Ce protocole est significatif parce qu’il peut être utilisé pour créer des xénogreffes musculaires squelettiques humaines, qui peuvent être utilisées pour modéliser les maladies musculaires et effectuer des tests thérapeutiques précliniques. Ce modèle de xénogreffe permet aux chercheurs d’étudier le muscle humain in vivo pour mieux comprendre la biologie des cellules musculaires humaines et de développer de nouveaux modèles pour les maladies musculaires rares ou acquises. Après avoir obtenu une biopsie musculaire humaine, placez le spécimen dans une boîte petri de 100 x 15 millimètres contenant un milieu musculaire, et utilisez un microscope stéréo et des ciseaux chirurgicaux pour enlever tout fascia ou tissu adipeux restant.
Disséquer la biopsie musculaire en environ sept par trois par trois millimètres morceaux, en prenant soin que les fibres sont disposées longitudienment dans le spécimen. Ensuite, transférez la boîte de Pétri contenant le muscle disséqué sur la glace et placez des sutures synthétiques et non absorbables dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres de 70 % d’éthanol. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris NOD-Rag-gamma de huit à 12 semaines, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal immunodéficient et utilisez une tondeuse pour enlever les cheveux qui survolent l’antérieur tibialis de la cheville au genou.
Ensuite, appliquez de la crème depilatory sur la peau exposée pendant une minute avant de désinfecter le site chirurgical avec la solution povidone-iode et 70% d’éthanol. Pour greffer le tissu humain, d’abord ruban adhésif sur la jambe de la souris, et faire une incision droite sur l’antérieur tibialis provenant des tendons distal et se terminant sous le genou. Utilisez la dissection contondante pour séparer la peau du tissu musculaire, et utilisez des ciseaux pour faire une incision inférieure à 0,5 millimètre par l’épimysium du muscle antérieur tibialis, à partir du tendon et se terminant au genou.
Après avoir coupé le tendon distal de l’antérieur tibialis, saisir le tendon avec des forceps de l’iris, et tirer le muscle vers le haut vers le genou. Ensuite, coupez le tendon distal de l’extenseur digitorum longus, et tirez l’extenseur digitorum longus vers le haut vers le genou. Une fois que le tendon proximal du muscle peroneus longus est visible, retirez l’extenseur digitorum longus et le tibialis antérieur avec les ciseaux.
Utilisez un lingette chirurgicale humide avec PBS pour appliquer une légère pression jusqu’à ce que l’hémostase soit atteinte, et enfiler une suture à travers le tendon proximal peroneus longus, laissant un morceau de fil d’environ 1,5 pouce de chaque côté du tendon. Faire la première moitié d’un noeud carré chirurgical à deux mains sans serrer pour former un cercle, et placer une xénogreffe dans le cercle, serrant la boucle pour fixer le tissu de greffe. Compléter l’autre moitié du nœud carré pour suturer la xénogreffe au tendon proximal du peroneus longus, et enfiler la suture à travers le tendon distal peroneus longus pour répéter la technique du nœud carré au tendon distal.
Lorsque les deux extrémités de la greffe ont été fixées, tirez la peau sur le muscle xénogreffe, sceller l’incision avec de la colle chirurgicale, et placer deux à trois agrafes chirurgicales sur la colle. Ensuite, placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la récumbence complète. Quatre à six mois après l’opération, placer un bécher couvert contenant 200 millilitres de 2 méthylbutane dans une boîte de glace sèche pendant au moins 30 minutes avant la récolte de xénogreffe.
Lorsque le 2-méthylbutane a refroidi, confirmer un manque de réponse à la pincement des orteils, et enlever les cheveux au-dessus de l’antérieur tibialis de la cheville au genou avec une tondeuse et crème depilatory. Les sutures tenant la xénogreffe en place doivent être observées à travers la peau. Fixez la jambe avec du ruban adhésif et utilisez des ciseaux et des forceps d’iris pour ouvrir la peau sur la xénogreffe jusqu’à ce que les deux sutures soient découvertes.
Utilisez un scalpel pour couper entre la xénogreffe et le tibia pour libérer un côté de la xénogreffe avant de couper entre le muscle peroneus longus et le muscle gastrocnemius. Coupez en dessous de la suture distale et à travers le tendon distal du peroneus longus, et utilisez les forceps de l’iris pour saisir et dévier la suture vers le genou tout en utilisant des ciseaux pour couper la xénogreffe loin du tissu musculaire sous-jacent. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper au-dessus de la suture proximale pour enlever la xénogreffe et le peroneus longus, et placez le spécimen récolté sur un petit morceau de carton.
Épinglez le tissu aussi près que possible des sutures tout en étirant doucement le muscle pour s’assurer que l’orientation de fibre sera maintenue pendant le processus de snap-gel. Lorsque les broches sont solidement en place, faites glisser le muscle vers le haut des broches de sorte que le tissu repose juste au-dessus du carton, et casser geler la xénogreffe dans le pré-refroidi 2-méthylbutane pour moins 80 degrés Celsius de stockage. Une xénogreffe réussie démontre une régénération robuste des myofibers humains tels qu’identifiés avec des anticorps spécifiques à l’homme.
La coloration embryonnaire positive de myosine dans une proportion de myofibers indique que le processus de régénération est toujours en cours. En revanche, une mauvaise technique chirurgicale ou un spécimen inadéquat peut conduire à une mauvaise régénération des fibres musculaires. Les xénogreffes exécutées d’un patient diagnostiqué avec une myopathie inflammatoire idiopathique montrent des nombres modérés de myofibers humains régénérés aux collections de quatre et six mois, et la coloration embryonnaire de myosine persiste à six mois.
Les cellules inflammatoires sont également présentes dans la xénogreffe, comme l’observent les taches H et E. Les tailles individuelles de myofiber sont semblables entre quatre et six mois dans les xénogreffes inflammatoires idiopathiques de myopathie. Des fibres rares montrant une zone transversale supérieure à 3500 micromètres carrés sont observées dans les xénogreffes, mais pas dans les biopsies inflammatoires idiopathiques de myopathie, ce qui indique que certains des myofibers dans les xénogreffes peuvent se régénérer en une zone transversale similaire en taille aux myofibers sains.
Les parties les plus importantes de cette procédure sont l’identification de tous les tendons de la cheville après l’incision initiale est faite et avec succès la coupe à travers l’épimysium. La compétence fonctionnelle des xénogreffes peut être évaluée en isolant enzymatiquement les myofibers simples et en testant les transitoires de calcium ou en effectuant des mesures forcées évoquées après stimulation électrique.
