Les auteurs remercient le Professeur M. Dietel et Dirk Schumacher pour soutenir ce travail et la lecture critique du manuscrit. Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de l&#39;entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 115234, les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les entreprises EFPIA »dans contribution en nature. Ce travail a également été soutenue par le Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

Le schéma global de l&#39;expérience, y compris la préparation des primaires simples cellules du tissu tumoral, la caractérisation de la culture cellulaire primaire, l&#39;épuisement des fibroblastes et le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome est illustré à la figure 1. 1. Acquisition d&#39;échantillon <ol><li> Vérifiez l&#39;approbation éthique avant d&#39;envisager les prochaines étapes. </li><li> Préparer un tube de 50 ml avec du PBS stérile additionné de 1% de pénicilline-streptomycine concentration finale et le remettra à la chirurgie ou l&#39;équipe. </li><li> Organiser le transport rapide de tissu tumoral à partir de la chirurgie de laboratoire de culture cellulaire à 4 ° C. </li></ol> 2. Préparation primaires mélanome simples cellules de tissus tumoraux <ol><li> Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. </li><li> Avant la résection de la tumeur, il faut préparer le mélange de dissociation. 10 ml de dissociation mélange par 4.2 g de tissu est nécessaire. Le mélange peut être utilisé imméTely ou stockés dans aliquotes de 10 ml à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. <ol><li> Préparer une solution contenant 150 mM de chlorure de sodium. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que la solution soit limpide. Si nécessaire stérile de chlorure de sodium solution de filtrat en utilisant un filtre de 0,22 um. </li><li> Peser la DNase I et de préparer une solution contenant 10 mg / ml de DNase I dans du chlorure de sodium 150 mM. Mélanger en retournant jusqu&#39;à ce que la solution soit limpide. </li><li> Préparer une solution contenant 100mg/ml collagénase IV dans du PBS. Mélanger en retournant jusqu&#39;à ce que la solution soit limpide. Des aliquotes de solution de collagénase peut être conservé à -20 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Préparer le mélange de dissociation avec une concentration finale de 1% de pénicilline-streptomycine, 1 mg / ml de collagénase IV et 0,1 mg / ml de DNase I dans Quantum 263 à moyen terme. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex. En option: lors de l&#39;utilisation des tissus provenant de mélanome cutané ajouter une solution d&#39;amphotéricine B pour la dissociation de mélange une concentration finale de 1,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B. </li></ol></li><li> Préchauffer le required quantités de dissociation mélange, PBS et 263 Quantum moyenne à 37 ° C. </li><li> Tissu tumoral lieu sur une boîte de Pétri stérile. Aspirer la solution excessive du tissu et ajouter 500 ul mélange de dissociation. Mince tumeur en petits morceaux de 2-4 mm en utilisant fraîches, scalpels stériles. </li><li> Transfert 2-4 g hachée tissu tumoral dans un tube gentleMACS C contenant 5 ml de dissociation mélange. Rincer boîte de Pétri avec supplémentaire de 4,5 ml mélange de dissociation et d&#39;ajouter des fragments de tissu restant sur le tube de gentleMACS C. </li><li> Fermer gentleMACS C tube et le fixer à l&#39;envers sur le manchon de la Dissociator gentleMACS. Exécutez le programme gentleMACS &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li> Détachez le tube gentleMACS C de la dissociateur et incuber l&#39;échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue avec le Rotator Tube MACSmix sur la plus grande vitesse d&#39;exécution (12 min) ou en tournant le tube manuellement toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les fragments de tissus sont installés . </li><li> Fixez gentleMACS C tube renversé sur la douille de til gentleMACS Dissociator et exécutez le programme gentleMACS &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li> Détachez le tube gentleMACS C de la dissociateur et incuber l&#39;échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue avec le Rotator Tube MACSmix sur la plus grande vitesse d&#39;exécution (12 min) ou en tournant le tube manuellement toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les fragments de tissus sont installés . </li><li> Fixez gentleMACS C tube renversé sur le manche de la Dissociator gentleMACS et exécutez le programme gentleMACS &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li> Détacher le tube gentleMACS C du dissociateur, remettre en suspension d&#39;échantillon et d&#39;appliquer la suspension de cellules à une crépine 70 um cellule placée sur un tube de 50 ml. Si le colmatage du filtre se produit, mélanger la suspension cellulaire avec un embout stérile filtre jusqu&#39;à ce que la suspension complète traversait. </li><li> Rincer la crépine cellule avec 5 ml de milieu Quantum 263. </li><li> Facultatif: si vous avez encore des fragments de tissus laissés dans le filtre, les fragments de remettre en suspension dans 263 Quantum moyennes et les graines dans une culture cellulaire appropriée dish. Incuber les fragments à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Jeter tamis cellulaire et fermer le tube de 50 ml de la suspension cellulaire digéré. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 300 xg et éliminer le surnageant. </li><li> Facultatif: si culot cellulaire apparaît en rouge en raison d&#39;une grande quantité de globules rouges préparer 1x Solution lyse des globules rouges par dilution de 1:10 solution 10x dans de l&#39;eau bidistillée, remettre en suspension culot cellulaire dans 500 ul de PBS et ajouter 5 ml 1x lyse de globules rouges Solution. Vortex 5 secondes et incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger pendant 5 min à 300 xg et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules tumorales avec Quantum 263 et épépiner les cellules dans le flacon de culture cellulaire appropriée. Cellules tumorales de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 et de cellules de passage systématiquement quand ils atteignent 80% de confluence. </li></ol> 3. Caractérisation de la culture cellulaire primaire et l&#39;appauvrissement des fibroblastes <ol><li> Analyser culture primaire de cellules phénotypiquement l&#39;aide d&#39;un microscope. </li><li> Récolter une petite quantité (0,5 x 10 6 cellules) de la culture de cellules primaires et effectuer RT-PCR avec des amorces pour néoplasiques-, le mélanome, les cellules souches-et-gènes marqueurs de cellules du stroma. Les gènes les plus importants à analyser sont CD90 (marqueur des fibroblastes), TYR (mélanome / marqueur mélanocytes), CD133 (marqueur de cellules souches du cancer), CD83 (marqueur des cellules dendritiques matures) et un gène de ménage (par exemple HPRT ou GAPDH). </li><li> Si l&#39;analyse microscopique et une expression élevée de CD90 au cours de RT-PCR a révélé une forte contamination de la culture mélanome primaire de fibroblastes, vous avez besoin d&#39;épuiser les fibroblastes en utilisant les microbilles anti-fibroblastes et des colonnes D à partir de Miltenyi. </li></ol> 4. Le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome utilisation des colonnes LS <ol><li> Préparer un tampon MACS contenant 2 mM d&#39;EDTA et 5% de FCS dans PBS. Mélanger par inversion et tampon stérile en utilisant un filtrat de 0,22 um Steritop-GP Unité de filtration. Tampon froid à 4-8 ° Cet dégazer avant utilisation. </li><li> Préchauffer Accutase, PBS et 263 Quantum moyenne à 37 ° C. </li><li> Lavez 80% des cellules confluentes avec du PBS. Ajouter la quantité appropriée de Accutase et incuber jusqu&#39;à ce que les cellules se détachent de la surface de culture. Prélever des cellules dans un tube de 50 ml à l&#39;aide Quantum 263 à moyen terme. </li><li> Déterminer le nombre de cellules et centrifuger le nombre requis de cellules (Selon le protocole Miltenyi du nombre maximum de 2x 10 9 cellules peuvent être chargées par la colonne LS. Lignée de cellules spécifiques nombre optimal doit être déterminé et peut être beaucoup plus faible.) Pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Reprendre un maximum de 1x 10 8 cellules avec 350 ul de tampon MACS (pour les numéros de cellulaires plus élevées intensifier tous tampon suivant MACS, réactif FcR blocage, CD133/1-Biotin et anti-Biotine microbilles volumes en conséquence). </li><li> Ajouter 100 ul de réactif FcR blocage. </li><li> Ajouter 50 ul CD133/1-Biotin. Bien mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex et incuber à 4-8 ° C fou 10 min. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Répétez étape de lavage (4,8) </li><li> Resuspendre culot cellulaire avec 400 ul de tampon MACS. </li><li> Ajouter 100 ul anti-Biotine microbilles. Bien mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex et incuber à 4-8 ° C pendant 15 min. </li><li> Pendant ce temps, préparer le séparateur MACS pour la séparation magnétique. Fixez QuadroMACS Stand séparateur MACS Multi. Insérer le nombre nécessaire de colonnes LS avec les ailes de colonnes à l&#39;avant dans le champ magnétique de la QuadroMACS. Placez un filtre de pré-séparation (avec 30 mailles de nylon um) dans chaque colonne LS et un tube de collecte approprié (15 ml ou 50 ml) dans chaque colonne. Préparer filtre et la colonne par rinçage avec 3 ml de tampon MACS. Jeter l&#39;éluat. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 500 piMACS tampon et appliquer suspension cellulaire sur la colonne LS avec le filtre de pré-séparation. </li><li> Laver trois fois avec 3 ml de tampon MACS par colonne. N&#39;ajoutez nouveau tampon lorsque le réservoir de la colonne est vide. </li><li> L&#39;effluent recueilli total contient le CD133 non marqué - fraction cellulaire. </li><li> Jeter le filtre de pré-séparation, enlever la colonne du séparateur et le placer sur un tube de collecte approprié. </li><li> Appliquer 5 ml de tampon MACS. Rincer immédiatement les cellules marquées CD133 + en poussant fermement le piston dans la colonne. </li><li> Pour augmenter la pureté de la fraction négative, appliquer la suspension cellulaire sur une colonne équilibrée LS nouveau inséré dans la QuadroMACS. L&#39;effluent contient le CD133 - fraction. </li><li> Jeter colonnes. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Afin d&#39;éliminer les contaminations érythrocytaires de la cellule tumorale pellets nous recommandons fortement d&#39;utiliser la solution de lyse des globules rouges à partir de Miltenyi. Les avantages de la lyse des érythrocytes au cours de la centrifugation sur gradient de Ficoll densité traditionnelle est qu&#39;il est plus rapide et plus simple. De plus, les contaminations par Ficoll ou de globules rouges et de la perte des cellules tumorales sont évités. Lorsque vous observez la croissance des fibroblaste...

Mélanomes malins cutanés sont le type le moins fréquent, encore plus mortelle de cancer de la peau. En raison d&#39;une incidence croissante, un haut grade de malignité et d&#39;une diffusion rapide, les mélanomes comptent maintenant pour 75% des tumeurs malignes de la peau liées 1,2 décès. En plus de l&#39;exérèse chirurgicale de la tumeur primitive, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie et combiné chimio-immunothérapie du mélanome et des métastases sont les stratégies state-of-the-art pour le traitement du mélanome 3,4. Toutefois, le mélanome malin est caractérisée par une faible réponse aux agents chimiothérapeutiques (5-12%) 5,6, et seulement ceux 50-70% de patients atteints de mélanome portant le gène BRAF V600E avantage mutation du gène de promettre de nouvelles thérapies ciblées que le traitement avec vemurafenib 7 Pour améliorer la survie globale, une meilleure compréhension des mécanismes de la tumorigenèse du mélanome est nécessaire. Pour étudier ces mécanismes dans le passé, bien établi commercialement des lignées cellulaires disponibles ont été utilisés. Des approches plus récentes pour étudier les événements moléculaires de l&#39;initiation et la progression du cancer utilisent des cultures primaires dérivées directement à partir de tissu tumoral - une stratégie avantages multiples paliers: Le chercheur a le plein contrôle du patient et de la sélection des tissus. Les cellules prélevées acquise dans le tissu tumoral sélectionnés par des experts, ressemblent à la tumeur avec tout son hétérogénéité et de suivi des données du patient et une pathologie détaillée est disponible pour permettre aux caractéristiques de la culture à comparer avec ceux de la tumeur d&#39;origine 8. En revanche, l&#39;utilisation de lignées cellulaires établies comme des systèmes modèles pertinents en recherche sur le cancer est l&#39;objet de controverses. Déjà en 1987, Osborne et ses collègues ont décrit des différences biologiques entre les MCF-7 lignes cellulaires cancéreuses mammaires de différents laboratoires 9. Cette instabilité génomique vaste et la variation de l&#39;expression des ARN au cours de la sous-culture a été confirmed par Hiorns et al. ont fourni des données et de soutien pour preuve que les lignées cellulaires ne évoluera dans la culture, ce qui affaiblit la pertinence directe de ces cultures établies comme des modèles du cancer humain 10. Une autre considération importante, qui a été largement ignoré au cours des années, est le risque de contamination ou de prolifération de cultures sans rapport avec «fausses» les cellules, ce qui a d&#39;abord été mis en évidence il ya vingt ans, en démontrant qu&#39;un grand nombre de lignées de cellules HeLa ont été contaminés par 8,11 cellules. La mauvaise interprétation des données de «faux» des lignées cellulaires a récemment mis au jour dans la littérature à nouveau. En utilisant une combinaison de profilage de l&#39;ADN et la cytogénétique moléculaire, MacLeod et al. Ont révélé que de 252 nouveaux dérivées de tumeurs des lignées cellulaires humaines déposé à la Collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires (DSMZ), près de 18% ont été jugés intraspécifique ou interspécifique croix -contaminants 12,13. Pour éviter ces problèmes et de faire usage des avantages mentionnés ci-dessus, nous avons décidé de mettre en place à faible passage des lignées de cellules de mélanome de métastases fraîchement excisées. Robustes cellulaires technologies de séparation et d&#39;analyse nécessitent unicellulaires préparations destinées à être produite tout en limitant la mort cellulaire et la destruction des protéines de surface caractéristiques. Un instrument de paillasse pour la dissociation automatisée des tissus dans une seule cellule suspensions est le Dissociator gentleMACS fabriqué par Miltenyi. Lorsqu&#39;il est utilisé en combinaison avec gentleMACS C Tubes et optimisé solutions dissociation, une dissociation efficace et doux de tissu tumoral dans un système fermé est obtenu tout en préservant épitopes d&#39;antigènes et de réduire la perte de cellules. L&#39;instrument offre optimisées, programmes pré-établis pour une variété d&#39;applications spécifiques et des garanties de préparation standardisée des suspensions unicellulaires à partir de 14 tissus mélanome. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De récents rapports ont révélé que la majorité des tumeurs abritent une petite sous-population de ce qu&#39;on appelle les cellules souches cancéreuses (CSC), qui présentent exclusivement des tumeurs initiation et la capacité d&#39;auto-renouvellement. L&#39;identification des cellules souches des mélanocytes qui produisent dans le derme de la peau conduit à l&#39;hypothèse que ces cellules pourraient être à l&#39;origine des cellules souches cancéreuses (CSC) dans le mélanome depuis l&#39;exposition aux UVA peut amorcer ces cellules pour la transformation maligne 15. Le résultat d&#39;une telle lésion génétique serait cellules qui abritent une combinaison de caractéristiques de la tumeur et les cellules souches. L&#39;un des marqueurs principaux proposés pour représenter la sous-population des CSC dans le mélanome est CD133 16-20. CD133 (également connu sous le nom prominine 1), un membre de glycoprotéines transmembranaires PENTASPAN, est exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices endothéliales, les cellules souches neuronales et gliales 21-23. L&#39;expression de CD133 est en corrélation avecla division cellulaire asymétrique 24, et l&#39;épitope glycosylé de CD133 a été montré pour être régulée à la baisse sur 25 différenciation cellulaire. Récemment, CD133 + cellules de mélanome ont été montré pour avoir l&#39;auto-renouvellement et la tumeur initiation capacité de 19,20. Pour étudier la fonction de CD133 + mélanome putatif CSC, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) système de Miltenyi Biotech pour obtenir des populations hautement enrichi et viable de CD133 et CD133 + - cellules. Séparation magnétique de cellules à base de billes permet soit la sélection négative comme le montre Matheu et al. 26 ou la sélection positive comme nous le montrons ici. Lors de la sélection du type positif cellule cible particulière, par exemple des cellules exprimant CD133, est marqué magnétiquement avec des microbilles, des particules superparamagnétiques 50-nm qui sont conjugués à des anticorps très spécifiques contre unparticulier antigène de surface cellulaire. Lors de la séparation, les cellules marquées magnétiquement sont retenus à l&#39;intérieur de la colonne dans le champ magnétique du séparateur, tandis que les cellules non marquées de les traverser. À la suite des étapes de lavage, la colonne est retirée du champ magnétique du séparateur, et les cellules cibles sont éluées de la colonne. Le LS ou colonnes MS utilisé pendant résultat de la sélection positive en fractions de cellules marquées et non marquées avec une grande pureté. D&#39;autre part, les colonnes LD, utilisés pour la sélection négative, conduisent à une pureté légèrement inférieure de la fraction marquée. En raison de la plus dense d&#39;emballage de leur matrice du débit dans ces colonnes est inférieur résultant en un risque plus élevé de cellules non marquées à être piégés dans la colonne. Colonnes LD devrait donc être utilisé que pour l&#39;épuisement sévère d&#39;une sous-population de cellules indésirables. Sélection positive peut être réalisée par marquage magnétique directe (anticorps couplé à des microbilles) ou indirecte (incubation avec des microbilles suivant la incubation avec l&#39;anticorps primaire). Spécifiques microbilles MACS sont disponibles pour la sélection positive de nombreux types cellulaires de cellules tumorales primaires comme la prostate ou de mélanome 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B solution de 250 pg / ml dans de l&#39;eau désionisée </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblastes microbilles </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS sans Ca, Mg </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS supérieure </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirecte CD133 humain Kit Micro-Bead </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Comprend: CD133 / 1 (AC133)-biotine, anti-Biotine microbilles et le réactif de blocage FcR </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine, liquide (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red solution de lyse des globules (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell crépine (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociateur </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> Support multi séparateur MACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes séparation MACS 25 colonnes LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube MACSmix </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Avant sa cessation filtres </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Séparateur QuadroMACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Filtres pour seringues Rotilabo (0,22 um, PSE) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP filtre Unité 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Malgré l&#39;existence de traitements améliorés pour les mélanomes disponibles aujourd&#39;hui, les patients atteints de mélanome malin avancé encore un mauvais pronostic pour la survie sans progression et globale. Par conséquent, la recherche translationnelle doit fournir une preuve supplémentaire moléculaire pour améliorer les thérapies ciblées pour les mélanomes malins. Dans le passé, les mécanismes oncogéniques liés au mélanome ont été largement étudiées dans des lignées cellulaires établies. Sur le chemin de traitements plus personnalisés basés sur les profils génétiques, nous proposons d&#39;utiliser des lignées cellulaires dérivées de patients au lieu de lignées cellulaires génériques. Avec les données cliniques de haute qualité, en particulier sur le suivi des patients, ces cellules seront déterminants afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l&#39;origine la progression du mélanome. Ici, nous présentons la mise en place des cultures de mélanomes primaires de tissu tumoral frais disséqués. Cette procédure comprend le hachage et la dissociation du tissu dans des cellules individuelles, reDépose des contaminations avec des érythrocytes et des fibroblastes ainsi que la culture primaire et de vérification fiable de l&#39;origine des cellules de mélanome. De récents rapports ont révélé que les mélanomes, comme la plupart des tumeurs, le port d&#39;une petite sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC), qui semblent exclusivement alimenter l&#39;initiation et la progression tumorale vers le stade métastatique. L&#39;un des principaux marqueurs pour l&#39;identification et l&#39;isolement du SCC dans le mélanome est CD133. Pour isoler CD133 + CSC à partir de cultures primaires de mélanome, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) procédure de Miltenyi résultant de la pureté de tri haute et la viabilité de CD133 + et CD133 CSC - en vrac, ce qui peut être cultivée et fonctionnellement analysé par la suite.

Préparation de mono-cellules provenant de tissu tumoral La figure 2 illustre une métastase ganglionnaire résection d&#39;un patient atteint de mélanome stade avancé avant (A) et après (B) dissociation mécanique en 2-4 morceaux mm. Après dissociation enzymatique du tissu et filtration à travers un maillage de 70 um nylon, cellules ont été sédimentées et le surnageant est rejeté. À cette étape, nous avons observé une forte contamination par les globules rouges, c...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches de mélanome sont triés du CD133<sup&gt; -</sup&gt; En vrac en utilisant magnétique tri cellulaire activé (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K vues.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133 + Putatifs cellules souches de mélanome sont triés du CD133 - En vrac en utilisant magnétique tri cellulaire activé (MACS).

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Recherche

Médecine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...