Les auteurs remercient Giulio Cossu, Martina Ragazzi et tout le laboratoire pour leur discussion et leur soutien utiles, et Jeff Chamberlain pour avoir gentiment fourni le vecteur MyoD-ER. Toutes les expériences impliquant des animaux vivants ont été réalisées conformément à tous les organismes, règlements et lignes directrices réglementaires et institutionnels pertinents. Le travail dans le laboratoire des auteurs est soutenu par le Conseil de la recherche médicale du Royaume-Uni, les projets du 7e cadre de la Communauté européenne Optistem et Biodesign et le projet italien Duchenne Parent.

1. Évaluation du potentiel myogénique et de greffe
<ol><li>
In vitro: Différenciation induite par MyoD<ol>
<li>Générer une lignée cellulaire stable d’IDEM transduite avec le vecteur lentiviral MyoD-ER inductible au tamoxifène, titrant la multiplicité de l’infection (MOI; par exemple 1, 5 et 50) en utilisant la coloration décrite au 1.1.9 (MyHC) comme résultat de l’efficacité de la procédure.</li>
		<li>Enrober un plat de 3,5 cm avec 1 ml de Matrigel à 1 % et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Laver la plaque deux fois avec du milieu, ensemencer 1 x10 5 Idem transduis myoD-ER dans la parabole de culture tissulaire de 3,5 cm et incuber à 37 °C dans le milieu de croissance.</li>
		<li>Attendez-vous à ce que les cellules atteignent la confluence en un ou deux jours, puis ajoutent 1 μM 4OH-tamoxifène dans le milieu de croissance (1ère dose).</li>
		<li>Après 24 heures, remplacer le milieu de croissance par un milieu de différenciation complété par 1 μM 4OH-tamoxifène (2ème et dernière dose).</li>
		<li>Remplacez la moitié du milieu par un milieu de différenciation frais tous les deux jours.</li>
		<li>Examinez quotidiennement les cultures pour la formation de myotubes.</li>
		<li>Après une semaine (5 jours dans un milieu de différenciation), laver délicatement les plaques avec du PBS et les fixer avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 5 min à TA.</li>
		<li>Effectuer une coloration par immunofluorescence avec des anticorps contre la myosine à chaîne lourde (MyHC) pour confirmer la présence de myotubes. Contre-tache avec un colorant nucléaire(par exemple Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>L’efficacité de la différenciation est évaluée comme le pourcentage de noyaux à l’intérieur des cellules MyHC-positives: passez à l’étape suivante si l’efficacité est >50%.
<ol start="2"><li>
In vivo: greffe dans un modèle de régénération musculaire aiguë Pour évaluer la contribution in vivo des IDEmm MyoD-ER à la régénération musculaire, les cellules sont préalablement étiquetées avec un vecteur codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) qui permettra de les tracer à l’intérieur du tissu. Les IDÉM MyoD-ER GFP sont ensuite injectés dans les muscles murins adultes, précédemment blessés avec une myotoxine(par exemple cardiotoxine). Pour éviter le rejet immunitaire contre les cellules xénogéniques (telles que les HIDEM) ou génétiquement manipulées/corrigées, il est nécessaire d’utiliser des souris immunodéficientes ou immunodéprimées.<ol>
<li>Prétraiter les animaux par injection intra-péritonéale de 3,5 μl/g de tamoxifène à 10 mg/ml (forme liposoluble) 24 heures avant la transplantation et prétraiter les cellules en ajoutant 1 μM 4OH-tamoxifène (forme aqueuse) dans le milieu de croissance pendant la nuit avant le jour de la transplantation.</li>
		<li>Administrer l’anesthésie et l’analgésie à la souris en suivant les directives spécifiques qui régissent les procédures chirurgicales dans l’installation pour animaux.</li>
		<li>Injecter 25 μl de cardiotoxine de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; ATTENTION : substance potentiellement nocive) dans les muscles antérieurs de tibialis (TA).</li>
		<li>24 heures après avoir traité les animaux avec du tamoxifène et du CTX, détachez les cellules par trypsinisation et comptage.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 232 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Laver la pastille cellulaire dans du PBS libre deCa2+etmg2+,centrifuger, puis remettez doucement la pastille cellulaire dans du PBS libre deCa2+et deMg2+jusqu’à une concentration finale de 106 cellules/30 μl, qui sera le volume final de chaque injection.</li>
		<li>Injecter 30 μl de suspension cellulaire dans les muscles précédemment blessés à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 29 ou 30 G. Portez une attention particulière tout en retirant l’aiguille du muscle. Faites-le lentement, en évitant de renverser la suspension cellulaire à travers la piste de l’aiguille. Ne transplantez pas le TA contralatéral et utilisez-le commetémoin, en injectant 30 μl de PBS exempt de   Ca2+ et deMg2+pour reproduire les conditions du PBS transplanté.</li>
		<li>Traiter les animaux avec du tamoxifène pendant six jours supplémentaires et administrer l’analgésie(p. ex. carprofène) pendant deux jours supplémentaires.</li>
		<li>Explanter les muscles à partir de 14 jours après la transplantation. Traiter et analyser les échantillons comme indiqué dans les protocoles 4 et 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transplantation dans des modèles murins de dystrophie musculaire
Ce test de transplantation permet d’évaluer l’étendue de la greffe d’IDEMs dans des modèles murins de dystrophie musculaire. Les animaux, traités comme suit, peuvent également être évalués pour l’amélioration fonctionnelle du phénotype de la maladie. Les tests fonctionnels peuvent être effectués à partir de deux semaines après la transplantation. Afin d’améliorer la greffe envisager d’effectuer un exercice de tapis roulant prétransplantation (comme décrit dans le protocole 3) et / ou des injections cellulaires en série toutes les trois semaines pour 3x(c’est-à-dire pour un total de 3 injections / muscle).
<ol><li>Transplantation intramusculaire<ol>
<li>Prétraiter les animaux par une injection intra-péritonéale de 3,5 μl/g de tamoxifène à 10 mg/ml (formulation liposoluble) 24 heures avant la transplantation et prétraiter les cellules en ajoutant 1 μM 4OH-tamoxifène (formulation aqueuse) dans le milieu de croissance pendant la nuit avant le jour de la transplantation.</li>
		<li>Détacher par trypsinisation, compter et centrifuger les cellules à 232 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Laver la pastille cellulaire dans du PBS sansCa2+etMg2+,centrifuger, puis ressusciter la pastille dans du PBS libre deCa2+ et Mg2+à une concentration de 106 cellules/30 μl.</li>
		<li>Administrer l’analgésie et désinfecter la peau de l’animal (facultatif) avec un désinfectant à base d’iode povidone ou de chlorexidine. Cela aidera également à localiser les muscles antérieurs (TA), gastrocnemius (GC) et quadriceps femoris (QC; en particulier l’intermedius vastus).</li>
		<li>Injecter 30 μl de suspension cellulaire dans les muscles à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 29 ou 30 G. Pour le TA, insérez 5 mm de l’aiguille 2 mm sous l’insertion du tendon proximal (direction craniocaudale) avec une inclinaison de 15° par rapport au tibia et injectez lentement la suspension cellulaire tout en rétractant l’aiguille (videz la seringue avec 2 mm de l’aiguille encore à l’intérieur du muscle). Pour le GC et le QC, répétez la même procédure que celle décrite pour le TA, la principale différence étant l’insertion caudocrânienne de l’aiguille à 2 mm au-dessus de la jonction myotendinous du tendon d’Achille pour le GC et à 2 mm au-dessus du tendon distal pour le QC (inclinaison de 15° par rapport au fémur). Faites attention tout en retirant l’aiguille du muscle afin d’éviter de renverser la suspension cellulaire à travers la piste de l’aiguille. DÉPANNAGE : En cas de faible greffe, envisagez d’injecter des souris juvéniles (âgées de 1 à 2 semaines)7 avec 3 x 105 cellules/10 μl (notez que dans ce cas, le tamoxifène doit être administré par voie sous-cutanée).</li>
	</ol></li>
	<li>Transplantation intra-artérielle Cette partie du protocole permet l’évaluation de la capacité des MIDEMs et des HIDEMs à être livrés dans la circulation artérielle, à traverser la paroi du vaisseau et à contribuer à la régénération des muscles squelettiques dans les muscles en aval du site d’injection.<ol>
<li>Prétraiter les animaux et les cellules comme décrit ci-dessus à l’étape 2.1.1.</li>
		<li>Détacher par trypsinisation et filtrer avec une passoire cellulaire de 40 μm (pour éliminer les grappes de la suspension cellulaire dans le cas peu probable où l’exposition nocturne au tamoxifène pourrait entraîner la fusion et la formation de myotubes à partir des cellules adjacentes) compter et centrifuger les cellules à 232 x g pendant 5 min</li>
		<li>Laver la pastille cellulaire dans du PBS sans Ca2+etMg2+,centrifuger, puis ressusciter la pastille dans du PBS sansCa2+etMg2+avec 0,2 International Unités d’héparine sodique (facultatif) à une concentration cellulaire finale de 106 cellules/50 μl. Ajouter 10% de colorant bleu patenté (concentration finale: 1,25 mg/ml dans une solution saline normale ou du PBS sansCa2+etMg2+)à la solution afin de visualiser la distribution de la suspension cellulaire.</li>
		<li>Administrer l’anesthésie et l’analgésie à la souris conformément aux lignes directrices régissant les interventions chirurgicales dans l’établissement pour animaux de l’établissement.</li>
		<li>Rasez la région inguinale (également connu sous le nom de fémoral ou triangle de Scarpa) et désinfectez la peau avec un désinfectant à base d’iode ou de chlorhexidine de povidone.</li>
		<li>Faites une incision de 5 à 7 mm et localisez le faisceau fémoral: veine, artère et nerf (le nerf se couche latéralement sur l’artère et la veine médiale).</li>
		<li>Retirez doucement le fascia conjonctif qui recouvre le faisceau de pinces.</li>
		<li>Séparez la veine fémorale et le nerf de l’artère en introduisant doucement l’extrémité d’une pince (ou d’une aiguille de 30 G) entre eux et en agrandissant progressivement le trou. DÉPANNAGE : La veine fémorale est fragile : faites attention à ne pas la pincer avec la pince lors de son détachement de l’artère fémorale. En cas d’hémorragie, égouttez le sang avec de la gaze stérile et utilisez un micro-cautérisateur pour faciliter l’hémostase.</li>
		<li>Soulevez l’artère avec une pointe de la pince et serrez l’artère avec l’autre pointe.</li>
		<li>Percer l’artère avec une seringue équipée d’une aiguille de 30 G. Injecter 50 μl de suspension cellulaire en aval de la zone serrée, à une vitesse de perfusion d’environ 5 μl/s. DÉPANNAGE: Remettre soigneusement en suspension les cellules dans la seringue avant l’injection: il est essentiel d’éviter la précipitation des cellules et la formation de bulles d’air à l’intérieur de la seringue. Le diamètre de l’artère fémorale est légèrement inférieur à celui d’une aiguille de 30 G : attention à ne pas tronquer l’artère lors de l’insertion de l’aiguille. Le colorant bleu patenté permet de reconnaître l’efficacité de l’injection: s’il est correctement injecté, l’ensemble du membre deviendra rapidement bleu clair.</li>
		<li>Retirez lentement l’aiguille et la pince de l’artère pour rétablir la circulation sanguine dans le membre.</li>
		<li>Appliquez une pression avec de la gaze stérile pour éviter les saignements et /ou cautériser au besoin.</li>
		<li>Suturez la plaie et surveillez les animaux jusqu’à la récupération de l’anesthésie.</li>
		<li>Administrer l’analgésie pendant 3 jours et inspecter la plaie tous les jours (en cas d’infection de la plaie, discutez-en avec le personnel de l’établissement animalier et administrez des antibiotiques au besoin).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mesures des résultats sur les animaux dystrophiques transplantés : essai sur tapis roulant
À partir de deux semaines après la transplantation cellulaire, il est possible d’évaluer l’amélioration fonctionnelle de la capacité motrice des souris traitées avec les tests sur tapis roulant. Ce test permet d’évaluer la tolérance à l’exercice/l’endurance des souris traitées. Une souris est considérée comme fatiguée lorsqu’elle est assise dans l’aire de repos pendant plus de 5 secondes, sans tenter de réengager le tapis roulant après une série de 3 stimuli mécaniques consécutifs (un toutes les 5 secondes). Les mesures de référence commencent environ un mois avant le traitement et sont utilisées pour évaluer l’amélioration de chaque animal testé. Ce test peut être suivi d’essais supplémentaires pour surveiller la fragilité des fibres, l’amélioration de la force, la greffe, la différenciation des cellules transplantées et l’amélioration morphologique des muscles transplantés (voir Discussion).
<ol><li>Acclimater les animaux (habituellement trois groupes : traités, non traités et témoins sauvages/non dystrophiques) à l’exercice avant la première mesure : régler le tapis roulant à une vitesse de 6 m/min pendant 10 min. Répétez la procédure tous les deux jours pendant une semaine. DÉPANNAGE : Enregistrer toutes les mesures à la même heure de la journée pour éviter les biais dus aux cycles circadiens.</li>
	<li>Placez les animaux dans le tapis roulant, qui a été précédemment mis en place avec une inclinaison de 10°.</li>
	<li>Allumez le tapis roulant, avec une vitesse de démarrage de 6 m/min (fournissez un stimulus mécanique doux au cas où les animaux ne sont pas disposés à commencer l’exercice).</li>
	<li>Démarrez la minuterie et augmentez la vitesse de 2 m/min toutes les 2 min.</li>
	<li>Dès qu’un animal reste dans l’aire de repos pendant plus de 5 secondes sans tenter de réengager le tapis roulant, touchez-le doucement avec un bâton pour stimuler la reprise de l’exercice (voir ci-dessus).</li>
	<li>Enregistrer la performance (temps et/ou distance) de chaque animal.</li>
	<li>Répétez les mesures chaque semaine ou tous les 10 jours pendant au moins 3x.</li>
	<li>Répétez la même procédure après la transplantation.</li>
	<li>Analyser les données de performance en comparant la mesure de chaque animal à son rendement de base. Nous suggérons de tracer les valeurs dans un graphique en pourcentage de la capacité motrice moyenne par rapport à la ligne de base et de les analyser par un test ANOVA unidirectionnel ou bidirectionnel suivi d’un post-test approprié pour comparer les groupes.</li>
</ol>DÉPANNAGE : utilisez un minimum de 5 animaux/groupe d’âge, de génotype et de sexe-assortis et répétez les mesures pour au moins 3x après la transplantation.
4. Évaluation de la greffe cellulaire et de la différenciation dans les muscles transplantés
Les muscles transplantés et témoins sont récoltés au moment approprié (<2 jours pour l’analyse de la greffe à court terme, 2-3 semaines pour le moyen terme et >1 mois pour l’analyse à long terme). Si les cellules transplantées sont étiquetées avec GFP, l’engraftment dans les muscles fraîchement isolés peut être évalué par fluorescence directe sous un stéréomicroscope UV-équipé.
<ol><li>Posez et orientez le long de l’axe vertical des muscles fraîchement isolés dans la gomme tragachanth (6% p / v)</li>
	<li>Déshydrater les échantillons dans de l’isopentane préchillé pendant une minute, les congeler dans de l’azote liquide pendant au moins 2 min et les placer immédiatement à -80 °C pour le stockage.</li>
	<li>Traiter les échantillons avec un cryostat pour obtenir des sections de 7 μm d’épaisseur sur des lames polarisées. Échantillonnez la majorité du muscle sur les lames, en recueillant environ 8-10 diapositives avec 30-40 sections / lame. Il est conseillé de recueillir une série de sections dans un tube de 1,5 ml pour effectuer des essais de biologie moléculaire / biochimie.</li>
	<li>Évaluer la greffe de cellules avec différentes taches immunofluorescentes, selon la configuration expérimentale. Par exemple, en cas de transplantation HIDEM chez des souris Sgca-null/scid/bg, des sections de coloration avec: a) un anticorps contre la lamin A / C pour détecter les noyaux de cellules humaines greffées; b) un anticorps contre la laminine pour visualiser la structure globale du muscle; et c) un anticorps contre Sgca pour détecter la restauration donneur-dérivée de la protéine absente chez l’animal dystrophique.</li>
	<li>Quantifier, à l’aide d’un microscope à fluorescence, le nombre de noyaux donneurs par section musculaire à l’intérieur et à l’extérieur des fibres musculaires et le nombre de myofibers squelettiques dérivés du donneur par section.</li>
</ol>5. Histopathologie musculaire
Les analyses histopathologiques permettent d’évaluer la structure morphologique du muscle transplanté. L’amélioration architecturale de la structure de tissu est prévue comme résultat de l’approche de thérapie cellulaire.
<ol><li>Fixer les muscles fraîchement isolés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Déshydrater les échantillons avec un gradient ascendant de saccharose(par exemple 7,5-15-30% p / v).</li>
	<li>Laissez les muscles pendant la nuit dans la solution de saccharose la plus élevée.</li>
	<li>Incorporer les échantillons dans Tissue Tek OCT, les placer dans de l’isopentane préchilled jusqu’à ce que l’OCT devienne solide (en évitant l’immersion complète des échantillons), les congeler dans de l’azote liquide pendant au moins 2 min et les placer immédiatement à -80 °C pour le stockage.</li>
	<li>Traiter les échantillons avec un cryostat pour obtenir des sections de 7 μm d’épaisseur comme décrit ci-dessus.</li>
	<li>Colorer les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine ou le trichrome de Masson selon les protocoles standard du fabricant.</li>
</ol>La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine permet de calculer les caractéristiques de régénération musculaire, telles que: a) le nombre de myofibers; b) la section transversale; c) le nombre de myofibers contenant un noyau central. Le trichrome de Masson est utilisé pour calculer l’indice fibrotique, en soustrayant la surface totale occupée par les myofibers squelettiques de la surface totale de l’image: la zone résultante reflète principalement la conjonctive et la graisse infiltrée du muscle. Toutes les analyses sur les images pourraient être effectuées à l’aide du logiciel ImageJ (NIH) avec l’outil de mesure et le plugin de compteur de cellules.

<ol>
	<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li><li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meso-angioblast:+a+multipotent,+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues.">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy.">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy.">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. 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M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li></ol>

F.S.T. a déposé une demande internationale de brevet (no. PCT/GB2013/050112) y compris une partie de la stratégie décrite dans cet article. Il a reçu des fonds de Promimetic et de DWC ltd. pour ses recherches.

Les cspi peuvent être étendus indéfiniment tout en préservant leur potentiel d’autore renouvellement et ainsi être dirigés vers une large gamme de lignées cellulaires12. Pour cette raison et pour d’autres, les cellules souches/progénitrices dérivées de l’iPSC sont considérées comme une source prometteuse pour les approches autologues de thérapie génique et cellulaire13. Un travail précédemment publié par les auteurs a rapporté la génération de progéniteurs myogènes de sou...

Les mésoangioblastes (MABs) sont des progéniteurs musculaires associés aux vaisseaux dérivés d’un sous-ensemble de péricytes1-3. Le principal avantage des MABs par rapport aux progéniteurs musculaires canoniques tels que les cellules satellites4 réside dans leur capacité à traverser la paroi des vaisseaux lorsqu’ils sont livrés intra-artériels et contribuent ainsi à la régénération musculaire squelettique dans les protocoles de thérapie cellulaire. Cette caractéristique a été évaluée et confirmée dans les modèles murins et canins de dystrophie musculaire1,5,6. Ces études précliniques ont jeté les bases d’un premier essai clinique de phase I/II chez l’homme basé sur la transplantation intra-artérielle de MABs identiques à HLA de donneur chez des enfants atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (EudraCT n° 2011-000176-33; actuellement en cours à l’hôpital San Raffaele de Milan, en Italie). L’un des principaux obstacles des approches de thérapie cellulaire, où des milliards de cellules sont nécessaires pour traiter le muscle d’un corps entier, est le potentiel prolifératif limité du « médicament » (les cellules). D’ailleurs il a été récemment démontré qu’il n’est pas possible d’obtenir des MABs des patients affectés par quelques formes de dystrophies musculaires, car il se produit dans la dystrophie musculaire de membre-ceinture 2D (LGMD2D ; OMIM #608099)7.
Pour surmonter ces limitations, un protocole pour dériver des cellules souches/progénitrices de type MAB à partir d’iPSCs humains et murins a été récemment établi7. Ce procédé génère des populations facilement extensibles de cellules avec une signature vasculaire de gène et un immunophenotype fortement semblables aux MABs muscle-dérivés adultes. Lors de l’expression du facteur régulateur myogénique MyoD, les IDEM murins et humains (respectivement MIDEMs et HIDEMs) subissent une différenciation terminale des muscles squelettiques. Pour atteindre cet objectif, les IDEM peuvent être transduites avec des vecteurs capables de conduire l’expression myoD, soit de manière constitutive, soit de manière inductible8-10. Un vecteur lentiviral contenant de l’ADNc MyoD fusionné avec le récepteur des œstrogènes (MyoD-ER) est utilisé, permettant ainsi sa translocation nucléaire lors de l’administration de tamoxifène (un analogue de l’œstrogène)11. Cette stratégie se traduit par la formation de myotubes hypertrophiques multinucléés, avec une efficacité élevée7. Notamment, les IDEM sont nontumorigènes, peuvent se greffer et se différencier à l’intérieur des muscles de l’hôte lors de la transplantation et peuvent être génétiquement corrigés à l’aide de différents vecteurs(par exemple, des lentivirus ou des chromosomes artificiels humains), ouvrant la voie à de futures stratégies thérapeutiques autologues. La dérivation, la caractérisation et la transplantation des IDEM ont été décrites dans la publication ci-dessus7. Ce document de protocole détaille les analyses exécutées pour évaluer la différentiation myogenic in vitro d’IDEMs et les mesures suivantes de résultats pour tester l’efficacité de leur transplantation dans des modèles murins de régénération de muscle.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaCell DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0090L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Calcium/Magnesium free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutammine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilline/Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fer-In-Sol</td>
			<td>Mead Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferlixit</td>
			<td>Aventis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01257-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5900-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bFGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grow factors-reduced Matrigel</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium heparin</td>
			<td>Mayne Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19, 821-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OH Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9759</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragachant gum</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopenthane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24,872,323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s trichrome</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-010802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Lamin A/C antibody</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NLC-LAM-A/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4/11/13</td>
			<td>Cappel</td>
			<td>559762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma fluka</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Laminin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MATERIALS AND EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adsorbable antibacteric suture 4-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>vcp310h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill</td>
			<td>Columbus instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane unit</td>
			<td>Harvad Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optics</td>
			<td>Euromecs (Holland)</td>
			<td>EK1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>C17A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>11REF050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td></td>
			<td>5/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature cauteriser</td>
			<td>Bovie Medical</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEDIA COMPOSITION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media composition is detailed below. 
			HIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>MegaCell Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li>
				<li>5% fetal bovine serum (FBS)</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% non essential amino acids</li>
				<li>5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in:
			<ul>
				<li>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</li>
				<li>10 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% Non essential amino acids (NEAA)</li>
				<li>1% ITS (insulin / transferrin / selenium)</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>0.5 &#956;M oleic and linoleic acids</li>
				<li>1.5 &#956;M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li>
				<li>0.12 &#956;M Fe3+ (Ferlixit)</li>
			</ul>
			MIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>20 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Differentiation medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>2 % Horse Serum (HS)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
			</ul>
			 
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.

transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration

Les cspi dérivés du patient pourraient être une source inestimable de cellules pour les futurs protocoles de thérapie cellulaire autologue. Les cellules souches/progénitrices myogènes dérivées de l’iPSC similaires aux mésoangioblastes dérivés des péricytes (cellules souches/progénitrices dérivées de l’iPSC de type mésoangioblaste : IDEM) peuvent être établies à partir de cspi générées par des patients atteints de différentes formes de dystrophie musculaire. Les IDEM spécifiques au patient peuvent être génétiquement corrigés avec différentes stratégies(par exemple, vecteurs lentiviraux, chromosomes artificiels humains) et améliorés dans leur potentiel de différenciation myogénique lors de la surexpression du régulateur de la myogenèse MyoD. Ce potentiel myogénique est ensuite évalué in vitro avec des tests de différenciation spécifiques et analysé par immunofluorescence. Le potentiel régénérateur des IDEM est en outre évalué in vivo,lors d’une transplantation intramusculaire et intra-artérielle dans deux modèles murins représentatifs présentant une régénération musculaire aiguë et chronique. La contribution des IDEM au muscle squelettique hôte est ensuite confirmée par différents tests fonctionnels chez des souris transplantées. En particulier, l’amélioration de la capacité motrice des animaux est étudiée avec des tests sur tapis roulant. La greffe et la différenciation cellulaires sont alors évaluées par un certain nombre d’analyses histologiques et d’immunofluorescence sur les muscles transplantés. Dans l’ensemble, cet article décrit les essais et les outils actuellement utilisés pour évaluer la capacité de différenciation des IDEM, en se concentrant sur les méthodes de transplantation et les mesures de résultats ultérieures pour analyser l’efficacité de la transplantation cellulaire.

Les résultats représentatifs rapportés suivent les principaux essais in vitro/in vivo décrits dans le flux de travail de la figure 1. 48 heures après l’administration de 4OH-tamoxifène Les noyaux MyoD-positifs sont identifiables au sein des IDED transduites MyoD-ER en culture(figure 2A). Les cellules fusionnent ensuite et se différencient en myotubes multinucléés(figure 2B). Lorsqu’ils sont transplantés par voie intramusculaire dans un modèle muri...

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Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Les progéniteurs myogéniques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (csps) sont des candidats prometteurs pour les stratégies de thérapie cellulaire visant à traiter les dystrophies musculaires. Ce protocole décrit la transplantation et les mesures fonctionnelles exigées pour évaluer l’engraftment et la différentiation des mesoangioblasts iPSC-dérivés (un type de progéniteurs de muscle) dans des modèles murins de régénération aiguë et chronique de muscle.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K vues.  University College London. Les progéniteurs myogéniques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (csps) sont des candidats prometteurs pour les stratégies de thérapie cellulaire visant à traiter les dystrophies musculaires. Ce protocole décrit la transplantation et les mesures fonctionnelles exigées pour évaluer l’engraftment et la différentiation des mesoangioblasts iPSC-dérivés (un type de progéniteurs de muscle) dans des modèles murins de régénération aiguë et chro...