verarbeiten, &quot;ready-to-eat&quot; Lebensmittel, die nicht erhitzt werden vor dem Verzehr verbunden . In mehreren früheren Ausbrüchen, die Quelle der L. monocytogenes-kontaminierte Lebensmittel identifiziert wurde, und die eingeschränkte Gruppe von exponierten Personen war eng 3-6 überwacht. In diesen Beispielen klinischen Erkrankung bei ansonsten gesunden Personen von einem milden, selbst limitierende Gastroenteritis zu schweren Darm-und systemische Infektionen, die eine stationäre Aufnahme. L. variiert monocytogenes Infektionen bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem, einschließlich der beiden Neugeborenen und älteren Menschen haben mit einer hohen Sterblichkeit (25-30%) in Verbindung gebracht, auch mit einer Antibiotika-Behandlung <sbis&gt; 7,8. Wenig ist über die infektiöse Dosis für L. bekannt monocytogenes, oder die Host-Faktoren, die die Anfälligkeit für Infektionen regieren nach mündlicher Überlieferung, vor allem wegen des Mangels an einem kleinen Tiermodell, dass rekapituliert diese breite Palette der Infektion Ergebnisse. Die am weitesten verbreitete Modell Listeriose intravenöse (iv) Impfung von Mäusen. Die iv-Modell ist in hohem Maße reproduzierbar, und war äußerst nützlich für die Untersuchung sowohl naive und Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen während der Infektion 9,10. Der Nachteil der iv Modells ist, dass es vollständig umgeht die intestinale Phase der Infektion. Nach lebensmittelbedingten Übertragung stellt die Darmschleimhaut eine Barriere, die vermutlich verlangsamt und begrenzt die Anzahl der Bakterien, die kontinuierlich zu peripheren Geweben zu verbreiten. Im Gegensatz dazu kann der gesamte Impfstoff in der Milz und der Leber innerhalb weniger Minuten von iv-Gabe gefunden werden, und diese große Bolus von Organismen können angeborene Immunsystem überwältigen defenses in diesen Geweben. Oral Infektion von Mäusen über eine Sonde weniger häufig verwendet, weil hohe Dosen (10 9 -10 11 CFU) sind in der Regel erforderlich, um zu erreichen Darmbesiedlung 10. Auch dann, wenn intragastrischen (ig) Impfung mit einer Nadel Fütterung nicht zu einer reproduzierbaren Zeitraum von Magen-Darm-Infektion vor der systemischen Ausbreitung. Einige Labors haben berichtet, dass L. monocytogenes erreichen die Milz und Leber innerhalb 4-12 Stunden nach der Infektion (hpi), während andere zeigten keine systemische Ausbreitung bis zu 48 hpi 11-15. Dieses Labor zu Labor Variation kann eine Folge der invasiven Art der Impfung ig sein, das kann in kleinere Verletzungen der Schleimhaut der Speiseröhre führen und den direkten Blutbahn Invasion der Bakterien. Wir haben vor kurzem eine neuartige Maus-Modell der oralen L. monocytogenes Infektion, imitiert alle Phasen der Krankheit beim Menschen 16. Infektion tritt auf, wenn die Mäuse aufnehmen Stücke contaminiertes Essen, ein Prozess, der nicht-traumatische ist, und erfordert keine speziellen Fähigkeiten durch Labor Ermittler. Für einen diskreten Zeitraum (36-48 Std.), L. monocytogenes reproduzierbar nur besiedeln den Magen-Darm-Trakt, so dass die Untersuchung der Mechanismen, durch pathogene Listeria verwendet, um über die Darmschleimhaut transloziert und verbreiten peripheren Geweben. Wichtig ist, dass das Modell verwendet werden, um Unterschiede in der Host angeborene Resistenz gegen die Infektion zu untersuchen. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass BALB / c / von / J Mäuse sehr anfällig für Lebensmittelvergiftungen Listeriose waren, mit exponentiellen Vermehrung von L. monocytogenes vorkommenden im Darm, Milz, Leber und Gallenblase 16. Im Gegensatz dazu wurden C57BL / 6 Mäuse gegen durch Lebensmittel übertragenen Infektion mit nur transient Kolonisierung L. monocytogenes vorkommenden in jedem dieser Gewebe. Ein zusätzliches Merkmal der durch Lebensmittel übertragenen Modell, das imitiert menschliche Krankheit ist, dass natürliche Verbreitungauf das Gehirn aufgetreten während der späteren Stadien der Infektion (5-7 dpi).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes sind fakultativ intrazelluläre bakterielle Erreger, die durch Lebensmittel übertragenen Infektionen beim Menschen verursachen. Sehr wenig ist über den Magen-Phase der Listeriose aufgrund des Fehlens von einem kleinen Tier-Modell, das imitiert menschliche Krankheit bekannt. Dieses Papier beschreibt eine neue Maus-Modell für die orale Übertragung von L. monocytogenes. Mit diesem Modell, Mäusen, L. monocytogenes-kontaminierte Brot haben eine diskrete Phase des Magen-Darm-Infektion, durch unterschiedliche Grade der systemischen Ausbreitung bei empfindlichen (BALB / c / von / J) oder resistent (C57BL / 6) Mäusestämmen gefolgt. In den späteren Stadien der Infektion, ist die Verbreitung auf der Gallenblase und des Gehirns beobachtet. Die Lebensmittel übertragenen Modell der Listeriose ist in hohem Maße reproduzierbar, erfordert keine speziellen Fähigkeiten, und kann mit einer Vielzahl von bakteriellen Isolaten und Labormaus-Stämmen verwendet werden. Als solches ist es das ideale Modell, um beide Strategien Virulenz von L. verwendet studieren monocytogenes </em&gt; Darmbesiedlung sowie den Host-Reaktion auf invasive Essen getragen bakterielle Infektion fördern.

L. monocytogenes Kolonien sichtbar sein wird auf BHI / L + G Platten nach 36-48 h Inkubation bei 37 ° C. Die Kolonien haben eine glatte, kuppelförmige cremig weißes Aussehen (Abbildung 1A). Das Wachstum wird für die Mehrheit der Darmflora verhindert werden, aber es ist üblich, einige Kolonien, die nicht L. sehen monocytogenes, besonders beim Plattieren Dünndarm oder Dickdarm direkt ohne wesentliche Verdünnung (1B). Suspect Kolonien können durch Plattie...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren für die orale Infektion von Mäusen mit<em&gt; Listeria monocytogenes</emEssen&gt;-verseucht. Das Protokoll kann ohne weiteres zur Verwendung mit anderen Lebensmittel übertragenen bakteriellen Krankheitserreger anzupassen.

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K Aufrufe.  University of Kentucky. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren für die orale Infektion von Mäusen mit Listeria monocytogenes-verseucht. Das Protokoll kann ohne weiteres zur Verwendung mit anderen Lebensmittel übertragenen bakteriellen Krankheitserreger anzupassen.

Serie: Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...