Ce travail a été partiellement financé par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l&#39;Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer; accord de recherche collaborative entre le NCI et Calidris Therapeutics; American Cancer Society subvention IRG 97-152-17 à OT, et les fonds fédéraux de l&#39; National Cancer Institute, NIH, sous HHSN26120080001E du contrat.

1. Préparation de lysat cellulaire Ce protocole est destiné aux cellules adhérentes exprimant une protéine GFP fusionnée. Nombre de cellules nécessaire peut varier entre un minimum de 10 6 à moins de 20 x 10 6 cellules, en fonction du niveau d&#39;expression de la protéine. Par exemple, lysat de cellules HEK surexprimant GFP-STAT3 a été préparé par le traitement des cellules cultivées dans 10 flacons T75 à près de 70% de confluence avec le tampon de lyse 1 ml. Cependant, ce lysat devait être dilué 150 fois pour fournir un niveau optimal de fluorescence pour l&#39;expérience MST. protocole de lyse cellulaire dépend fortement des propriétés et la localisation intracellulaire de la protéine à l&#39;étude. Si vous utilisez des détergents n&#39;est pas souhaitable en raison de l&#39;instabilité des protéines, ultrasons décrit ci-dessous, pourrait être le meilleur choix. Différents additifs peuvent être ajoutés à la mémoire tampon de lyse pour éviter les réactions de modification de protéines: EDTA empêche la phosphorylation, le vanadate de sodium inhibe protéines phosphatases de tyrosine, de sorte quefluorure de sodium est un inhibiteur de Ser / Thr phosphatases. <ol><li> Préparer un tampon de lyse. Pour à extraire faciles protéines cytoplasmiques la composition suivante fonctionne bien: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, et un inhibiteur de protéase cocktail diluées 100 fois (Sigma-Aldrich P2714, composé de 2 mM AEBSF, 0,3 um aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 pm E-64, 1 uM leupeptine). Sinon, pour les protéines moins solubles, on peut utiliser un tampon RIPA commercial avec les inhibiteurs de protéase cocktail et des détergents non dénaturants. Gardez le tampon sur la glace. </li><li> Laver les cellules brièvement avec PBS glacé avec 10 ml de tampon par flacon T75. Gardez les cellules sur la glace pendant 5 min ou jusqu&#39;à ce que les cellules commencent à se détacher du flacon. Grattez les cellules avec un grattoir à cellules à se détacher si nécessaire. </li><li> Remettre les cellules dans 10 ml PBS glacé et transférer dans un tube à centrifuger pré-refroidi 14 ml de fond rond. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 400-600 xg à 4 ° C pendant 5 min. Combiner des cellules provenant de plusieurs flacons à ce point if nécessaire. </li><li> Retirer PBS surnageant et remettre le culot dans 200 ul de tampon de lyse glacé, le transfert de suspension à un pré refroidie 1,5 ml tube Eppendorf. </li><li> Gardez les cellules sur la glace pour réduire la surchauffe locale. Lyse des cellules avec 3x 10 sec impulsions de sonication à 30% d&#39;amplitude, à l&#39;aide d&#39;un 2-3 mm de pointe pré-réfrigérés. Gardez la pointe en dessous de la surface de minimiser l&#39;écume. Omettre cette étape en utilisant des produits contenant du tampon et incuber sur de la glace pendant 30 min à la place. </li><li> Corrigez la solution de lysat pour contenir la concentration de sérum physiologique (NaCl 100 mM), si nécessaire en utilisant 5 M de NaCl. </li><li> Recueillir lysats par centrifugation à environ 26.000 xg à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Déterminer la dilution du lysat optimal (tel que décrit dans la section 3 ci-dessous) et la quantité de lysat nécessaire pour une titration (généralement autour de 300 pl de lysat pré-dilué). </li><li> Aliquote du lysat et stocker à température appropriée pour la protéine à l&#39;étude (-80 ° C, dans la plupart des cas). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST sélection de la mémoire tampon et préparation <ol><li> Depuis les interactions protéine-ligand sont tributaires des conditions tampons, la composition du tampon MST est choisie en fonction des propriétés d&#39;un système particulier. Il est généralement avantageux de tester au moins deux tampons différents. </li><li> Préparer 2 tampons MST 5x. Nous avons eu de bonnes expériences avec ces deux compositions: HEPES (250 mM d&#39;HEPES, pH 7,4, MgCl2 25 mM, NaCl 500 mM, 0,25% de NP-40) et Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM; 50 mM de MgCl2, 0,05% de Tween-20). Ajout de BSA (5% dans le mélange liant final) peut aider à prévenir l&#39;adhérence des protéines à des tubes en plastique et en verre capillaires. NaN3 (0,5 mM) peut également être prévu pour empêcher la croissance de micro-organismes. </li></ol> 3. Détermination de la dilution de lysat optimale <ol><li> Sélectionnez la source d&#39;excitation LED avec la longueur d&#39;onde λ = 470 nm sur l&#39;instrument MST. </li><li> Chargez capillaires avec la CEll extrait dilué 2 et 10x avec un tampon MST. </li><li> Exécutez l&#39;opération &quot;Trouvez Capillaires&quot; sur le logiciel de contrôle d&#39;instrument MST. La plage optimale de fluorescence dans lysat dilué est de 400 à 1500 unités de fluorescence. </li></ol> 4. Détermination du ligand Optimal gamme de concentration <ol><li> La plus forte concentration du ligand doit être au moins 20 fois supérieure à la constante de dissociation attendue. </li><li> La concentration de ligand plus faible doit être inférieure à la concentration molaire de la protéine fluorescente. </li></ol> Reportez-vous à l&#39;outil de recherche Technologies de concentration NanoTemper pour l&#39;estimation de la gamme de concentration de ligand. 5. Préparation de lysat cellulaire et les dilutions de ligands <ol><li> Placer une grille de tube avec un nombre nécessaire (généralement 10-16) de 0,5 ml tubes à centrifuger de LoBind sur la glace. Pipette 25 ul de tampon MST au fond de chaque tube. Ajouter 25 pl de la solution mère de ligand à la première baignoiree (n ​​° 1, un ligand plus forte concentration) et d&#39;effectuer en série deux fois la dilution du ligand en utilisant le reste des tubes. Gardez le rack avec des échantillons de ligands sur la glace. </li><li> cellule de dégel lysat lentement sur la glace. </li><li> Diluer lysat cellulaire avec un tampon MST à fournir le niveau optimal de la protéine cible fluorescente dans les réactions de liaison. Concentration de protéine finale devrait être proche de prévue K D ou inférieur. Il doit être ajusté pour obtenir le numéro de compte nécessaire de fluorescence dans la solution finale. Pour la détermination de la GFP-STAT3 concentration dans le lysat, l&#39;instrument a été calibré avec une aide de fluorescéine. La concentration molaire de la GFP dans le lysat a été déterminée en utilisant respectivement le rapport de la fluorescéine et EGFP rendements quantiques, 0,85 et 0,61 15. </li></ol> 6. Microscale thermophorèse Etudes de liaison <ol><li> Sélectionnez la source d&#39;excitation LED avec λ = 470 nm sur l&#39;instrument MST. </li><li> Placer les tubes de 0,5 ml LoBind dans la tube porte en face de tubes avec des échantillons de dilution en série de ligands. Ajouter avec précaution 15 pl du lysat de cellules au fond de chaque tube. Essayez de ne pas toucher les parois du tube pour éviter la perte de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 15 ml de l&#39;échantillon de ligand avec la plus forte concentration (n ° 1) dans le tube correspondant n ° 1 avec le lysat cellulaire. Mélangez bien et changer une pointe de pipette. Répéter cette étape avec le reste des tubes à l&#39;exception de la dernière, qui doit contenir aucun ligand. </li><li> Ajouter 15 ul de tampon MST au dernier tube et bien mélanger. </li><li> Remplir environ 2/3 du premier capillaire avec le mélange de liaison de tubes n ° 1, inclinaison de se déplacer de la solution vers le centre, et de placer le tube capillaire sur le plateau capillaire à la position n ° 1 (la position la plus proche de l&#39;ouverture du bac) . Répétez cette étape avec le reste capillaires. Extrémités capillaires peuvent être branchés à la cire pendant de longues expériences. </li><li> Placez le bac à l&#39;intérieur de l&#39;instrument MST et fermer la porte de l&#39;appareil. </li><li> Effectuer &quot;Trouvez capillaires&quot;commande de laisser l&#39;instrument trouver les positions exactes des capillaires et mesurer la fluorescence des échantillons. </li><li> Sur la base de l&#39;intensité du signal de fluorescence, régler la puissance LED (10-100%) pour le mettre en 400-1,500 unités intervalle. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; pour réaliser l&#39;expérience de thermophorèse. Plus d&#39;une énergie laser infrarouge peut être choisie pour l&#39;expérience, afin de trouver le gradient de température optimale pour le système particulier. Collecter des données 2-3 pistes pour le même ensemble de capillaires afin d&#39;assurer la reproductibilité des mesures. Il faut 10-12 minutes pour exécuter une série de 16 capillaires. </li></ol> 7. Micro-analyse des données de thermophorèse <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse. </li><li> Chargez le dossier du projet. Dans les informations Run Viewer apparu sélectionner collectées à une puissance laser IR spécifiques courbes thermophorétiques. Il ya une option d&#39;ouvrir toutes les traces thermophorétiques recueillies dans diverses conditions telles que la puissance du laser IR, LED peurs, température, concentration, etc. à la fois, puis en choisissant toutes les courbes d&#39;analyse par les allumer et éteindre (cliquez sur le nom de l&#39;expérience). </li><li> Dans la fenêtre graphique des points d&#39;évaluation, sélectionnez le thermophorèse ou thermophorèse avec T-jump. Veiller à ce que les lignes bleues et rouges sont correctement positionnés. Pour obtenir les points moyens des écarts types, sélectionner &quot;Utiliser moyenne» ou «Distinguer tourne&quot; pour analyses différentes. </li><li> Pour tracer une forme constante de dissociation, sélectionner &quot;Utiliser moyenne&quot;, entrez et fixer la valeur de la concentration en molécule marquée (cochez la case «concentration» dans le menu de la fenêtre en forme), et ajuster la courbe. La valeur K D avec son écart-type apparaît dans une dénonciation distincte fenêtre pop-up. Pour tracer un ajustement par la méthode Hill, sélectionnez &quot;moyenne&quot;, méthode Hill, puis ajuster la courbe. La valeur d&#39;affinité EC 50 avec son écart-type est indiqué dans ce cas. La caractéristique de K D ou Hill &quot;frontière&quot; peut également être utilisé lorsque la saturationdans un état lié n&#39;est pas atteint. </li><li> Sauvegarder les données d&#39;ajustement moyens dans un fichier texte et transférer vers Excel. </li><li> Terrain F norme (fluorescence normalisée), AF norme (différence de fluorescence normalisée si différentes expériences sont comparées), ou fraction liée (voir formule ci-dessous) en fonction de la concentration en molécule non marquée (titré). </li></ol> Fraction liée (fraction de molécules dans un complexe) = (Therm (C) non lié) / (lié non lié), où Therm (C) est thermophorèse mesuré la concentration C, liée est thermophorèse pour l&#39;état non lié (lorsque les molécules sont pas dans un complexe), et lié est thermophorèse pour l&#39;état complètement lié.

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Le contenu de cette publication ne reflètent pas nécessairement les vues ou la politique du Département des services de santé et humains, ni mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n&#39;implique pas l&#39;approbation par le gouvernement américain.

expression et purification de protéines est une étape laborieuse et coûteuse, ce qui est, cependant, nécessaire pour la détermination de K D interactions par la méthode la plus couramment utilisée. Application des MST permet d&#39;éviter la purification de protéines ce qui simplifie considérablement l&#39;accélération et la caractérisation quantitative des interactions. Il présente des avantages particulièrement importants dans le cas de difficile à exprimer et purifier des protéines telles q...

Caractérisation quantitative de l&#39;affinité des interactions intermoléculaires est important dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale. Reliure constante de dissociation (K D) est essentiel non seulement dans la découverte de médicaments, mais est également un paramètre important dans la caractérisation d&#39;une interaction binaire dans un système biologique. Méthodes biochimiques utilisées pour la détection des interactions protéine-protéine, comme immunoprécipitation et de la levure de deux écrans hybrides, ne nous informent pas sur la façon dont ces interactions sont serrés, tout en affinité définit si ce complexe particulier existe dans des conditions données in vivo. En processus de découverte de médicaments, le développement de test de liaison est l&#39;un des nécessaire et fréquemment étapes les plus fastidieuses. La plupart des méthodes couramment utilisées pour la détermination K D incluent la polarisation de fluorescence, 1 surface technologie résonance de plasmon (SPR), 2 radioligand contraignant, 3 isotherme calorimétrie de titration, 4 Equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 et ultracentrifugation (UC). 6 Chacun d&#39;entre eux nécessitent des quantités importantes de protéine cible purifiée. Thermophorèse Microscale (MST) est un procédé en plein développement qui détecte un mouvement dirigé de molécules dans un gradient de température microscopique. Toute modification de la couche d&#39;hydratation des biomolécules entraînent un changement relatif du mouvement le long du gradient de température. 7 MST est utilisé pour déterminer les affinités de liaison et a été appliquée pour l&#39;étude de la liaison du ligand à des protéines marquées par fluorescence ou ligands fluorescents pour une protéine cible. 8, 9 MST permet de mesurer les interactions directement en solution sans la nécessité d&#39;immobilisation sur une surface (immobilisation sans technologie). Pratiquement, toute liaison est accompagnée d&#39;un changement dans le signal MST, même si la taille du changement diffère d&#39;un système à façon significative. Pour la détection de mouvement de la molécule par MST, ils doivent être fluorescentnt. Cette limitation majeure de la méthode peut être transformé en un avantage. Si une protéine est exprimée comme une fusion de la GFP dans tout système, il sera la seule molécule fluorescente et peut donc être étudié sans les isoler du lysat cellulaire ou un système d&#39;expression acellulaire. Génération de lysats de cellules qui permettent de conditions contraignantes avec le minimum d&#39;artefact est le défi majeur. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lysat cellulaire et l&#39;expérimentation MST qui peut être utilisé pour de nombreuses protéines solubles et membranaires. Protéines STAT sont latents facteurs de transcription cytoplasmiques activés par phosphorylation sur tyrosine en réponse à des signaux extracellulaires et sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, y compris l&#39;immunité, l&#39;hématopoïèse, l&#39;inflammation et le développement. 10 Chez les mammifères, la famille STAT se compose de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B et 6. Toutes les stats activés sont connus pour se lier à la même séquence d&#39;ADN, dite motif de GAZ, IFN-gamma activé séquence. Toutefois, le transcriptionnel effets de différentes stats sont très différents. 11 En dépit de l&#39;implication dans de nombreux processus pathologiques et des études approfondies produisant plus de 17.000 publications, le K D d&#39;interactions STAT avec différentes séquences d&#39;ADN n&#39;ont pas été déterminées. Seulement affinité relative des différentes variantes de stats pour motif de gaz a été caractérisé. 11 Difficultés d&#39;expression et purification des protéines sont les principaux obstacles à la caractérisation de sélectivité de liaison de l&#39;ADN stats. Bien que la majorité des études se sont concentrées sur le rôle des stats &quot;activés&quot;, qui est devenu synonyme de facteur de transcription Tyr phosphorylée, le rôle de STATS non phosphorylée (U-STAT) dans la régulation de la transcription émerge rapidement. 12 Cependant, ces mécanismes sont encore mal compris, et il était difficile de savoir si U-stats lie effectivement à l&#39;ADN ou d&#39;agir à travers des interactions avec d&#39;autres facteurs de transcription. Nous avons récemment montré que U-STAT3 peut se lier à l&#39;ADN séquentielleCES différente de motifs de gaz avec une affinité encore plus élevé 13. L&#39;découverte a des implications importantes pour notre compréhension des fonctions biologiques de cette protéine importante. Nous avons appliqué thermophorèse microscopique afin de déterminer les affinités relatives de STAT3 au gaz et au riche oligonucléotide S +100 (Figure 4). Protocole pratiquement identique a été utilisée pour la détermination de K D pour la liaison d&#39;un ligand STAT3 différent, un inhibiteur de lipopeptides. 14 Aucune liaison pour un facteur de transcription liée, GFP-STAT1 qui a été utilisé comme contrôle négatif a pu être détecté confirmant ainsi la sélectivité d&#39;interaction. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caractérisation quantitative des interactions protéine est essentielle dans pratiquement tous les domaines des sciences de la vie, en particulier la découverte de médicaments. La plupart des méthodes actuellement disponibles de détermination K D nécessitent un accès à la protéine d&#39;intérêt, la production de ce qui peut être fastidieux et coûteux purifiée. Nous avons mis au point un protocole qui permet de déterminer l&#39;affinité de liaison par thermophorèse microscopique (MST) sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le procédé implique une surexpression de la protéine GFP-condensé et la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes. Application de la méthode de STAT3-GFP exprimé de manière transitoire dans les cellules HEK293 ont permis de déterminer pour la première fois l&#39;affinité du facteur de transcription bien étudiée pour des oligonucléotides avec des séquences différentes. Le protocole est simple et peut avoir une variété d&#39;applications pour l&#39;étude des interactions des protéines avec de petites molécules, les peptides, ADN, ARN, et proteins.

Mesure de l&#39;affinité de non-phosphorylée protéine STAT3 liaison à oligonucléotides. Cellules HEK293 exprimant STAT3-GFP ont été utilisés comme source d&#39;marqué par fluorescence STAT3 pour dosage de liaison ADN. lysats cellulaires ont été préparés en utilisant un tampon RIPA (20x10 6 cellules / ml). Pour les études de liaison, les lysats ont été dilués 150x avec MST tampon liaison à l&#39;ADN pour assurer le niveau optimal de la protéine fluo...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l&#39;affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

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Research

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Biology

30.3K vues.  National Cancer Institute. Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...