PLP est un chercheur associé du Centre de recherche en santé de Sanford enfants. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à PLP: R01AR056712, R01AR052779 et P30 AR061303 de l&#39;Institut national de la santé / Institut national de l&#39;arthrite et de l&#39;appareil locomoteur et de Skin Diseases (NIAMS), MDA et Sanford enfants attribution recherche en santé. Ce travail a en partie bénéficié de financement de la recherche du septième programme-cadre de la Communauté européenne dans le projet FP7-santé - 2009 EndoStem 241440 (activation des cellules du système vasculaire associés souches et les cellules souches musculaires pour la réparation et l&#39;entretien du tissu musculaire) SA a été soutenue par. CIRM bourse.

1. Infection des CSEh Ce protocole nécessite une grande lentivirus de titre codage BAF60C et MyoD 13. Ces constructions sont disponibles sur demande. <ol><li> Recommandations avant de commencer <ol><li> Afin d&#39;assurer une efficacité élevée de l&#39;infection, les CSEh plaque d&#39;infection sur les conditions de libre-alimentation (figure 2A) pour éliminer des concurrents cellulaires au cours de l&#39;absorption virale. En effet, MEF sont notoirement plus facile à infecter par rapport à CSEh et sont compétents pour la conversion de MyoD médiation. Ainsi, l&#39;élimination MEF à partir de cultures de CSEh augmente le taux d&#39;infection. </li><li> Il est recommandé d&#39;avoir des lentivirus à titre élevé pour assurer une haute efficacité d&#39;infection. Options pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;infection sont discutés dans la section &quot;contrôle l&#39;infection&quot;. </li><li> Préparer des plaques de matrigel revêtues en ajoutant 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel dans chaque puits et laisser au moins une heure à température ambiante (ou O / N scellé à 4 ° Csi préparé la veille). </li></ol></li><li> procédure d&#39;infection <ol><li> Jour avant l&#39;infection <ol><li> Ajouter hES clonage des cellules et Supplément de récupération dans le milieu à 1000 X dilution (2 mM concentration finale). </li></ol></li><li> Jour 0 - Infection à BAF60C Remarque: Effectuez l&#39;infection de CSEh avec BAF60C premier suivi par une infection avec MyoD. <ol><li> Dissocier un puits d&#39;une plaque de 6 puits hESCs cultivés sous forme de colonies 14 dans une suspension à cellule unique par incubation avec 1 ml de TrypLE pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Transfert suspension dans un tube de 15 ml, ajouter 9 ml de milieu CSEh et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm. </li><li> Pendant la centrifugation, préparer le mélange de l&#39;infection dans un tube propre en ajoutant 1 ml de mTeSR1, polybrene (6 mg / ml) et hES cellulaire Clonage &amp; Recovery supplément (2 mM). </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire (environ 5 x 10 5 -1 × 10 6 cellules provenant d&#39;une confluent bien des CSEh) avec 1 ml de mélange infection et la plaque sur une plaque de fixation 6 et faible, ce qui empêche les cellules d&#39;adhérer au plastique. </li><li> Ajouter BAF60C-IRES-GFP virus à 10 8 MOI et incuber 3 heures dans l&#39;incubateur </li><li> Recueillir la suspension de cellules contenant les virus et répartir également dans deux puits de matrigel revêtu. Ensuite, ajouter 2 ml de cellules Supplément Clonage &amp; Recovery mTeSR1 + hES à chaque puits et laisser O / N dans l&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Jour 1 <ol><li> Retirez délicatement le milieu contenant le virus et le remplacer par 2 ml de mTeSR1and hES clonage des cellules et Supplément de récupération. Les cellules vont commencer agglutination comme le montre la figure 2B. </li></ol></li><li> Jour 2 - Infection à MyoD <ol><li> Avant de continuer de vérifier l&#39;état de la fluorescence des cellules sous un microscope à fluorescence pour s&#39;assurer d&#39;avoir un rendement élevé d&#39;infection. Sinon, consultez la section «vérifier infecterion «. </li><li> Si les cellules ont atteint au moins 80% de confluence, procédez comme suit; sinon attendre une journée supplémentaire avant de procéder. </li><li> Retirez le support et ajouter 1 ml de réactif TrypLE à dissocier les cellules. Incuber 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Répéter comme from1.2.2.2 décrit - 1.2.2.6 ajoutant virus de MyoD à 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Jour 3 <ol><li> Retirez délicatement le milieu contenant le virus et le remplacer par 2 ml de mTeSR1and hES clonage des cellules et Supplément de récupération. </li><li> MEF de plaque sur matrigel revêtus de plaques de 2,5 x 10 5 / cm 2 pour le lendemain pour permettre la propagation des cellules infectées. </li></ol></li><li> Jour 4 <ol><li> Retirez le support et ajouter 1 ml de réactif TrypLE à dissocier les cellules. Incuber 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules dans un tube Falcon de 15 ml, ajouter 9 ml de milieu CSEh et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm. </li><li> Remove le surnageant et remettre en suspension dans 6 ml de milieu CSEh. </li><li> Retirez le support de la plaque de 6 puits contenant MEF et CSEh plaque à 01:02 rapport de division, de distribution 3 ml pour chaque MEF contenant bien. Astuce! Lorsque les colonies atteignent la confluence, certains des puits de cellules MyoD/BAF60C-infected peuvent être congelés dans l&#39;azote liquide comme un stock de réserve. Milieu de congélation comprend 90% de KOSR et 10% de DMSO plus 2 mM hES clonage des cellules et Supplément de récupération. Les puits restants peuvent être ensuite exposés au protocole de différenciation - voir ci-dessous pour la description. Si plusieurs cellules sont nécessaires pour produire plus myospheres, CSEh infectés peuvent se propager comme suit en outre: </li><li> Enlever le milieu et incuber avec 1 ml de 1 mg / ml de collagénase IV pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la collagénase IV et ajouter 1 ml de milieu de CSEh. </li><li> Sous un microscope de dissection gratter les colonies avec une pointe de 10 ml. </li><li> Ramassez les morceaux de colonisationes dans un tube de 15 ml et permettre aux sédiments pendant 3 min. Ensuite, retirer le surnageant, remettre en suspension dans un milieu CSEh et la plaque sur MEF plaques en utilisant un rapport de 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Vérification de l&#39;infection <ol><li> Alors que la propagation des cellules, il est recommandé de plaquer les cellules infectées dans une plus petite échelle à la récolte pour l&#39;analyse de l&#39;ARN et effectuer une analyse de l&#39;expression des protéines par immunofluorescence afin de vérifier les biomarqueurs qui reflètent la situation biologique correcte à chaque étape (voir résultats représentatifs). Pour les lentivirus de titre élevé, le pourcentage de cellules infectées attendus doit être d&#39;au moins 80%. </li><li> Pour assurer une efficacité élevée, les vecteurs lentiviraux peuvent être modifiées, l&#39;introduction d&#39;un marqueur de sélection de fluorescence et / ou une résistance à un antibiotique. Notre plasmide lentiviral exprimant BAF60C porte également fluorescence de la GFP. </li><li> Tri CSEh pour un marqueur fluorescent. Dans le cas d&#39;une faible efficacité de l&#39;infection est recommandé d&#39;utiliser une fluorescencecellules ctivated de tri (tri par FACS) pour enrichir les cellules exprimant le virus de BAF60C puis infecter les cellules par le virus de titre élevé de MyoD. <ol><li> Ajouter hES clonage des cellules et Supplément de récupération dans le milieu de la journée avant le tri. </li><li> Le jour du tri, dissocier les cellules par TrypLE (comme décrit au jour 0) et remettre en suspension les cellules dans le sérum de remplacement KO, plus hES cellulaire Supplément Clonage &amp; Recovery en FACS-tubes. </li><li> A la fin du tri, de recueillir les cellules KO sérum de remplacement et la plaque sur MEF plaques ajoutant hES clonage des cellules et Supplément de récupération. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-comme induction et différenciation <ol><li> Induction et la différenciation procédure <ol><li> Jour 0 - EB induction <ol><li> Assurez-vous, avant de commencer la différenciation de BAF60C/Myod-infected CSEh, pour avoir un nombre élevé de colonies dans le puits (figure 2C). </li><li> Pour chaque bien remove le milieu, laver avec du PBS et ajouter 1 ml de 1 mg / ml de collagénase IV. Incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la collagénase et ajouter 1 ml de milieu EB. </li><li> Sous un microscope de dissection rapidement dissocier mécaniquement les colonies en 400-800 agrégats de cellules en grattant avec une pointe de 10 ml. </li><li> Ramassez les morceaux de colonies dans un tube de 15 ml et laisser sédimenter pendant 3 min. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 3 ml de milieu EB et transférer la suspension cellulaire à un puits d&#39;une plaque à 6 puits peu d&#39;attachement. </li></ol></li><li> Jour 1 <ol><li> Vérifiez la taille des colonies et la mort de la cellule avant de poursuivre. Si de gros morceaux sont présents, les briser par un léger pipetage de haut en bas avec une pipette de 5 ml, 3-4 fois. Si la mort cellulaire est très élevé (de nombreuses cellules et les débris flottants) remplacent le milieu par la collecte des agrégats dans un tube de 15 ml par gravité et leur plaque avec 3 ml de milieu EB frais, sinon procédez comme suit. </li><li> Ajouter 1,5ml de milieu EB frais dans les puits </li></ol></li><li> Jour 2 <ol><li> Changer le support en recueillant les agrégats des puits dans un tube de 15 ml. Qu&#39;ils s&#39;installent pendant 2 min. </li><li> Retirer le surnageant, remplacer par 3 ml de milieu EB frais et redistribuer sur les mêmes puits. </li></ol></li><li> Jour 3 <ol><li> Ajouter 1,5 ml de milieu EB frais dans les puits. </li></ol></li><li> Jour 4 <ol><li> Procédez comme décrit dans &quot;Jour 2&quot;. </li></ol></li><li> Jour 5 - la différenciation myogénique des grappes EB-comme (figure 2D). <ol><li> Recueillir les agrégats comme décrit dans 2.1.3.1 et laver une fois avec 2 ml de PBS; permettent l&#39;agrégation de sédiments. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 3 ml de milieu de DM; plaque sur les mêmes puits. </li></ol></li><li> Jour 6 - Jour 20 <ol><li> De d6 à d20 remplacer le milieu par du milieu frais tous les 3 jours. Myospheres représentatifs sont présentés dans Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Différenciation myosphere Vérification <ol><li> Avant de poursuivre, il est recommandé de vérifier l&#39;efficacité de la différenciation myogénique dans les myospheres en faisant des sections des myospheres noyées dans du composé OCT, comme décrit dans un protocole JoVE précédente 12. Effectuer une coloration par immunofluorescence des marqueurs myogéniques tels que myognenin (clone de F5D, DSHB) et la myosine chaîne lourde (clone de MF20, DSHB) (voir résultats représentatifs). ASTUCE: Pour être réussie avec la coloration pour la myogénine sur des sections EB il est essentiel d&#39;effectuer l&#39;extraction de l&#39;antigène par traitement avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,5% pendant 5 min. En outre, il est possible d&#39;utiliser ce protocole pour la double coloration en utilisant des anticorps F5D et MF20. </li></ol></li></ol> 3. Médias Recettes <ol><li> Moyen ESC DMEM-F12 1 mM de L-glutamine 20% Knockout Serum moyen de remplacement (KOSR) 0,1 mM acides aminés non essentiels (acides aminés non essentiels) 50 U / ml de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol 8 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) </li><li> Moyen EB DMEM F12 1 mM de L-glutamine 15% de FBS 5% de sérum de cheval </li><li> milieu de DM DMEF F12 Supplément 1X SON Liquid Media 1X N-2 Complément </li></ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. 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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le protocole proposé ici décrit comment générer des grappes en trois dimensions des fibres musculaires contractiles (de myospheres) directement à partir de CSEh. La stratégie proposée a le potentiel sans précédent et extraordinaire pour produire des mini muscles en suspension qui peuvent être utilisées comme une «maladie dans un plat de« modèle pour les deux tests de dépistage et des études sur le développement. En outre, le procédé pour générer des cellules hES de myospheres est simple et ne nécessite aucune étape de tri par FACS au cours de la différenciation, ce qui a généralement un effet négatif sur le rendement en cellules récupérées. Par ailleurs, une procédure de tri au cours de la différenciation serait interférer avec l&#39;agrégation, car il implique une dissociation de l&#39;EB dans des cellules individuelles. La méthode proposée est basée sur la reprogrammation épigénétique de CSEh à des facteurs spécifiques, MyoD et BaAF60C, qui ne sont pas exprimés dans les cellules souches embryonnaires pluripotentes. MyoD et BAF60C fournissent le «noyau» de protéines e complexeà marque le locus génomique de transcription qui procède à activer le programme myogénique squelettique. Les deux facteurs sont délivrés à des cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;infections lentivirales et il est donc essentiel d&#39;obtenir une haute efficacité d&#39;infection de ces deux facteurs dans toutes les cellules. Ceci peut être réalisé à l&#39;aide de virus de titre élevé ou des virus dotés de marqueurs de sélection. Les conditions de culture jouent également un rôle important dans l&#39;optimisation de l&#39;étendue de la différenciation myogénique. Nous vous proposons un protocole de différenciation à base de sérum pour la différenciation des cellules hES MyoD/BAF60C exprimant en grappes de précurseurs myogéniques, suivie d&#39;une incubation dans un milieu défini sans sérum (contenant de l&#39;insuline transferrine - STI) pour obtenir une conversion des précurseurs myogéniques en myotubes squelettiques. Cependant, il est possible que d&#39;autres milieux définis peuvent réaliser une différenciation myogénique égale ou meilleure. Une limitation du courant du protocole est qu&#39;il repose sur l&#39;utilisation de sérum bovin foetal, qui contient en outrement de nombreuses protéines et des substances animales, montre des variations de lot à lot. Cela peut entraîner une moindre efficacité ou l&#39;hétérogénéité de conversion myogénique dans myospheres. Fait à noter, toutes les structures EB-comme dérivées de CSEh BAF60/MyoD-expressing ne sont pas myospheres; à savoir, certains sont des agrégats EB-comme entièrement constitués de fibres musculaires. Le nombre de myospheres normalement dérivées de CSEh exprimant BAF60C et MyoD peut varier de 30 à 60% selon les estimations de coloration immunologique sur les sections EB effectuées à la fin du protocole (voir résultats). Une approche possible pour enrichir une boîte de culture pour seulement myospheres serait d&#39;utiliser un journaliste myogénique. Cela faciliterait en rejetant les groupes EB-comme partiellement ou pas différenciées et ne sélectionnant que les myospheres. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux exigences temporelles des facteurs introduits serait utile d&#39;améliorer la méthode de livraison. Par exemple, si BAF60C et MyoD ne sont nécessaires que pour shtemps ort à &quot;kick&quot; les cellules dans la bonne direction, les méthodes basées sur la livraison de l&#39;ARNm modifié pourrait être appliquée. En revanche, si les facteurs sont nécessaires pour un temps plus long avant que les cellules exploiter leurs protéines endogènes, une approche épisomique serait recommandé d&#39;éliminer la variabilité et des effets incontrôlés dus à l&#39;intégration dans le génome. Enfin, nous notons qu&#39;il est obligatoire d&#39;exprimer BAF60C avant ou en même temps que MyoD (jamais après) afin de réaliser la conversion de CSEh dans les muscles squelettiques. L&#39;exigence pour l&#39;expression préalable de BAF60C repose vraisemblablement sur ​​son rôle dans la pré-réglage du paysage épigénétique pour une bonne répartition de la chromatine à travers MyoD le génome 6,15. En tant que tel, les futurs protocoles pourraient être améliorées par des composés ou d&#39;autres manipulations qui favorisent l&#39;expression de BAF60C dans les CSEh.

En raison de leur capacité unique d&#39;auto-renouvellement, tout en conservant la pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont considérés comme une ressource inestimable pour la médecine régénérative. Génération des cellules souches repeuplement médiation des muscles malades et les cellules CSEh ou souches pluripotentes induites (iPSC) dérivés des muscles squelettiques pour la modélisation de la maladie in vitro sont des objectifs clés des études visant à identifier les traitements et élucider la pathogenèse de nombreuses maladies neuromusculaires. Cependant, ces études ont été contestées par la résistance de CSEh à convertir en cellules musculaires squelettiques et par le manque d&#39;informations en ce qui concerne la régulation moléculaire de CSEh engagement envers la myogenèse squelettique. En effet, les précédentes tentatives pour générer des progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh ont révélé que seul organe embryoïde des descendances (EB) dérivés ou des cellules mésenchymateuses sont compétents pour activer la myogenèse squelettique suivant l&#39;expression ectopique de activateurs de transcription (par exemple,Pax3 ou Myf5) 1-3 ou par exposition à des conditions de culture spécifiques 4-5. Nous avons précédemment montré que le composant SWI / SNF, BAF60C (codée par SMARCD3), est une composante essentielle de la machinerie transcriptionnelle qui permet l&#39;activation de MyoD médiation de spécifique du muscle loci 6. Nous avons récemment découvert que l&#39;absence sélective de cellules hES sur BAF60C confère la résistance à l&#39;activation de MyoD à médiation de la myogenèse squelettique 7 qui est par ailleurs observée dans les cellules somatiques exprimant BAF60C 8-10, un procédé couramment appelé conversion myogénique. Expression forcée de BAF60C permet MyoD pour activer directement la myogenèse squelettique dans les CSEh, des conditions de culture spécifiques, avec BAF60C et MyoD imposant une signature épigénétique qui commet CSEh vers la lignée myogénique 7. Fait à noter, l&#39;analyse protéomique précédente a révélé l&#39;absence sélective de BAF60C, parmi les composants SWI / SNF, dans CES 11. Nous avons utilisé ces connaissances pour imposer un engagement épigénétique des CSEh sur la lignée myogénique, conduisant à la génération d&#39;une population homogène de myoblastes squelettiques pouvant être regroupés pour former contractile en trois dimensions structures (myospheres) que les muscles fonctionnellement imiter miniaturisés squelettiques 7. effet, notre méthode de génération de progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh s&#39;appuie sur l&#39;engagement épigénétique de CSEh à la lignée myogénique, qui est phénotypiquement latente jusqu&#39;à ce que les cellules sont exposées à des signaux de différenciation, comme cellule l&#39;agrégation et de la culture en milieu de différenciation (voir protocole spécifique). Cette stratégie permet l&#39;expansion d&#39;une population homogène de cellules hES qui sont épigénétique engagé à lignage musculaire squelettique et adapté à la formation de myospheres contractiles tridimensionnelles qui récapitulent histologiques et des propriétés fonctionnelles du squelettemuscles. Les myospheres fournissent la première preuve de muscles miniaturisés exploitables pour une «maladie dans un plat&quot; modèle de maladies musculaires. Quand elle est générée à partir de dérivées patient CSPi, ces myospheres ont le potentiel pour élucider les questions de développement de longue date et la pathogenèse des maladies rares, en plus d&#39;offrir l&#39;énorme potentiel comme outil de criblage à haut débit de composés thérapeutiques. Nous notons également que l&#39;une lecture immédiate de myosphere analyse pourrait être fournie par immunohistochimie sur coupes, comme décrit dans un protocole de JoVE par Gomes et al. 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

La génération d&#39;une population homogène et abondante de cellules musculaires squelettiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) est une exigence pour des thérapies à base de cellules et pour une &quot;maladie dans une boîte de&quot; modèle de maladies neuromusculaires humaines. Obstacles majeurs, tels que la faible abondance et l&#39;hétérogénéité de la population d&#39;intérêt, ainsi que l&#39;absence de protocoles pour la formation de structures contractiles trois dimensions, ont limité les applications des cellules souches pour les maladies neuromusculaires. Nous avons un protocole qui permet de surmonter ces limites, par introduction ectopique de facteurs définis dans hESCs - le facteur de détermination de MyoD muscle et SWI / SNF de remodelage de la chromatine BAF60C composant complexe - qui sont en mesure de reprogrammer hESCs dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici le protocole établi pour générer des myoblastes de CSEh dérivées et promouvoir leur regroupement en structures tridimensionnelles miniaturisés (de myospheres) que les muscles squelettiques miniaturisés fonctionnellement imiter 7 </sup&gt;.

La figure 1A montre un schéma du protocole proposé pour générer myospheres de CSEh. Les étapes essentielles pour contrôler (indiquées par les flèches) sont l&#39;efficacité de l&#39;infection dans hESCs et la conversion dans les myospheres myogénique. Dans nos expériences, nous profitons d&#39;un vecteur lentiviral codant BAF60C qui porte fluorescence de la GFP. Nous infectent généralement les cellules avec BAF60C et FACS sorte 72 heures après l&#39;infection pour enrichir la population exprimant BAF60C. Lorsque les cellules atteignent environ 70-80% de confluence, nous infectent avec MyoD lentivirus. Après la primo-infection qu&#39;il faut normalement deux ou trois jours pour les cellules d&#39;atteindre ce confluence. La figure 1B montre les niveaux des gènes exogènes comme un facteur d&#39;induction par rapport aux cellules hES non infectées d&#39;expression. Figure 1C montre l&#39;expression et la distribution au niveau des facteurs de protéines introduites. BAF60C<html> expression est représentée par la fluorescence de la GFP, tandis que l&#39;expression de MyoD est détecté par immunofluorescence avec un anticorps de MyoD. Nous considérons jour 0 le jour où nous commençons la différenciation des CSEh infectés en agrégats EB-comme. Après 15 jours dans un milieu de DM, une partie des myospheres (généralement un ensemble bien) est noyé dans du composé OCT 12 et sectionné à effectuer immunofluorescence des marqueurs myogéniques pour vérifier l&#39;efficacité de conversion myogénique. Figure 1D montre une coloration représentant pour myogénine et chaîne lourde de myosine dans une différenciation myogénique optimale. Myospheres peuvent avoir des formes différentes ou inhabituelles, peut-être à la suite de la fusion avec de petites myospheres. À partir du jour 10, il est possible d&#39;observer la contraction sporadique dans les myospheres (voir vidéo 1 et 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. A) Schéma du protocole utilisé pour la génération de myospheres de CSEh. B) les niveaux d&#39;ARNm des gènes exogènes dans les CSEh infectées par BAF60C et MyoD (H9-BM) suivi par qRT-PCR et exprimée en multiples de l&#39;induction, comme par rapport à moquer CSEh infectés images (H9-ctr). C) immunofluorescence montrant MyoD coloration (rouge) et BAF60C fluorescence (vert) en raison de l&#39;élément IRES-GFP dans le vecteur. D) immunofluorescence réalisée sur myosphere sections colorées pour Myogenin (MYOG ), la chaîne myosine lourd (MyHC) et contre-pour DAPI (voir les détails d&#39;immunofluorescence). La barre d&#39;échelle est de 100 um. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figure 2. Des images représentatives de l&#39;apparence des cellules à différents stades de laprotocole de l&#39;infection (partie I) à la différenciation (partie II). Barre d&#39;échelle est de 100 um. Alors que les structures EB-comme de D1 à D5 sont pour la plupart de forme circulaire (D), myospheres adultes de plus de 15 jours selon le schéma de la figure 1A présente une forme imprévisible et sont hétérogènes dans la culture; voir deux exemples E et F.

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Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d&#39;une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l&#39;homme les muscles squelettiques.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.8K vues.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d'une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l'homme les muscles squelettiques. 

Vidéo: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

De MEFs à I Matrigel: CSEh repiquage en présence du MEF

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
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Recherche

Biologie

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.