Ce travail a été soutenu par le Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund du Comprehensive Cancer Center de l’Université du Michigan et en partie par la subvention CA82529 des NIH et la Gillson Longenbaugh Foundation.

1. Coloration ALDEFLUOR
<ol><li>Préparation d’échantillons cellulaires: Préparez une suspension unicellulaire de cellules tumorales, soit à partir de cellules tumorales cultivées, soit à partir d’échantillons tumoraux fraîchement récoltés. Comptez les cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/ml dans aldefluor assay buffer.</li>
	<li>Étiqueter quatre tubes à essai en polystyrène de 12 mm x 75 mm comme tubes de commande comme suit : #1 : Non coloré, #2 : ALDEFLUOR, #3 : ALDEFLUOR plus DEAB et #4 : 7AAD.</li>
	<li>Pour ces tubes de commande, placez 1 ml de suspension cellulaire dans #1 et #4, mais 2 ml dans le tube #2. Ajouter 5 μl de DEAB (inhibiteur de l’ALDH) dans le tube #3 et garder sur la glace. Ajoutez ensuite 10 μl de substrat ALDEFLUOR activé sur le tube #2, mélangez et transférez immédiatement 1 ml du mélange sur le tube #3.</li>
	<li>Dans le même temps, ajoutez 2 μl de substrat ALDEFLUOR activé par million de cellules au reste des cellules (tubes d’échantillon) également à 1 x 106 cellules / ml dans le tampon d’analyse ALDEFLUOR.</li>
	<li>Incuber à la fois les 4 tubes de commande et les tubes d’échantillonnage pendant 30 min au bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Après incubation, ajouter 5 μl 7AAD dans le tube témoin #4 et 1 μl 7AAD 1 x 106 cellules au tube de l’échantillon. Incuber 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 250 x g et enlever le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter les cellules dans le tampon d’analyse ALDEFLUOR.</li>
	<li>Effectuez un tri basé sur la cytométrie de flux.</li>
	<li>Définissez les portes de tri à l’aide de cellules colorées par ALDEFLUOR traitées avec deAB comme témoin négatif et des cellules colorées à l’iodure de propidium (PI) 7AAD pour le contrôle de la viabilité. Basé sur ces contrôles, une porte a été établie pour distinguer les cellules aldefluor+/ALDHélevées,D5 et SCC7. Ces portes seront ensuite utilisées pour trier toutes les cellules d’échantillon préparées ci-dessus pour les cellules ALDEFLUOR+/ALDHhaute D5 et SCC7.</li>
</ol>2. Préparation du vaccin à cellules dendritiques à impulsions de lysat de cellules souches cancéreuses (CSC-TPDC)
<ol><li>Euthanasier des souris (syngénétique B6 et C3H, respectivement) en utilisant du CO2 et isoler les os du fémur et du tibia.</li>
	<li>Mettez les os dans de l’éthanol à 75% pendant 1 min à température ambiante. Ensuite, lavez les os à l’aide de HBSS.</li>
	<li>Coupez la tête des os et utilisez une aiguille de 21 G et une seringue de 10 ml pour pousser les cellules dans une boîte.</li>
	<li>Aspirer et souffler les cellules à l’aide de la seringue pour faire la suspension à cellule unique.</li>
	<li>Après centrifugation à 1 500 tr/min pendant 5 min, jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 5 ml de tampon de lyse RBC à la lyse du GLOBULE ROUGE pendant 1 min au bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 million de cellules/ml en milieu complet (CM) contenant 10 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Culturez les cellules et compensez cm plus IL-4 et GM-CSF 3 jours plus tard.</li>
	<li>Au 5e jour, récolter les cellules dendritiques immatures (DC) et préparer le milieu d’isolement DC contenant 4,2 ml de solution C plus 1 ml de milieu gradient de densité OptiPrep.</li>
	<li>Suspendre les pastilles cellulaires dans 5 ml CM. Ajouter lentement la suspension cellulaire sur le milieu d’isolement. Centrifuger à 2 000 tr/min à température ambiante.</li>
	<li>Collectez les DCs entre le CM et le support d’isolation. Comptez le nombre de cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 million de cellules/ml dans un milieu de culture contenant 10 ng/ml gm-CSF et 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Préparer des lysats tumoraux en suspendant des cellules D5 ou SCC7aldh élevées ou non triées dans un milieu de culture et soumises à des expositions rapides au gel-dégel quatre fois suivies d’une rotation à ∼100 x g pendant 5 min pour recueillir la partie membranaire des lysats.</li>
	<li>Pour préparer CSC-TPDC, pulsez les DC avec le lysat des cellulesélevées autologues d’ALDH. Pour préparer H-TPDC, pulsez les DCs avec le lysat hétérogène non trié de cellules de tumeur. Le rapport de DC au lysat de cellules de tumeur est le même.</li>
</ol>3. Vaccination et évaluation de l’efficacité
<ol><li>Vacciner les souris B6 normales respectivement avec 2 500 cellules tumorales D5 CSC-TPDC ou D5 H-TPDC par voie sous-cutanée (s.c.). Vacciner les animaux C3H normaux s.c. avec 5 000 cellules tumorales SCC7 CSC-TPDC ou SCC7 H-TPDC, respectivement.</li>
	<li>Après la vaccination, défiez les souris B6 avec les cellules tumorales hétérogènes D5 i.v. Euthanasier les souris en utilisant le CO2 20 jours plus tard. Récoltez les poumons et énumérez les métastases pulmonaires.</li>
	<li>Dans le modèle SCC7, défiez les souris C3H avec des cellules tumorales SCC7 non triées s.c du côté opposé du vaccin DC. Surveillez la taille de la tumeur.</li>
	<li>A la fin des expériences euthanasier les souris B6 et C3H en utilisant du CO2. Au jour 34 après le premier vaccin, euthanasier les souris avec du CO2, et en même temps recueillir la rate de chaque groupe avec une procédure aseptique.</li>
	<li>Activer les cellules T et/ou B de rate avec des mAbs anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés dans le CM contenant hrIL-2 ou LPS plus l’ascite anti-CD40 (FGK45) mAb.</li>
	<li>Après l’activation, recueillir des surnageants et l’utiliser pour le test ELISA.</li>
	<li>Pour le test ELISA, enrober les plaques d’anticorps pour IFNγ, GM-CSF et IgG à 4 °C O/N.</li>
	<li>Après l’application du tampon de blocage, ajoutez des échantillons et des étalons et incuber à température ambiante.</li>
	<li>Lavez la plaque et ajoutez des anticorps de détection HRP et un substrat TMB pour l’incubation.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance sur un lecteur de plaque ELISA à 450 nm dans les 30 minutes après l’arrêt de la réaction.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL Technologies a soutenu les frais de publication en libre accès.

Les hôtes immunodéprimés, tels que les souris SCID, empêchent les évaluations immunologiques des CSC en raison du manque d’immunité adaptative chez les hôtes. Dans cette étude, nous avons évalué l’immunogénicité de CSCs dans les centres serveurs immunocompetent, qui pourraient plus étroitement imiter des arrangements patients. Les CSC enrichis sont immunogènes et pourraient induire une immunité protectrice tumorale plus efficace lorsque leurs lysats sont chargés dans les CD en tant que vaccin par rapport aux CD lysat-pulsés de cellules tumorales non sélectionnés.  Mécaniquement, la protection a été conférée par l’induction sélective d’anticorps csc-réactifs et de cellules T8 ainsi que la production de cytokines de type 1, par exemple IFNγ et GM-CSF.
La plupart des immunothérapies actuelles, y compris les vaccins à base de cellules dendritiques et le transfert de lymphocytes T adoptifs, sont conçues pour cibler les antigènes différenciés par tumeur. Les CSC, qui peuvent ne pas exprimer ces antigènes différenciés, peuvent donc échapper à ces ciblages immunologiques. En revanche, le vaccin CSC conçu pour cibler spécifiquement les cellules souches cancéreuses peut détruire cette population spéciale de cellules cancéreuses et ainsi améliorer l’efficacité thérapeutique du vaccin en prévenant la rechute tumorale et les métastases.
Dans les cellules cultivées de tumeur et les tumeurs fraîchement moissonnes, nous avons identifié la population CSC-enrichie par l’écoulement cytometry basé sur l’activité élevée de déshydrogénase d’aldéhyde. De telles cellulesélevées d’ALDH pourraient être isolées par tri de flux pour être utilisées comme source d’antigènes pour pulser DC pour générer des CSC-TPDC. La comparaison utilisant des cellulesélevées d’ALDH isolées à partir de cellules tumorales cultivées par rapport à des tumeurs fraîchement récoltées n’a démontré aucune différence significative dans le terme de l’induction de l’immunité anti-CSC8. Ces résultats ont indiqué le potentiel d’employer CSCs d’isolement dans les cellules cultivées de tumeur ou des tumeurs fraîchement moissonnes pour l’application clinique.
Pour être cliniquement pertinent, un vaccin doit être examiné dans un contexte thérapeutique. Ces expériences sont maintenant réalisées dans notre laboratoire.

Les cellules souches cancéreuses sont relativement résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie conventionnelles1,2. D’autre part, cette population de cellules pourrait être les cellules responsables de la rechute et de la progression des cancers après les thérapies anticancéreuses traditionnelles1-4. En raison du manque d’expression des antigènes tumoraux différenciés sur les cellules souches cancéreuses, les cellules souches cancéreuses peuvent échapper aux interventions immunologiques actuelles de la thérapie contre le cancer, qui sont principalement conçues pour cibler les antigènes sur les cellules tumorales différenciées. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles stratégies ciblant et détruisant spécifiquement les cellules souches cancéreuses pourrait promettre d’accroître l’efficacité thérapeutique du traitement actuel du cancer. À cette fin, nous avons isolé des populations enrichies de cellules souches cancéreuses (CSC) de deux tumeurs animales (mélanome D5 et cancer épidermoïde SCC7), et nous les avons utilisées comme source d’antigène pour pulser les cellules présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques, DC) pour préparer le vaccin CSC-TPDC. Nous avons ensuite évalué l’immunité antitumorale induite par le vaccin CSC-TPDC chez les hôtes immunocompétents syngéniques, les souris B6 et les souris C3H respectivement. L’efficacité antitumorale induite par CSC-TPDC a été comparée au vaccin DC traditionnel pulsé avec du lysat provenant de cellules tumorales hétérogènes non triées (H-TPDC), qui a déjà été utilisé par notre groupe5,6, ainsi que par d’autres chercheurs7 à la fois dans des études précliniques et dans des essais cliniques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

Nous avons identifié des populations enrichies de cellules souches cancéreuses (CSC) du mélanome murin D5 syngénéique à des souris C57BL/6 et du cancer squameux SCC7 syngénéique aux souris C3H en utilisant ALDEFLUOR/ALDH comme marqueur, et testé leur immunogénicité en utilisant le lysat cellulaire comme source d’antigènes aux cellules dendritiques de pouls (DCs). DCs pulsé avec des lysatsélevés d’ALDH CSC induit une immunité antitumorale protectrice sensiblement plus élevée que le DCs pulsé avec les lysats des lysats entiers non triés de cellules de tumeur dans les deux modèles et dans un arrangement de métastase de poumon et un s.c. arrangement de croissance de tumeur, respectivement. Ce phénomène était attribuable aux réactions humorales et cellulaires anti-SCC induites par le vaccin du SCC. En particulier, les splénocytes isolés de l’hôte soumis au vaccin CSC-DC ont produit une quantité significativement plus élevée d’IFNγ et de GM-CSF que les splénocytes isolés de l’hôte soumis au vaccin lysat de cellules tumorales non triés pulsé-DC. Ces résultats appuient les efforts visant à mettre au point un vaccin thérapeutique autologue à base de CSC à usage clinique en milieu adjuvant.

ALDEFLUOR/ALDH a été utilisé comme marqueur unique pour isoler les cellules souches dans de multiples tumeurs malignes8-11. Nous avons identifié des populations enrichies de cellules souches cancéreuses dans deux modèles tumoraux D5 et SCC7 en utilisant ALDEFLUOR comme marqueur. Nous avons détecté les cellules d’ALDEFLUOR+ dans le mélanome murin B16-D5 et le cancer de cellules squamous SCC7. Nous avons constaté que les cellules ALDEFLUOR+ contribuent à environ 0,5% et 5,2% dans les lignées cellulaires tumorales D5 et SCC7 cultivées, respectivement (Figure 1). Des cellules fraîchement récoltées de tumeur des tumeurs établies ont été analysées pour confirmer l’existence des cellules d’ALDEFLUOR+. Comme le montre également la figure 1,il y avait 2,5% et 4,2% des cellules ALDEFLUOR+ provenant de tumeurs D5 et SCC7 établies in vivo, respectivement. La tumorigénicité et la capacité d’auto-renouvellement de ces populationsélevées triées D5 et SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH ont été évaluées chez l’hôte immunocompétent syngénéique, les souris C57BL/6 et C3H, respectivement8.
Nous avons utilisé le lysat hétérogène de cellules tumorales non triées pour pulser les DCs (H-TPDC) à la fois dans les études animales et dans les essais cliniques5,6. Pour examiner l’immunogénicité des CSC, nous avons isolé le CSCélevé d’ALDH et pulsé le DC avec le lysat des CSC pour générer le CSC-TPDC (figure 2) et avons employé H-TPDC comme contrôle conventionnel de vaccin contre le cancer pour tester si CSC-TPDC a n’importe quel effet bénéfique en empêchant la croissance de tumeur.
Nous avons évalué l’immunogénicité de CSCs en examinant l’immunité antitumorale protectrice induite par CSC-TPDC. Dans le modèle D5, des souris immunocompétentes naïves ont été vaccinées s.c avec CSC-TPDC ou H-TPDC (au même rapport lysat: DC). Les groupes témoins ont reçu une solution saline (PBS). Une semaine après le dernier vaccin, les souris ont été contestées avec des cellules non triées de tumeur D5 intraveineusement(i.v.),et les poumons ont été moissés 3 semaines plus tard pour énumérer des métastases de poumon. Comme le montre le tableau 1,comparativement au groupe PBS, les souris traitées avec le H-TPDC ont développé moins de métastases pulmonaires. Il est important de noter que les souris traitées par CSC-TPDC présentaient significativement moins de métastases pulmonaires que le groupe vaccinal H-TPDC dans les deux expériences réalisées. Dans le modèle SCC7, les animaux C3H normaux ont été vaccinés s.c avec SCC7 CSC-TPDC ou H-TPDC respectivement sur le flanc droit, suivis de défier avec les cellules non triées de tumeur SCC7 s.c dans le flanc gauche. Comparé au groupe de PBS, H-TPDC a induit l’immunité anti-tumorale modeste contre la croissance de tumeur. Cependant, il y avait une inhibition significative de la croissance tumorale chez les souris qui ont été traitées avec CSC-TPDC par rapport au groupe témoin et au groupe H-TPDC (p<0,05, figure 3). Ces résultats indiquent que CSCs pourrait être employé comme source plus efficace d’antigène pour charger des DCs que les cellules non triées traditionnelles de tumeur en induisant l’immunité protectrice contre le défi des cellules de tumeur.
Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’immunité antitumorale protectrice causée par CSC observée, nous avons récolté la rate des animaux soumis aux vaccinations de DC à la fin des expériences. Les cellules de rate ont été alors activées par anti-CD3/CD28/IL-2 ou anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Ensuite, les surnageants de culture ont été collectés pour détecter l’expression des cytokines et des anticorps.  Les productions d’IFNγ et de GM-CSF par les cellules de la rate ont été significativement plus élevées chez les animaux vaccinés avec D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC (Figure 4). En outre, il y avait significativement (p<0,05) production plus élevée d’IgG par les cellules de rate activées par LPS/anti-CD40 recueillies chez les animaux vaccinés avec D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC par rapport à D5 H-TPDC ou SCC7 H-TPDC. Ces anticorps se sont avérés pour se lier à D5 et SCC7 CSCCS respectivement, et une telle liaison pourrait avoir comme conséquence la lyse CSC en présence du complément8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figure 1. Des populationsélevées d’ALDHFLUOR+/ALDH ont été détectées dans cultivée aussi bien que le mélanome murin frais nouvellement récolté D5 et les tumeurs squamous SCC7 de cellules. Des cellules de tumeur traitées avec 50 mmol/L DEAB, un inhibiteur spécifique d’ALDH, ont été employées comme commande négative.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figure 2. Génération de vaccins à base de cellules souches cancéreuses à base de cellules dendritiques. Pour la préparation de CSC-TPDC et de H-TPDC, des cellules dendritiques moelle-dérivées ont été pulsées avec des lysatsélevés ou non triés de cellules de tumeur d’ALDH, respectivement.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figure 3. Le vaccin CSC-TPDC (CSC-TPDC) lysat pulsé pourrait induire une immunité antitumorale protectrice plus efficace dans le s.c. Modèle de tumeur SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figure 4. Réponses cellulaires systémiques plus puissantes chez l’hôte immunocompétent vacciné par CSC-TPDC.  Des splénocytes ont été récoltés à partir des animaux soumis à la vaccination H-TPDC ou CSC-TPDC, et ont été activés comme indiqué. Les surnageants de culture ont ensuite été collectés pour la détection des cytokines à l’aide d’ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

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Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Évalué chez des hôtes immunocompétents syngéniques, le vaccin à base de cellules dendritiques (DC) à base de cellules souches cancéreuses (CSC) a démontré une immunité antitumorale significativement plus élevée que les vaccins DC traditionnels pulsés avec des cellules tumorales en vrac hétérogènes.

Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K vues.  University of Michigan. Évalué chez des hôtes immunocompétents syngéniques, le vaccin à base de cellules dendritiques (DC) à base de cellules souches cancéreuses (CSC) a démontré une immunité antitumorale significativement plus élevée que les vaccins DC traditionnels pulsés avec des cellules tumorales en vrac hétérogènes.

Vidéo: Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

L&#39;analyse de la maturation des cellules dendritiques pulmonaire et de la migration au cours de l&#39;inflammation allergique des voies respiratoires

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

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Immunologie et infection

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l&#39;imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Cellules T d&#39;enrichissement de cellules automatisé de cytomégalovirus spécifique pour des applications cliniques utilisant le système de capture de cytokine

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...