La thermophorèse à micro-échelle marquée permet d’obtenir efficacement des constantes de dissociation, ou KD, de diverses interactions biochimiques. Ce protocole et la vidéo accompagnée donnent l’affinité approximative de Vam7, la seule protéine SNARE soluble dans la levure, à l’acide phosphatidique. C’est ainsi que Vam7 s’associe à deux membranes avant d’interagir avec d’autres protéines.
Cette méthode permet d’obtenir rapidement des KD pour diverses interactions biochimiques à faible coût, avec une reproductibilité élevée et un coût protéique minimal. Cette technique convient au développement pharmaceutique de première étape, permettant d’obtenir facilement des KD pour déterminer les composés principaux potentiels. Avant de commencer une analyse, allumez l’interrupteur d’alimentation à l’arrière du périphérique MST et ouvrez le logiciel de contrôle.
Vérifiez que l’ordinateur est connecté au périphérique et à l’état connecté et définissez le MST Before sur 3 secondes, le MST sur 30 secondes et le Fluorescence Recovery sur après 1 seconde. Pour chaque tube capillaire, entrez le nom du ligand cible, le nom de l’analyte ligand, la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée à l’aide du rapport de titrage automatique. Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez des valeurs pour chaque puissance afin de tester l’ajustement de liaison le plus robuste.
Pour préparer des échantillons MST marqués, diluer une solution de Vam7-octahistidine à une concentration de 200 nanomolaires et un colorant NTA-Atto 647 à une concentration de 100 nanomolaires, tous deux dans pbS. Mélanger le Vam7-octahistidine et le colorant NTA-Atto 647 à un rapport volumétrique de 1:1 et laisser le mélange reposer à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez le mélange de colorant et de protéines et conservez la solution à 4 degrés Celsius jusqu’à quelques heures avant utilisation.
Ensuite, préparez l’échantillon, prenez le ligand teint et exposez l’analyte. Pour la thermophorèse à micro-échelle de l’échantillon, ouvrez l’appareil et faites glisser le rack capillaire. Chargez les capillaires d’échantillon dans le rack avec la concentration la plus élevée à la première position et sélectionnez le canal rouge dans le logiciel de contrôle.
Ensuite, chargez le rack dans l’instrument. Sélectionnez ensuite une plage de puissance MST et démarrez la mesure MST Cap Scan et évaluez la réponse au changement de vitesse. Les traces thermophorétiques d’un essai d’un titrage 1:1 de DiC8 PA à partir de 500 micromoles contre 50 nanomolés NTA-Atto 647 marqués domaine Vam7 sont montrées ici.
La fluorescence initiale, le saut dans le temps et la thermophorèse peuvent être observés, ce qui permet de calculer KD à partir de l’une ou d’une combinaison de ces mesures. Une courbe de saturation peut être tracée à partir de ces résultats, par exemple, pour la thermophorèse avec la sortie de saut dans le temps, comme illustré dans le graphique. Généralement, les résultats MST sont déterminés à l’aide d’une échelle logarithmique, en tenant compte de la concentration en protéines pour déterminer l’affinité de liaison en sélectionnant le modèle KD et en entrant la concentration en protéines.
Lors de l’exécution de ce protocole, assurez-vous que la solution est au centre du capillaire et qu’il n’y a pas de bulles d’air et que le capillaire n’a pas de poussière ou de solution à l’extérieur du capillaire. La calorimétrie de titrage isotherme ou la résonance plasmonique de surface pourraient être utilisées pour valider la KD expérimentale obtenue. S’il existe une liaison coopérative potentielle, l’ITC serait la prochaine méthode logique exécutée, compte tenu des ressources.
Cette technique a permis aux chercheurs en biologie traditionnelle d’intégrer des techniques de dépistage biophysique dans leurs recherches pour déterminer les relations entre les voies. Un exemple de cette technique est la lysase cellulaire avec la protéine cible exprimée de manière endogène, où la balise GFP est une nouvelle façon d’effectuer un test traditionnel de traction.
