Nous remercions Deborah Studer pour l&#39;aide à la bioprinter. Le travail a été financé par l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° NMP4-SL-2009-229292.

1. Préparation de la Solution 407 Poloxamer Le cas échéant, réaliser la préparation de la solution de poloxamère dans une chambre froide (4 ° C). S&#39;il n&#39;est pas disponible, placez une bouteille en verre dans un bécher rempli d&#39;eau glacée. A des températures plus élevées, le poloxamère sera au-dessus du point de gel et ne se dissoudra pas correctement. <ol><li> Ajouter 60 ml de solution PBS froid dans une bouteille en verre et agiter vigoureusement à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique. </li><li> Peser 24,5 g de poloxamère et l&#39;ajouter en petites quantités à la PBS froid. Attendez que le poloxamère a partiellement dissous avant d&#39;ajouter plus. </li><li> Agiter la solution jusqu&#39;à ce que tous poloxamère a dissoute. </li><li> Ajouter PBS froid jusqu&#39;à un volume final de 100 ml est atteinte. La concentration sera de 24,5% p / v </li><li> Arrêtez de remuer la solution et laisser reposer à 4 ° C jusqu&#39;à ce que des bulles et de la mousse dans la solution ont disparu. Bubbles qui sont piégés dans le gel seront transférés à la pcartouche RINTER et conduire à des défauts dans les moules sacrificiels imprimés. </li><li> Filtre (filtre de 0,22 um) de la solution directement dans la cartouche d&#39;impression pour éliminer les particules non désirées qui pourraient boucher l&#39;aiguille. L&#39;étape de filtrage doit être effectuée dans une chambre froide (ou s&#39;il n&#39;est pas disponible aux pointes refroidis, filtre etc) pour éviter la gélification du poloxamère dans le filtre. Conservez la cartouche chargée à 4 ° C jusqu&#39;à 30 min avant l&#39;expérience. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;imprimante 3D L&#39;imprimante 3D utilisée dans ce travail était la &quot;bioproduction&quot; de regenHU. La partie d&#39;extrusion du système est constitué de plusieurs parties. Une cartouche sous pression dans la partie supérieure est fixée à un connecteur par l&#39;intermédiaire d&#39;un adaptateur Luer Lock. Le connecteur comble les espaces entre la sortie de la cartouche et l&#39;entrée d&#39;une électrovanne. A la sortie de l&#39;électrovanne, d&#39;aiguilles de diamètres différents peuvent être utilisés. Le matériau est extrudé sur un soustrer qui se tient à une étape déplaçant par le vide. Les principaux éléments du système sont illustrés dans la Figure 1. D&#39;autres systèmes à base d&#39;extrusion peuvent être utilisées pour le processus d&#39;impression, et le processus d&#39;optimisation qui doit être fait pour chaque système. <ol><li> Placer l&#39;électrovanne (buse de diamètre 0,3 mm) et l&#39;aiguille (diamètre interne 0,15 mm) dans des éprouvettes ml séparées 1,5 remplis avec de l&#39;eau ultra pure et de les placer dans un bain à ultrasons chauffé à nettoyer pendant 30 min. Rincer les soupapes nettoyées avec de l&#39;éthanol et séchez-les avec un fusil d&#39;azote. </li><li> Installer le clapet et l&#39;aiguille dans l&#39;imprimante ainsi que d&#39;un vide, la cartouche propre. </li><li> Appliquer une pression de 3 bar pour le système et souffler les liquides résiduels de la vanne installée et l&#39;aiguille avec de l&#39;air comprimé. Pour les petits diamètres d&#39;aiguilles, il est recommandé d&#39;avoir un filtre (commune filtre seringue, 0,45 um taille des pores) installé à la sortie de l&#39;air comprimé pour éviter l&#39;entrée de petites particules qui pourraient obstruer l&#39;aiguille. </li&gt; <li> Mettez la pression et installer la cartouche chargée avec le poloxamère. La cartouche doit être sorti du réfrigérateur environ 30 minutes avant le montage de la cartouche de sorte que le poloxamère peut atteindre la température ambiante et un gel. </li><li> Appliquer une pression de 3 bar dans le système de distribution et de poloxamère jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne l&#39;extrémité de l&#39;aiguille et est extrudée en un boudin continu. </li></ol> 3. Optimisation des paramètres d&#39;impression Pour créer des structures 3D précis, le processus d&#39;impression doit être optimisé pour le matériel choisi et la concentration. En fonction de la viscosité et le système d&#39;impression 3D, chaque matériau va donner un volume de distribution spécifique et l&#39;épaisseur de ligne d&#39;un ensemble fixe de paramètres. <ol><li> Avec un logiciel de CAO approprié (capable de créer des fichiers ISO à partir des dessins), tracer une ligne unique sur la même longueur que la structure que vous souhaitez imprimer. </li><li> Placez un microscope lame de verre 25 mm x 75 mm x 1mm ou tout autre substrat dans l&#39;imprimante et le fixer en activant le vide. </li><li> Dans le logiciel d&#39;impression, régler la soupape à solénoïde à une fréquence élevée de 50 Hz et une haute pression de 3 bars. </li><li> Imprimer une couche d&#39;une seule ligne avec une vitesse de phase de 300 mm / min. </li><li> Réduire la pression jusqu&#39;à ce que la largeur de ligne souhaitée est atteinte. Vous pouvez également contrôler le volume qui est extrudé par le temps d&#39;ouverture de la vanne. </li><li> Réduire la fréquence de la soupape jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune ligne continue peut plus être imprimé. Choisissez une fréquence supérieure à cette valeur. </li></ol> Remarque: Une fois que la largeur de ligne souhaitée et lignes continues sont obtenus, déterminer la vitesse de phase optimale et l&#39;épaisseur de la couche à savoir la portance de l&#39;aiguille après une couche imprimée. <ol start="7"><li> Imprimez plusieurs couches les unes sur les autres et de voir si l&#39;aiguille est dans la bonne position au-dessus de la couche précédente, après plusieurs couches imprimées. Réglez l&#39;épaisseur de la couche (levée d&#39;aiguille), De sorte que chaque couche est imprimée sur le dessus de la suivante (figure 3). </li><li> Diminuez la vitesse de phase de l&#39;étape de 300 mm / min par étapes afin que les couches extrudées commencent et se terminent dans les mêmes positions que les précédentes (figure 4). Vitesses trop élevées sur scène provoquent la scène pour se déplacer avant que le matériau extrudé a touché la couche précédente. </li><li> Pour imprimer les structures de pilier suivez les étapes 3.1.-3.8., Mais au lieu de tirer une seule ligne attirent un seul point. Les paramètres de mise au point quand l&#39;impression des colonnes sont la pression (régule l&#39;épaisseur de couche et le diamètre du pilier de poloxamer), le temps d&#39;ouverture de la soupape (volume extrudé) et le temps de séjour de la tête d&#39;impression à la position où le pilier doit être déposé . </li><li> Lorsque les paramètres sont optimisés, l&#39;impression de plusieurs couches d&#39;une ligne doit se traduire par une paroi solide, ou dans le cas où des points, un pilier. Enregistrer les paramètres pour une utilisation ultérieure. </li></ol> Utilisez les paramètres trouvés au cours de la procédure d&#39;optimisation partir de ce point. <ol><li> Imprimer la structure interne (ici il s&#39;agit d&#39;un tableau de pilier) sur une lame de microscope en verre et laissez-le sécher pendant la nuit. Cela a) réduit la taille et l&#39;épaisseur des structures et b) offre une meilleure adhérence entre la structure et le substrat, de sorte que le décollage pendant le remblayage peut être évitée. </li><li> Avec le logiciel de CAO, dessiner une structure qui se compose d&#39;une paroi extérieure entourant la structure que vous comptez avoir élue loin et rempli. Imprimer la structure avec poloxamère. L&#39;impression de la paroi aura 6 min. </li></ol> Note: La paroi doit être imprimé au moins 3,5 mm de la structure interne en raison des dimensions de l&#39;aiguille. Sinon, l&#39;impression de la paroi extérieure va détruire la structure interne <ol start="3"><li> Préparer la solution que vous souhaitez remblayer votre sacrmoule ificial avec (ici 1% d&#39;agarose dans de l&#39;eau déminéralisée). La solution d&#39;agarose doit avoir une température comprise entre 35 ° C et 45 ° C. En dessous de cette température, l&#39;agarose se solidifie trop rapidement; au-dessus de cette température, il pourrait détruire les piliers imprimés car la structure de poloxamère va adoucir. </li><li> Remplissez lentement le moule sacrificiel avec la solution de remblayage à l&#39;aide d&#39;une pipette. Cela devrait être fait lentement pour éviter la destruction de la structure à l&#39;intérieur du mur. </li><li> Laisser le gel de solution remblayé ou réticuler il en fonction du polymère utilisé. Dans le cas d&#39;agarose la solidification a eu lieu à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Placez le moule sacrificiel remblayé dans un bain de glace pendant 10 min pour éluer la structure de poloxamère. </li><li> Éponger la structure remblayé avec un mouchoir en papier et le placer sur une nouvelle lame de microscope en verre. Appuyez doucement sur la structure sur la lame de microscope en verre pour éviter les fuites de la troisième hydrogel du vide dans l&#39;espace entrela structure remblayée et la lame de microscope en verre. </li></ol> 5. Le remplissage des vides <ol><li> Pour remplir les vides laissés par le poloxamère éluée, remplir la solution de polymère prévue dans une seringue munie d&#39;une aiguille de calibre 30. Dans cet exemple, nous avons utilisé un méthacrylate d&#39;alginate de 1% dans une solution de NaCl 0,15 M avec l&#39;ajout de 0,05% p / v lithium phényl-2, 4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) et de 2,5% v / v d&#39;Alexa-488 conjugué fibrinogène . La Alexa-488 conjugué fibrinogène a été ajouté à des fins de visualisation. </li><li> Photopolymériser le polymère avec une lampe UV à haute intensité (100 Watt, 365 nm, la distance de substrat était de 3,5 cm) pendant 5 min et l&#39;image de la construire en utilisant un microscope à épifluorescence ou confocal. </li></ol>

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M., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+alginate+hydrogels+with+tunable+biodegradation+rates+and+mechanical+properties.">Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties.</a> Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).</li><li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels.">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).</li><li>D'Arrigo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+methacrylate+derivatives+and+calcium+alginate+interpenetrated+hydrogel+networks+for+biomedical+applications:+physico-chemical+characterization+and+protein+release.">Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release.</a> Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li><li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting.">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+of+collagen/chondroitin+sulfate/hyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering.">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à déclarer.

Nous présentons ci, pour la première fois, l&#39;utilisation d&#39;un polymère thermosensible pour un moule sacrificiel qui peut être rapidement éluée à l&#39;eau froide due à la transition gel-sol de poloxamère de ~ 20 ° C. La vitesse de l&#39;ensemble du processus fait poloxamère intéressant pour la création rapide des structures de biopolymères qui ne peut être imprimé avec une résolution suffisante. La technique décrite ici peut être utilisé pour la modélisation d&#39;un hydrogel dans une autre ...

approches d&#39;ingénierie tissulaire ont fait beaucoup de progrès au cours des dernières années en ce qui concerne la régénération des tissus et d&#39;organes humains 19,20. Cependant, jusqu&#39;à présent, l&#39;objet de l&#39;ingénierie tissulaire a été souvent limitée aux tissus qui ont une structure simple ou petites dimensions comme la vessie ou de la peau 21,22 23-25. Le corps humain contient cependant de nombreux tissus complexes en trois dimensions où les cellules et la matrice extracellulaire sont disposées d&#39;une manière définie dans l&#39;espace. Pour la fabrication de ces tissus, une technique est nécessaire qui peut placer les cellules et les échafaudages de la matrice extracellulaire à l&#39;intérieur d&#39;une construction en trois dimensions à des positions spécifiées. Bioprinting a le potentiel pour être une telle technique où la vision de la fabrication des tissus complexes en trois dimensions peut être réalisée 10,11,26-28. Bioprinting est définie comme «l&#39;utilisation de procédés de transfert de matériel pour la modélisation et l&#39;assemblage biologiquement relmatériaux nentes - molécules, cellules, tissus et biomatériaux biodégradables -. avec une organisation prescrite pour accomplir une ou plusieurs fonctions biologiques »4 Elle englobe plusieurs techniques différentes qui fonctionnent à différentes résolutions et échelles de longueur, allant de la résolution submicronique de deux polymérisation photons 29 à une résolution de 150 um à 420 um pour l&#39;impression d&#39;extrusion 1,12,30. Pas un seul matériau ou combinaison de matériaux saura satisfaire les exigences de chaque méthode 31. Pour l&#39;impression d&#39;extrusion, les paramètres clés sont la viscosité et le temps de gélification 32, où la haute viscosité et la gélification rapide est souhaitable. L&#39;impression 3D est une technique qui permet la création facile de moules sacrificiels pour créer des géométries complexes 30,33,34. Ce procédé est basé sur la construction d&#39;un moule en utilisant une technique de prototypage rapide tel qu&#39;un bioprinter d&#39;extrusion. Le moule sacrificiel créée est utiliséepour former des structures complexes à partir de matériaux qui sont difficiles à imprimer du fait de leur faible viscosité et temps de gélification lente. La méthode présentée ici consiste en la création d&#39;un moule sacrificiel consistant en un matériau qui se dissout rapidement à basse température et qui peut être extrudé avec précision. Le copolymère à blocs poly (éthylène glycol) 99-poly (propylène glycol) 67-poly (éthylène glycol) 99 (également connu sous le nom de Pluronic F127 ou le poloxamère 407) répond à ces exigences. Il a déjà été utilisé dans une version modifiée de l&#39;impression d&#39;extrusion 1, mais, à notre connaissance, n&#39;a jamais été utilisé pour l&#39;impression dans sa version non modifiée en raison de son instabilité dans les milieux liquides. Poloxamer 407 montre également un comportement réactif thermique inverse 18 c&#39;est à dire qu&#39;il passe d&#39;un gel à un sol lors du refroidissement. Plus important encore, il peut être imprimé dans des structures courbes arbitrairement complexes avec une très grande fidélité. Cela permet la création d&#39;un hydrogel structuré à partir d&#39;unun matériau à faible viscosité, en l&#39;occurrence gélifiant lente d&#39;agarose, à la pipette de la solution dans le moule sacrificiel imprimé. La combinaison de l&#39;impression du moule sacrificielle avec une grande fidélité et son élution rapide de l&#39;hydrogel structuré coulé en fait un procédé rapide et flexible pour créer des moules avec des géométries différentes, sans l&#39;utilisation d&#39;un masque ou d&#39;un timbre comme il est souvent nécessaire dans les procédés lithographiques. L&#39;hydrogel structuré coulé peut encore être rempli avec un autre matériau qui n&#39;est pas adapté à l&#39;impression d&#39;extrusion en raison de sa faible viscosité. Il s&#39;agit dans notre cas une solution de méthacrylate bas d&#39;alginate de viscosité. Ici, nous présentons la méthode de thermosensibles moules sacrificiels inverse pour motif d&#39;hydrogel en utilisant l&#39;exemple d&#39;un tableau de pilier.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poloxamer (Pluronic F127)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2443</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAD software</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>BioCAD</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alginate methacrylate</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F13191</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>50004</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioprinter</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>Biofactory</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Valve</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>300 &mu;m Nozzel Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>150 &mu;m Inner Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeiss Axioobserver with ApoTome</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Light Source</td>
 <td>UVP</td>
 <td>Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp</td>
 <td>100 W</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

printing thermoresponsive reverse molds for the creation of patterned two-component hydrogels for 3d cell culture

Bioprinting est une technologie émergente qui a ses origines dans l&#39;industrie du prototypage rapide. Les différents procédés d&#39;impression peuvent être divisés en contact bioprinting 1-4 (extrusion, plongeon stylo et lithographie douce), 5-7 (transfert avant laser, à jet d&#39;encre dépôt) sans contact bioprinting et techniques à laser comme deux photopolymérisation photon 8. Il peut être utilisé pour de nombreuses applications telles que l&#39;ingénierie tissulaire 9-13, 14-16 et microfabrication biocapteur comme un outil pour répondre à des questions biologiques fondamentaux tels que les influences de co-culture de différents types de cellules 17. Contrairement aux méthodes de photolithographie ou soft-lithographique communes, bioprinting d&#39;extrusion a l&#39;avantage qu&#39;il ne nécessite pas un masque ou d&#39;un cachet distinct. Grâce à un logiciel de CAO, la conception de la structure peut être rapidement modifiée et ajustée en fonction des besoins de l&#39;opérateur. Cela rend bioprinting plus souple que la lithographie basée surapproches. Ici, nous démontrons l&#39;impression d&#39;un moule sacrificiel de créer une structure multi-matériaux en 3D en utilisant un réseau de piliers dans un hydrogel à titre d&#39;exemple. Ces piliers peuvent représenter des structures creuses pour un réseau vasculaire ou les tubes à l&#39;intérieur d&#39;un conduit de guidage de nerf. Le matériau choisi pour le moule sacrificiel est le poloxamère 407, un polymère thermosensible avec d&#39;excellentes propriétés d&#39;impression qui est liquide à 4 ° C et un solide ci-dessus de sa température de gélification ~ 20 ° C pendant 24,5% p / v de solutions 18. Cette propriété permet à la moule sacrificiel poloxamère basée à élue à la demande et présente des avantages sur la lente dissolution d&#39;un matériau solide en particulier pour les géométries étroites. Poloxamer a été imprimé sur des lames de verre de microscope pour créer le moule sacrificiel. Agarose a été pipette dans le moule et refroidi jusqu&#39;à la gélification. Après élution de la poloxamère dans de l&#39;eau glacée, les vides dans le moule d&#39;agarose ont été remplis avec de l&#39;alginate méthacrylate spIKED avec FITC fibrinogène marqué. Les vides remplis sont ensuite réticulées aux UV et la construction a été imagé avec un microscope à épifluorescence.

Les résultats représentatifs montrent que la technique de moulage de marche arrière (représentée sur la figure 2) va créer un gel structurée pouvant être remplie d&#39;un second matériau. Au début de chaque processus d&#39;impression, les paramètres d&#39;impression sont d&#39;abord optimisés. Ajustements progressive des paramètres se traduira par des constructions multicouches imprimés illustrés à la figure 3 et la figure 4 lorsque les lignes simples so...

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Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

A bioprinter été utilisé pour créer hydrogels motifs fondés sur un moule sacrificiel. Le moule poloxamère a été remblayé avec un second hydrogel et ensuite élue, laissant des vides qui ont été remplis avec un troisième hydrogel. Cette méthode utilise une élution rapide et une bonne imprimabilité de poloxamère pour générer des architectures complexes à partir de biopolymères.

Impression Moules Reverse thermosensible pour la création de motifs d&#39;hydrogels à deux composants pour la culture cellulaire 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K vues.  Cartilage Engineering & Regeneration. A bioprinter été utilisé pour créer hydrogels motifs fondés sur un moule sacrificiel. Le moule poloxamère a été remblayé avec un second hydrogel et ensuite élue, laissant des vides qui ont été remplis avec un troisième hydrogel. Cette méthode utilise une élution rapide et une bonne imprimabilité de poloxamère pour générer des architectures complexes à partir de biopolymères.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Recherche

Immunologie et infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l&#39;imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d&#39;estomac et microinjection de Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...