XHP a été soutenue par le National Institute of Health (NIH) des subventions de l&#39;Institut national sur le vieillissement (NIHK01AG024496) et The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain (NIHR21HD056530).

1. Solution et les médias Préparation <ol><li> Solution d&#39;enrobage gélatine: 0,1% (p / v) de gélatine dans ddH 2 O, à l&#39;autoclave et conserver à 4 ° C. </li><li> Matrigel solutions de revêtement. Solution mère: le dégel lent Matrigel (10 ml) à 4 ° C pendant la nuit, ajoutez 10 ml glacée DMEM ou DMEM/F12, bien mélanger et aliquote de 1 ml / tube sous le capot de culture de tissus stérilisés, conserver à -20 ° C. Solution de travail: le dégel lent aliquote de 1 ml de Matrigel à 4 ° C pendant 1-2 heures, transfert à 14 ml refroidi DMEM ou DMEM/F12 et bien mélanger sous le capot de culture de tissus stérilisés immédiatement avant revêtement. </li><li> Homme solution d&#39;enrobage laminine: diluer 1 ml de solution humaine laminine (0,5 mg / ml en tampon Tris NaCl, stocker à -80 ° C, laisser décongeler lentement à 4 ° C pendant 1-2 heures) avec glacée DMEM ou d&#39;DMEM/F12 12,5 ml de solution de travail (40 pg / ml) sous le capot de culture de tissus stérilisés immédiatement avant revêtement. </li><li> Des solutions de facteur de croissance des stocks (500-1000X): dissoudre facteur de croissance à 10 ug/ Ml dans un tampon stérile (0,5% de BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycérol, 1XPBS) et stocker que 50-100 ul / tube aliquotes à -80 ° C. </li><li> Les médias HESC: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), du sérum de remplacement KO (20%), la L-alanyl-L-Gln-Gln ou L (2 mM), MEM acides aminés non essentiels (MNAA, 1X), et β-mercaptoéthanol (100 uM), filtrée et conserver à 4 ° C, additionné de 20 ng / ml de bFGF avant utilisation. Ou en remplaçant &quot;KO du sérum de remplacement» avec des composants définis: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), la L-alanyl-L-Gln-Gln ou L (2 mM), MNAA (1X), MEM acides aminés essentiels (MEAA , 1X) et β-mercaptoéthanol (100 uM), filtrée et conserver à 4 ° C, complété par le bFGF (20 ng / ml), l&#39;insuline humaine (20 pg / ml), acide ascorbique (50 pg / ml), humaines activine A (50 ng / ml), de l&#39;albumine humaine / Albumax (10 mg / ml), et de la transferrine humaine (8 pg / ml) avant utilisation. </li><li> Les médias HESC différenciation cardiaque: DMEM/F12 (90%), FBS définie (10%), et L-alanyl-L-Gln-Gln ou L (2 mM). </li><li> Nicotinamide médias contenant (NAM): ajouter NAM pour les médias ou les médias HESC HESC différenciation cardiaque à la concentration finale de 10 mM, filtré, conserver à 4 ° C et utiliser dans les 2 semaines de préparation. </li></ol> 2. Revêtement Plate <ol><li> Manteau avec plaques de gélatine: ajouter 2,5 ml / puits de solution de gélatine à 6 plaques à puits et incuber une nuit dans un 37 ° C incubateur humidifié. </li><li> Manteau plaques de laminine: chill plaques enduites de gélatine et de supprimer la gélatine, ajouter 2,5 ml / puits Matrigel ou humains solution d&#39;enrobage laminine travail de pré-réfrigérée gélatinisé plaques 6 puits et incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol> 3. Le repiquage et l&#39;ensemencement CSEh indifférenciées dans des conditions définies <ol><li> Autoriser les colonies CSEh poussent à 5-7 jours anciens, et de prendre des plaques de culture des CSEh au microscope à dissection (préchauffer disséquer étape à 37 ° C) sous le capot dissection stérilisés. </li><li> Sélectionnez les colonies de CSEh à fractionner. Morphologiquement, ces colonies doivent avoir&gt; 75% CSEh indifférenciées (smtoutes les cellules compactes), habituellement légèrement opaque (pas blanc-empilées les cellules, pas clairement différenciées des cellules) avec bord définie sous le microscope à dissection. Soigneusement décrire les colonies sélectionnées et enlever la couche de fibroblastes différenciés qui entourent la colonie et toutes les parties différenciées (le cas échéant) de la colonie avec le bord de la P2 pointe de pipette stérile ou tiré capillaire en verre. </li><li> Retirez le vieux médias contenant flottante détachée des cellules différenciées en aspirant. Laver avec les médias de CSEh (sans bFGF) une fois. Ajouter 3 ml / media CSEh bien frais contenant 20 ng / ml de bFGF. </li><li> Couper les colonies CSEh indifférenciées en petits morceaux, et détacher avec la pointe de pipette stérile ou en verre tiré capillaire. </li><li> Piscine les médias contenant des pièces détachées colonie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Laver la plaque une fois avec 1 ml / media CSEh puits contenant 20 ng / ml de bFGF et mettre en commun. </li><li> Aspirer le Matrigel ou humains solution de laminine à partir des plaques revêtues frais. Aliquoter 4 ml / h etESC média contenant des morceaux colonie à une plaque à 6 puits. Délicatement le transfert de la plaque de l&#39;incubateur sans secouer et permettre la colonie plantons nuit sans déranger dans un incubateur humidifié 37 ° C avec une atmosphère de 5% de CO 2. </li></ol> 4. Induction cardiaque des CSEh sous Système de culture définis avec nicotinamide <ol><li> Au jour 3 après le semis, enlever la plupart des vieux médias de chaque puits de la plaque et laisser les médias suffisamment pour permettre des colonies de CSEh à être submergée (CSEh jamais permettre à sécher). Remplacez-le par 4 ml / media CSEh bien frais contenant 20 ng / ml de bFGF et 10 mM nicotinamide (NAM). </li><li> Remplacer les vieux médias avec les médias CSEh frais contenant 20 ng / ml de bFGF et 10 mM NAM tous les autres jours, et permettre colonies CSEh cardiaques induits par pousser à 8-10 jours. Sur exposant à NAM, toutes les cellules à l&#39;intérieur de la colonie va subir des modifications morphologiques de grands cellules différenciées qui continueront à se multiplier. Les colonies va augmenter en taille, et de 8-10 jours, unecellules d vont commencer à s&#39;accumuler dans certaines zones des colonies. </li></ol> 5. Poursuivant différenciation cardiaque en culture en suspension <ol><li> Prenez la plaque de culture des CSEh à disséquer au microscope (préchauffer disséquer étape à 37 ° C) sous le capot dissection stérilisés. Soigneusement aperçu des colonies et de supprimer la couche de fibroblastes entourant la colonie (les cellules différenciées ont émigré hors de la colonie) avec le bord de la pointe de la pipette stérile ou P2 tiré capillaire en verre. </li><li> Retirez le vieux médias contenant des cellules de fibroblastes flottante détachée par aspiration. Laver avec les médias de CSEh (sans bFGF) une fois. Ajouter 3 ml / media CSEh bien frais (sans bFGF). </li><li> Couper les colonies CSEh cardiaques induits en petits morceaux, et détacher avec la pointe de pipette stérile ou en verre tiré capillaire. </li><li> Piscine les médias contenant des pièces détachées colonie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Laver la plaque une fois avec 1 ml / media CSEh bien (sans bFGF) et la piscine ensemble. </li><li> Aliquoter 4 ml / media ainsi CSEh sans sérum contenant des morceaux colonie à une plaque à 6 puits ultra attachement et incuber dans un 37 ° C incubateur humidifié pour permettre aux grappes flottantes cellulaire (cardioblasts) pour former pendant 4-5 jours. </li></ol> 6. Battre maturation phénotype des cardiomyocytes dans la culture adhésif <ol><li> Piscine le support contenant cardioblasts flottante ensemble dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger à 1400 rpm pendant 5 min. Aspirer le vieux médias autant que vous le pouvez et ajouter la même quantité de supports CSEh nouvelle différenciation cardiaque contenant 10 mM de NAM. </li><li> Pipeter haut et en bas pour mélanger cardioblasts flottants et aliquote de 4 ml / puits de plaques 6 puits. Transférer les plaques à un 37 ° C incubateur humidifié pour permettre d&#39;attacher cardioblasts nuit. </li><li> Remplacer les médias CSEh différenciation cardiaque contenant 10 mM NAM tous les autres jours. </li><li> Au jour 8, remplacer par les médias CSEh différenciation cardiaque sans NAM, et de continuer à remplacer les CSEh cardiaques de différenciation des médias électroniquesjournée très autre. Battre les cardiomyocytes ne commencent à apparaître dans environ 1-2 semaines de culture continue après le retrait du MNA et d&#39;augmenter en nombre avec le temps, et pourrait conserver de fortes contractions et rythmique de plus de 3 mois. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Nicotinamide (NAM) est rendue suffisante pour induire CSEh maintenu dans le système de culture définies à la transition de la pluripotence exclusivement à un phénotype cardiomesodermal (figure 2B). Lors de l&#39;exposition des CSEh indifférenciées au MNA, toutes les cellules à l&#39;intérieur de la colonie va subir des modifications morphologiques de grandes cellules différenciées qui régulent à la baisse l&#39;expression de Oct-4 et commencent à exprimer le facteur de transcription cardiaques spécifiques (CSX) et α-Nkx2.5 actinine, compatible avec un phénotype cardiomesoderm (figure 2B). Ces cellules différenciées continueront à se multiplier et les colonies augmentation de la taille. Augmentation de l&#39;intensité sera Nkx2.5généralement être observée dans les zones des colonies où les cellules commencent à s&#39;accumuler (figure 2B). Après détaché, l&#39;CSEh NAM-forme flottante sera traitée amas cellulaires (cardioblasts) dans une culture en suspension de poursuivre le processus de différenciation cardiaque. Après avoir laissé l&#39;cardioblasts d&#39;attacher et de continuer à traiter avec NAM pour 1 semaine, les cardiomyocytes se battre commencent à apparaître dans environ 1-2 semaines de culture continue après le retrait du Mouvement avec une augmentation drastique de l&#39;efficacité par rapport aux lignées multiples spontanées différenciation des CSEh sans traitement au cours de la même période (figure 2C). Les cellules au sein des clusters battre cardiomyocytes sera expriment des marqueurs caractéristiques des cardiomyocytes, y compris Nkx2.5 et α-actinine (figure 2C). Les contractions des cardiomyocytes battre ont été confirmés par des profils électriques d&#39;être fort, rythmé, bien coordonnés, et bien entraînées, avec des impulsions régulières rappelant les p-QRS-T-complexes vu des électrodes de surface du corps dans les électrocardiogrammes clinique (Fig. 2C, aussi voir la vidéo). Les cardiomyocytes pouvaient conserver leur contractilité forte de plus de 3 mois. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figure 1. Schémas générale de l&#39;approche conventionnelle par rapport démarche de petites molécules d&#39;induction de la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines vers des cellules spécialisées fonctionnelles. (A) un schéma de l&#39;approche classique à l&#39;aide de lignées multiples inclinaison de cellules souches pluripotentes humaines à travers la différenciation de germe de la couche spontanée. (B) Un schéma de bien contrôlée par induction efficace de cellules souches pluripotentes humaines exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinente par simple mise à disposition de petites molécules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figure 2. Nicotinamide induit spécifications lignage cardiaque directe de la pluripotence dans des conditions définies et la progression vers battre cardiomyocytes. (A) Schéma illustrant de la ligne de temps protocole de différenciation cardiaque des CSEh dirigé. (B) Lors de l&#39;exposition des CSEh indifférenciées à la nicotinamide (NAM) en vertu du système de culture définis, différenciés grande Oct-4 (rouge) des cellules négatives au sein de la colonie a commencé à émerger, par rapport à la maquette traités (DMSO) CSEh que le contrôle. NAM-induite des cellules Oct-4-négatives ont commencé à exprimer Nkx2.5 (vert) et α-actinine (rouge), compatible avec une différenciation cardiaque précoce. L&#39;intensité progressivement augmenté de Nkx2.5 a été généralement observée dans les régions de la colonie où les cellules commencent à s&#39;entasser. Toutes les cellules sont indiquées par coloration DAPI de leurs noyaux (bleu). (C) NAM induite cardiaque commis CSEh donné cardiomyocytes battant avec une augmentation drastique de l&#39;efficacité, évaluée par les cellulaires clusTER qui affiche des contractions rythmiques (voir profil électrophysiologique et les vidéos), et pour les immunopositives Nkx2.5 (vert) et α-actinine (rouge). Des images de phase de représentant de grandes grappes cardiomyocytes coups et des images de puissance plus élevé de contracter les muscles cardiaques représentatifs sont présentés (voir également les vidéos correspondantes). Les flèches indiquent la grappe battant grande cardiomyocytes utilisé pour l&#39;enregistrement électrophysiologiques. Profil électrophysiologique des cardiomyocytes bat montre régulière, entraînée, impulsions rythmiques rappelant le p-QRS-T-vu dans les complexes électrocardiogrammes clinique. Barres d&#39;échelle: 0,1 mm. Vidéos: contractante cardiomyocytes différenciés de Nam-induite CSEh. Vidéos 1 et 2 montrent représentant Vidéo grands coups grappes cardiomyocytes dans environ 1 et 3 mois après la fixation. Vidéo 3 et 4 montrent représentant contraction des muscles cardiaque à une puissance plus élevée. 5 montre un typicaL petite grappe cardiomyocytes bat spontanément différenciées des CSEh sans traitement NAM comme contrôle. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Cliquez ici pour voir la vidéo 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Cliquez ici pour voir la vidéo 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Cliquez ici pour regarder la vidéo 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Cliquez ici pour regarder la vidéo 4.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Cliquez ici pour regarder la vidéo 5.</a>

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Les auteurs déclarent des intérêts concurrents. XHP est le fondateur de Xcelthera. XHP et EYS ont des propriétés intellectuelles liées aux CSEh.

Un des défis majeurs pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique a été la manière de canaliser le potentiel de différenciation éventail de cellules souches humaines pluripotentes à un phénotype désiré de manière efficace et prévisible. Bien que ces cellules peuvent se différencier spontanément in vitro en cellules de toutes les couches de germe en passant par une phase globale multi-lignée, dans les CSEh dérivées de lignées multiples agrégats (corps embryoïdes), seule une très petite fraction des cellules (&lt;2%) spontanément se différencier en cardiomyocytes 13-15 (fig. 1A). Immunosélection Après, les populations enrichies de cardiomyocytes ont été en mesure de fonctionner comme les stimulateurs cardiaques biologiques pour sauver la fonction d&#39;un myocarde lésé mécaniquement et électroniquement suite à l&#39;injection dans le coeur de modèles animaux 13. Dans des modèles de rongeurs infarci, greffées sur les CSEh dérivées descendances cardiaques ont été capables de survivre et de mûrir jusqu&#39;à 12 semaines, et partiellement remuscularIze le cœur blessé et améliorer la fonction contractile 14,15. Toutefois, l&#39;inefficacité dans la génération humaine cardiaque commis par le biais des cellules de lignées multiples différenciation des cellules pluripotentes et le risque élevé de la transplantation tumorigénicité suivantes ont entravé autre traduction clinique. Développer des stratégies pour canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes exclusivement et de façon prévisible à un phénotype cardiaque est essentielle pour exploiter la puissance de la biologie des CSEh dans le domaine cardiaque. Afin d&#39;atteindre uniformément conversion des cellules souches pluripotentes humaines d&#39;une lignée particulière, nous avons employé un système de culture définies capable d&#39;assurer la prolifération des CSEh indifférenciées d&#39;identifier les conditions pour bien contrôlée par induction efficace de CSEh pluripotentes exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinentes par simple mise à disposition de petites molécules (Fig 1B). Nous avons constaté que la nicotinamide cardiaque induite par l&#39;engagement de lignée directe de pCSEh luripotent sous culture définies qui encore progressé à battre cardiomyocytes avec une grande efficacité (Fig. 2). Nkx2.5 est un facteur de transcription à homéoboîte évolutionnaires conservé indispensable pour le développement cardiaque normal et les mutations du gène sont associées à des maladies cardiaques humaines congénitale (CHD), l&#39;anomalie congénitale la plus fréquente de l&#39;homme 16. Expression de Nkx2.5 est la première marqueur de cellules précurseurs cardiaques chez tous les vertébrés examinés jusqu&#39;ici et est essentielle pour cloisonnement cardiaque adéquate et la formation / maturation du système de conduction électrique 16. Chez les vertébrés, l&#39;apparition et la tendance du début de l&#39;expression Nkx2.5 environ coïncider avec le calendrier et la superficie de la spécification cardiaque dans l&#39;embryogenèse précoce, et Nkx2.5 gène continue à être exprimée à travers le développement dans le coeur 16. Dans notre modèle de CSEh, NAM apparu pour déclencher l&#39;induction cardiaque directe de CSEh pluripotentes en favorisant l&#39;expression de la cardiaques spécifiques transcriNkx2.5 facteur ption dans un processus qui pourrait émuler les spécifications de cardiomesoderm de l&#39;épiblaste pluripotentes dans cardiogenèse embryonnaires humaines. Des études futures révèlent molécules contrôle génétique et épigénétique dans le développement du cœur humain comme des alternatives, qui peuvent ouvrir la voie à de petites molécules à médiation contrôle direct et la modulation du destin pluripotentes CSEh lors de la dérivation des lignées cliniquement pertinentes pour les thérapies régénératrices. Sans traitement NAM, CSEh &lt;2% va subir différenciation spontanée en battant les cardiomyocytes 12-15. Avec un traitement NAM, nous avons été en mesure de générer&gt; 95% d&#39;embryons précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes bat&gt; 50% de CSEh maintenu sous une culture de définir dans un processus qui pourrait émuler le développement humain coeur embryonnaire 12. Récemment, connue cardiaque gènes déterminant le destin ont été utilisés pour transdifférencier fibroblastes de souris en post-natal cardiomyocytes battre avec un faible rendement de &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Toutefois, reprogrammées cellules somatiques ont été historiquement associée à l&#39;expression des gènes anormaux et de la sénescence accélérée avec une utilité thérapeutique déficience 19-21. Enfin, le protocole, nous avons établi ici est limitée à CSEh pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne (MCI) ou épiblaste du blastocyste humain 4,5, peut ne pas s&#39;appliquer à d&#39;autres cellules pluripotentes, y compris les animaux provenaient des CES, les CES issus de morula tôt (huit cellules) au stade 22 embryons et les cellules reprogrammées artificiellement 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Facteur de croissance réduite </td></tr><tr><td> Homme laminine </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out de remplacement du sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM solution d&#39;acide aminé non essentiel (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM solution d&#39;acides aminés (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrine humaine </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> BFGF humain </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insuline humaine </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Homme activine A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> FBS défini </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-même plaque de fixation ultra </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

À ce jour, l&#39;absence d&#39;une source appropriée de cellules humaines cardiaques a été le revers majeur dans la régénération du myocarde humain, soit par transplantation de cellules à base cardiaques ou par génie tissulaire 1-3. Cardiomyocytes deviennent terminale différenciée peu après la naissance et perdent leur capacité à proliférer. Il n&#39;existe aucune preuve que les cellules souches / progénitrices provenant d&#39;autres sources, telles que la moelle osseuse ou le sang du cordon, sont capables de donner naissance à des cellules contractiles du muscle cardiaque après transplantation dans le coeur 1-3. Le besoin de se régénérer ou de réparer le muscle cardiaque endommagé n&#39;a pas été atteint par une thérapie de cellules souches adultes, soit endogène ou via la livraison de cellules 1-3. Le maïs génétiquement stables cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d&#39;expansion illimitée et la plasticité illimitée, proférer un réservoir pluripotentes dans la dérivation in vitro de l&#39;approvisionnement important de cellules somatiques humaines qui sont limitées à la lignée qui en ont besoinde réparation et de régénération 4,5. En raison de la prévalence des maladies cardiovasculaires dans le monde entier et aiguë la pénurie de donneurs d&#39;organes, il ya un vif intérêt dans les thérapies à base de CSEh en développement comme une approche alternative. Cependant, comment canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes efficacement et de façon prévisible à un phénotype désiré a été un défi majeur pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique. Les approches classiques s&#39;appuient sur ​​la multi-lignée de cellules pluripotentes inclinaison grâce à la différenciation de germe de la couche spontanée, résultant dans la lignée de l&#39;engagement-inefficace et incontrôlable qui est souvent suivie d&#39;hétérogénéité phénotypique et de l&#39;instabilité, par conséquent, un risque élevé de tumorigénicité 6-8 (voir un schéma de Fig. 1A). En outre, les étrangers non définie / animal suppléments biologiques et / ou des mangeoires qui ont généralement été utilisé pour l&#39;isolation, l&#39;expansion et la différenciation des CSEh peuvent faire usage direct de ces cellules-spécialisationzed greffes chez des patients problématiques 9-11. Pour surmonter ces obstacles, nous avons résolu les éléments d&#39;un système de culture définies nécessaire et suffisante pour le maintien de la pluripotence des CSEh épiblaste, servant de plateforme de novo dérivation de CSEh cliniquement appropriée et efficace de diriger les CSEh uniforme de telles lignées envers cliniquement pertinentes par de petites molécules 12 (voir le schéma dans la Fig. 1B). Après criblage d&#39;une variété de petites molécules et des facteurs de croissance, nous avons constaté que ces conditions définies rendu nicotinamide (NAM) suffisante pour induire la spécification de cardiomesoderm direct de CSEh pluripotentes encore progressé au cardioblasts qui a généré des cardiomyocytes humains battre avec une grande efficacité (Fig. 2 ). Nous avons défini les conditions d&#39;induction de cardioblasts direct de CSEh pluripotentes sans intervention multi-lignée stade de corps embryoïdes, permettant bien contrôlée de dérivation efficace d&#39;ungrande quantité de cellules cardiaques humaines à travers le spectre des stades de développement à base de cellules thérapeutiques.

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Nous avons établi un protocole pour l&#39;induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d&#39;une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

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Research

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Biology

19.3K vues.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Recherche

Biologie

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
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by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...