Le protocole suivant décrit le développement de réseaux de cardiomyocytes pluripotents induits par l’homme dérivés de cellules souches sur des plaques mea multiwell pour électroporer réversiblement les membranes cellulaires pour des mesures potentielles d’action. Les paramètres potentiels d’action peuvent ensuite être utilisés pour générer ces courbes de réponse pour tester les composés pour l’électrophysiologie. Le codage multiwell MEA et le placage cellulaire sont les étapes les plus difficiles qui ont besoin d’une attention particulière.
Il faut effectuer ces étapes avec diligence et rapidité pour éviter que les gouttelettes ne se propagent et se dessèchent. Avec la pratique, cela peut être facilement surmonté. Nous avons développé une interface utilisateur graphique personnalisée pour la segmentation unique, l’assurance de la qualité et l’extraction des paramètres.
Notre flux de travail MATLAB robuste a été mis en œuvre pour réduire rapidement de grands volumes de données expérimentales brutes en un regroupement impartial de formes d’ondes potentielles d’action. Commencez par décongeler les cardiomyocytes pluripotents pluripotents d’origine humaine selon les directives manuscrites. Suspendre délicatement les cellules à l’aide d’une pipette de transfert pour dissocier les touffes cellulaires.
Ensuite, distribuez soigneusement deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de six puits recouverte de substrat et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les cellules doivent adhérer aux tractus de gel par 24 heures et battre spontanément à 48 heures après placage. Deux jours avant le placage ajouter 0,5 millilitre de milieu de culture cardiomyocyte iPSC humain à chaque puits d’un tableau de 24 puits multi-électrodes, ou plaque MEA, et effectuer un enregistrement de base pour vérifier le rapport signal-bruit comme un contrôle de qualité des MEA.
Ensuite, aspirez le média, rincez les puits à l’eau stérile et stérilisez sous une lumière UV dans un capot d’écoulement laminaire pendant la nuit. Le lendemain, ajouter 0,1 millilitre de FBS à chaque puits pour le traitement hydrophile des surfaces MEA et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez le FBS, et rincez chaque puits deux fois avec 0,5 millilitres d’eau stérile.
Laissez sécher la plaque dans le capot d’écoulement laminaire pendant la nuit. Le lendemain, pipette cinq microlitres de dilution de fibronectine de travail et distribuent soigneusement la gouttelette au centre de chaque puits pour couvrir les 12 électrodes. Placez immédiatement la plaque sur une surface surélevée à l’intérieur d’une chambre humidifiante contenant suffisamment d’eau stérile pour couvrir toute la surface du plat.
Placez la chambre avec la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures, puis procéder au placage cellulaire. Lorsqu’ils sont prêts à plaquer les cardiomyocytes, ajustez la densité cellulaire à 6000 cellules par microlitre en les diluant dans le milieu de décongélation des cardiomyocytes iPSC humain. Utilisez le scintillement doux pour empêcher les cellules de sédimenter.
Apportez la plaque MEA dans le capot d’écoulement laminaire et retirez soigneusement la goutte de fibronectine avec une pipette P10 sans toucher les électrodes. Distribuez immédiatement une gouttelette de cellules de cinq microlitres au centre du puits en s’assurant de couvrir les 12 électrodes. Faites-le bien à la fois pour empêcher la fibronectine de sécher.
Une fois le placage terminé, remettre la plaque MEA dans la chambre humidifiante lâchement couverte et la retourner à l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Après l’incubation, utiliser une pipette P200 pour ajouter soigneusement 200 microlitres de cardiomyocytes humains iPSC décongelant moyen à chaque puits sans déranger les cellules. Remettre la plaque MEA dans l’incubateur de culture cellulaire et remplacer le milieu de culture 24 heures après le placage.
Lorsqu’il est prêt à acquérir le signal des cardiomyocytes, lancez le logiciel d’acquisition et insérez la plaque MEA selon les instructions manuscrites. Cliquez sur le bouton Explorer pour visualiser le signal dans tous les puits et vérifier la qualité du signal dans des conditions d’état stable. Prenez des notes sur les électrodes à potentiel de champ, ou FP, signaux dans la gamme millivolt.
Cliquez ensuite sur le même bouton pour arrêter l’exploration. Aucune donnée n’a été enregistrée jusqu’à présent. Cliquez sur le bouton Go pour commencer à enregistrer.
Les électrodes de chaque puits montreront des signaux FP dans la fenêtre de données brutes. Après 30 secondes d’enregistrement, cliquez sur le bouton Stimuler et autorisez l’électroporation sur les sites sélectionnés pendant 30 secondes. Cliquez ensuite sur le même bouton pour arrêter la simulation et continuer à enregistrer pendant 60 secondes.
Utilisez le logiciel personnalisé basé sur MATLAB pour segmenter et extraire divers paramètres de données potentiels sur le terrain et d’action. Tout d’abord, exécutez le code d’analyse de forme d’onde et cliquez sur Fichier et sélectionnez Process.h5. Trouvez et sélectionnez le mwd précédemment créé.
fichier h5. Cliquez sur le bouton Enregistrer l’annuaire pour modifier l’emplacement de stockage des fichiers de sortie. Créez ensuite une file d’attente de traitement de signal en sélectionnant l’électrode et les combinaisons de puits d’intérêt, puis en cliquant sur le bouton Queue.
Répétez cette étape pour ajouter plus d’électrode et de combinaisons de puits à la file d’attente. Si les cellules ont été traitées avec des médicaments, la file d’attente peut être modifiée en cliquant directement sur Med Name, Med Concentration. Une fois la file d’attente finalisée, cliquez sur le bouton Initialize Waveforms, qui démarre le traitement préliminaire où les signaux sont identifiés et extraits pour segmentation.
Lorsque le traitement est terminé, cliquez sur le bouton Zoom In et sélectionnez le potentiel d’action, ou AP, zone d’intérêt. Cliquez sur le bouton Keep et passez en revue les panneaux. Les pics et les creux sont détectés pour chaque forme d’onde, et les AP normalisés sont superposés.
Une fois terminé, cliquez sur le bouton Keep pour passer à la trace suivante dans la file d’attente, et répétez le processus pour le reste de l’électrode et les signaux de combinaison de puits. La viabilité et la densité de placage des cardiomyocytes post-décongelés sont essentielles pour la culture mea multiwell. Le placage approprié a comme conséquence une culture saine de monolayer avec le battement spontané à 48 heures, alors que la viabilité pauvre de cellules a comme conséquence des cultures avec un pourcentage élevé des populations non-myocytes.
La dispersion des gouttelettes cellulaires affecte la densité de la culture et peut même entraîner la mort cellulaire, de sorte que le placement précis des cellules est important. Les cellules cultivés sur les MEA sont soumises à un contrôle de qualité de l’activité électrique 48 heures après le placage. Si 50% des électrodes d’un réseau et 70% du total des réseaux ne produisent pas de signaux FP, alors la culture est sous-optimale.
Les enregistrements AP 20porations médiatisés peuvent être obtenus plusieurs fois 48 heures après le placage MEA. Les électroporations multiples du même site cellulaire à zéro, 24, 48, 72 et 96 heures n’ont aucun effet significatif sur la forme ap au fil du temps. En outre, aucune corrélation entre fp et amplitudes ap post-électroporation du même site cellulaire n’a été observée.
Un avantage significatif de cette méthode est que la plaque MEA multiwell peut être réutilisée plusieurs fois. Pour démontrer la fiabilité de ce tableau, 3 815 formes d’ondes AP sont tirées de trois lots de restauration, et des données de durée AP sont extraites pour examiner la répétabilité des résultats. En cas d’intérêt, il est possible d’effectuer des analyses supplémentaires, telles que l’expression des gènes, les mesures transitoires du calcium et la pince à timbres pour étudier le comportement de courants ioniques spécifiques.
Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour améliorer la maturation électrophysiologique ainsi que pour examiner les effets chroniques de la dose sur les cardiomyocytes.
