Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénie bactérienne sur la question de savoir si les bactéries d’origine sanguine peuvent traverser la barrière céphalo-cérébrale pour infecter le système nerveux central et le cerveau. Avec cette technique, les nombres bactériens dans le sang et le tissu cérébral des animaux infectés peuvent être déterminés tout en excluant le nombre de bactéries résidant dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Pallab Ghosh, un associé de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure.
À 72 heures après l’infection, réglez un système de perfusion automatisé à un débit de quatre millilitres de PBS complété par 10 millimolaire d’EDTA par minute. Et placez l’animal euthanasié dans la position supine dans une casserole de dissection. Confirmer l’euthanasie par un manque de réponse au pincement des pattes.
Et mouiller l’abdomen avec 75% d’éthanol. Utilisez des ciseaux pour faire une incision de la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique pour exposer le diaphragme et les organes viscéraux. Et couper le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.
Couper la cage à frottement bilatéralement pour exposer le ventricule gauche et utiliser des forceps pour saisir doucement le cœur. Insérez une aiguille papillon de calibre 21 reliée au système de perfusion dans le ventricule gauche et coupez soigneusement l’oreillette droite pour recueillir environ 200 microlitres de sang dans un tube de deux millilitres contenant 10 millimolaires EDTA pour empêcher la coagulation. Puis infuser l’animal pendant quatre minutes avec 15 à 20 millilitres de PBS plus EDTA.
Après perfusion complète, le cerveau et le foie apparaîtront blanchis en s’assurant que les bactéries restantes proviennent des organes récoltés et non du sang circulant. Après perfusion, transférez soigneusement les organes d’intérêt dans des tubes coniques stériles de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS stérile de quatre degrés Celsius par tube. Pour récolter le cerveau après la décapitation, utilisez des ciseaux pour couper la peau du cuir chevelu vers le bas de la ligne médiane entre les yeux, en gardant les pointes pressées contre le crâne pour couper tout excès de tissu si nécessaire.
Insérez doucement une pointe des ciseaux dans le magnum foramen et coupez latéralement dans le crâne des deux côtés. Couper soigneusement le crâne entre les yeux vers le bas de la ligne médiane dans le crâne, en prenant soin d’appliquer une pression latérale et d’éviter la perturbation du cerveau. À l’aide de forceps, ouvrez le crâne pour exposer le cerveau et placez une spatule entre la face inférieure du cerveau et la base du crâne pour transférer soigneusement le cerveau dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de quatre degrés Celsius PBS.
Dans un coffret de biosécurité, insérez la pointe et exécutez un homogénéisateur de tissu pendant 10 secondes dans l’eau de Javel séquentielle de 5%, l’eau stérile, 75% d’éthanol, et les solutions stériles d’eau dans les tubes coniques séparés de 15 millilitres. Lorsque la pointe a été complètement stérilisée, homogénéiser le cerveau infecté dans son tube. Lorsqu’il ne reste pas de fragments de tissus visibles, restérilisez la pointe pour empêcher le report bactérien à l’échantillon d’organe suivant et homogénéisez l’organe suivant.
Lorsque tous les organes ont été homogénéisés, préparer 10 fois les dilutions périodiques de chaque organe homogénéisé dans PBS stérile et plaquer les dilutions sur les plaques d’agar infusion cerveau-coeur. Puis incuber les cultures homogénées de dilution à 37 degrés Celsius pendant la nuit et compter le nombre de colonies sur chaque plaque pour déterminer le nombre total de bactéries par organe ou millilitre de sang. Le calcul des charges bactériennes dans les organes de souris infectés par L.monocytogenes comme il vient de le démontrer suggère que la perfusion post-infection ne modifie pas significativement la charge bactérienne dans le sang ou les organes des souris infectées qui ont été examinés dans cette étude représentative.
À la suite de cette procédure, les organes infectés par Listeria monocytogenes peuvent être traités pour une analyse supplémentaire, comme le traitement histopathologique, afin de répondre à d’autres questions sur l’infiltration de cellules inflammatoires dans les organes de souris infectés par rapport aux animaux de contrôle non infectés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la perturbation du cerveau et de maintenir un contact minimal entre les ciseaux et le tissu cérébral.
