우리는 bioprinter에 도움 데보라 STUDER 감사합니다. 작품은 부여 계약을 N에 따라 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292에 의해 투자되었다.

1. 폴록 사머 407 용액의 조제 가능한 경우, 냉장실 (4 ° C)의 폴록 사머 솔루션의 준비를 수행합니다. 사용할 수없는 경우, 얼음처럼 차가운 물이 가득 비커에 유리 병을 놓습니다. 높은 온도에서 폴록 사머가 젤 점 이상이어야하며 제대로 분해되지 않습니다. <ol><li> 유리 병에 얼음 차가운 PBS 용액 60 mL를 추가하고 자석 교반기를 사용하여 적극적으로 저어. </li><li> 폴록 사머의 24.5 그램 무게와 차가운 PBS에 소량에 추가합니다. 폴록 사머 부분적으로 더 추가하기 전에 해산 될 때까지 기다립니다. </li><li> 모든 폴록 사머이 녹을 때까지 저어. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨에 도달 할 때까지 차가운 PBS를 추가합니다. 최종 농도는 24.5 % W / V 될 것입니다 </li><li> 솔루션을 교반 중지하고 ° C가 용액에서 거품과 거품 때까지 사라 4에서 휴식을 할 수 있습니다. 젤 안에 갇혀 거품이 P로 전송됩니다rinter 카트리지 및 인쇄 희생 금형의 결함으로 이어질 것입니다. </li><li> 필터 (0.22 μm의 필터) 바늘을 방해 할 수있는 불필요한 입자를 제거하기 위해 직접 인쇄 카트리지에 솔루션을 제공합니다. 필터링 단계 필터 폴록 사머의 겔화를 방지하기 위해 (또는하지 않을 경우 냉각 팁, 필터 등 사용 가능) 추운 방에서 수행해야합니다. ° C까지 30 분 실험을하기 전에 4시에로드 된 카트리지를 보관하십시오. </li></ol> 2. 3D 프린터의 준비 이 작품에 사용되는 3D 프린터는 regenHU에서 &quot;BioFactory&quot;입니다. 시스템의 돌출 부분은 여러 부분으로 구성되어 있습니다. 상단의 압력 카트리지는 루어 잠금 어댑터를 통해 커넥터에 연결합니다. 커넥터는 카트리지의 출구와 솔레노이드 밸브의 입구 사이의 공백을 메워. 솔레노이드 밸브의 출구에서 직경이 다른 바늘을 사용할 수 있습니다. 소재는 하위에 압출진공 청소기를 이용하여 이동하는 단계에 개최되는 strate. 시스템의 주요 부분은 그림 1에 묘사되어 있습니다. 기타 압출 기반 시스템은 인쇄 과정에 사용하고, 최적화 프로세스는 각 시스템에 대해 수행해야 할 수 있습니다. <ol><li> 초순수로 채워 별도의 1.5 ML 테스트 튜브 솔레노이드 밸브 (노즐 직경 0.3 mm)와 바늘 (내경 0.15 mm) 놓고 30 분 동안 청소하는 가열 초음파 욕조에 넣습니다. 에탄올로 세척 밸브를 세척하고 질소 총을 건조. </li><li> 밸브와 니들 프린터뿐만 아니라 빈 카트리지 청소를 설치합니다. </li><li> 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 압축 공기로 설치된 밸브와 니들에서 잔여 액체를 날려. 작은 바늘 직경, 그것은 바늘을 방해 할 수있는 작은 입자의 항목을 방지하기 위해 압축 공기의 출구에 설치된 필터 (공통 주사기 필터 0.45 μm의 기공 크기)를 가지고하는 것이 좋습니다. </lI&gt; <li> 폴록 사머와 함께로드 카트리지 압력을 해제하고 설치합니다. 폴록 사머 실내 온도와 겔에 도달 할 수 있도록 카트리지는 카트리지를 설치하기 전에 냉장고에서 약 30 분을 이동해야합니다. </li><li> 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 바늘 끝을 도달하고 지속적인 물가에서 돌출 될 때까지 폴록 사머를 분배. </li></ol> 3. 인쇄 매개 변수의 최적화 정확한 3D 구조를 만들려면 인쇄 과정은 선택한 재료와 농도 최적화 할 수 있습니다. 점도와 3D 인쇄 시스템에 따라 각 재료 매개 변수의 고정 세트에 대한 특정 분배 볼륨과 선 두께를 얻을 것입니다. <ol><li> 적합한 CAD 소프트웨어 (그림에서 ISO 파일을 생성 할 수)와 함께, 당신은 인쇄하고자하는 구조로 같은 길이에 대한 하나의 라인을 그립니다. </li><li> 현미경 유리 슬라이드 25mm X 75mm X 1 배치mm 또는 프린터에 다른 기판과 진공을 ON하여 고정합니다. </li><li> 프린터 소프트웨어에서 50 Hz의 높은 주파수로 솔레노이드 밸브를 설정하고 3 줄의 높은 압력을 설정합니다. </li><li> 300mm / 분의 단계 속도를 가진 단 하나 줄 하나의 레이어를 인쇄합니다. </li><li> 원하는 라인 폭에 도달 할 때까지 압력을 줄일 수 있습니다. 또한 밸브의 개방 시간을 통해 돌출 볼륨을 제어 할 수 있습니다. </li><li> 어떤 연속 선이 더 이상 인쇄 할 수 없습니다 때까지 밸브의 빈도를 줄일 수 있습니다. 이 값 이상의 주파수를 선택합니다. </li></ol> 참고 : 원하는 라인 폭과 지속적인 라인이 달성되면, 하나의 인쇄 층을 한 후 최적의 단계 속도와 바늘의 상승 즉, 층 두께를 결정합니다. <ol start="7"><li> 서로의 상단에 여러 레이어를 인쇄하고 바늘이 여러 인쇄 층 후 이전 레이어 위에 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 층의 두께 (바늘 리프트를 조정) 이렇게 각 계층은 다음 중 하나 (그림 3)의 상단에 인쇄되어 있는지 확인합니다. </li><li> 300mm / 압출 레이어가 이전의 것들 (그림 4)와 같은 위치에서 시작하고 종료하도록 분 단계적에서 무대의 무대의 속도를 감소시킵니다. 너무 높은 단계의 속도는 압출 재료가 이전 레이어를 터치하기 전에 단계는 이동 될 수. </li><li> 인쇄 기둥 구조. 단계 3.1.-3.8를 수행하는 대신 하나의 선 그리기의 단일 지점을 그립니다. 기둥을 인쇄 할 때에 집중하는 매개 변수는 기둥이 입금되어야 위치에서 프린트 헤드의 압력 (층 두께와 폴록 사머의 기둥의 직경을 조절) 밸브의 개방 시간 (압출 볼륨) 및 체류 시간입니다 . </li><li> 매개 변수가 최적화 될 때, 라인의 여러 레이어를 인쇄하는 단단한 벽 또는 포인트, 기둥의 경우가 발생합니다. 나중에 사용하기 위해 매개 변수를 저장합니다. </li></ol> 이 시점에서의 최적화 과정 동안 발견 매개 변수를 사용합니다. <ol><li> 유리 현미경 슬라이드에 내부 구조 (여기에는 기둥 배열)를 인쇄하고 밤새 건조하자. 이)는 구조물의 크기와 두께를 줄이고 b)는 피할 수 리프트 오프 백필 동안, 그래서 구조와 기판 사이 더 나은 접착력을 제공합니다. </li><li> CAD 소프트웨어로, 당신은 멀리 용출 채운하려는 구조를 둘러싼 외벽의 구성 구조를 그려라. 폴록 사머와 구조를 인쇄합니다. 벽의 인쇄 6 분 소요됩니다. </li></ol> 주의 : 벽 때문에 바늘의 크기의 내부 구조로부터 최소 3.5 mm 떨어져 인쇄 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 외벽의 인쇄가 내부 구조를 파괴 할 것이다 <ol start="3"><li> 당신의 SACR를 백필 할 솔루션을 준비합니다와 ificial 형 (탈 이온수 여기에 1 % 아가로 오스). 아가로 오스 솔루션은 35 ° C와 45 ° C. 사이의 온도를 가지고 있어야 이 온도 아래, 아가가 너무 빨리 응고 것이다 폴록 사머 구조가 부드럽게 때문에이 온도 이상, 그것은 인쇄 된 기둥을 파괴 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 피펫을 사용하여 되메우기 솔루션을 희생 형을 입력합니다. 이 벽 내부 구조의 파괴를 방지하기 위해 천천히 수행해야합니다. </li><li> 채워질 솔루션 젤을하게하거나 사용 폴리머에 따라 가교. 아가의 경우 응고가 10 분 동안 4 ° C에서 열렸다. </li><li> 폴록 사머 구조를 용출하는 10 분 동안 얼음 목욕 채워질 희생 형을 놓습니다. </li><li> 종이 티슈로 채워질 구조를 몰아 내고 새로운 유리 현미경 슬라이드에 배치합니다. 사이의 공간에 빈에서 세 번째 하이드로 젤의 누설을 방지하기 위해 유리 현미경 슬라이드에주의 구조를 누르면채워질 구조와 유리 현미경 슬라이드. </li></ol> 5. 보이드의 작성 <ol><li> 용출 폴록 사머에 의해 왼쪽 빈 공간을 채우기 위해, 30 G 바늘을 장착 한 주사기로 의도 된 고분자 용액을 채운다. 이 예제에서, 우리는 0.05 %의 추가로 0.15 M 염화나트륨 용액에 1 % 알긴산 메타 크릴 레이트를 사용하여 W / V 리튬 페닐 -2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate (LAP)와 2.5 %의 v / V를 사용 알렉사 - 488 복합 피브리노겐 . 알렉사 - 488 복합 피브리노겐은 시각화 목적을 위해 추가되었습니다. </li><li> 5 분 및 이미지에 대한 고강도 UV 램프 (100 와트, 365 nm의 기판에서의 거리 3.5 cm이었다)와 폴리머를 Photopolymerize 에피 형광 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 구성. </li></ol>

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M., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+alginate+hydrogels+with+tunable+biodegradation+rates+and+mechanical+properties.">Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties.</a> Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).</li><li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels.">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).</li><li>D'Arrigo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+methacrylate+derivatives+and+calcium+alginate+interpenetrated+hydrogel+networks+for+biomedical+applications:+physico-chemical+characterization+and+protein+release.">Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release.</a> Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li><li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting.">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+of+collagen/chondroitin+sulfate/hyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering.">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li></ol>

저자는 선언 아무 상관이 없다.

여기에 우리가 처음 제시 빠르게 때문에 ~ 20 ° C의 폴록 사머의 젤 - 졸 전환 차가운 물에 용출 될 수있는 희생 금형 thermoresponsive 폴리머의 사용 전체 프로세스의 속도가 적절한 해상도로 인쇄 할 수 없습니다 생체 고분자 구조의 빠른 생성을위한 폴록 사머 재미 있습니다. 여기에 설명 된 기술은 다른 하이드로 겔 내에서 또는 이전에 다른 물질 35에 대해보고 되었기 때문에 미세 유체 채널...

조직 공학 접근 방법은 인간의 조직과 장기 19,20의 재생과 관련하여 지난 몇 년 동안 많은 진전을 만들었습니다. 그러나, 지금까지 조직 공학의 초점은 종종 단순한 구조 또는 방광 21,22 또는 피부를 23-25으로 작은 치수가 조직에 한정되어있다. 인간의 몸은, 그러나, 세포와 세포 외 기질이 공간적으로 정의 된 방식으로 배열되어 많은 복잡한 3 차원 조직을 포함하고 있습니다. 이러한 조직을 제조하는 기술은 특정 위치에서 3 차원 구조 내에서 세포와 세포 외 기질 발판을 배치 할 수 있어야합니다. Bioprinting는 제조 복잡한 3 차원 조직의 비전 10,11,26-28을 실현 할 수있는 그런 기술이 될 가능성이있다. Bioprinting은 패터닝 소재 전송 프로세스의 사용 &quot;으로 정의 생물학적으로 상대를 조립합니다evant 재료 - 분자, 세포, 조직, 생분해 성 생체 -. 하나 이상의 생물학적 기능 &quot;4 달성하기 위해 소정의 조직과 그것은 여러 가지 기술을 포함 두 개의 서브 마이크론 해상도에 이르기까지 서로 다른 해상도 및 길이의 비늘에서 작동하는 압출 인쇄 1,12,30위한 420 μM ~ 150 ㎛의 해상도 광자 중합 29. 아니 하나의 재료 또는 재료의 조합이 각각의 방법 (31)의 요구 사항을 만족시킬 것이다. 압출 인쇄의 주요 매개 변수는 점도 겔화 시간이다 높은 점도와 빠른 겔화가 바람직하다 32. 3D 프린팅은 복잡한 형상에게 30,33,34를 만들기위한 희생 금형 쉽게 만들 수있는 기술입니다. 이 과정은 압출 bioprinter 등 신속한 프로토 타이핑 기술을 사용하여 금형의 구조를 기반으로합니다. 만든 희생 형이 사용됩니다그들의 낮은 점도와 느린 겔화 시간으로 인해 인쇄하기 어려운 물질로부터 복잡한 구조를 형성한다. 여기에 제시된 방법은 낮은 온도에서 빠르게 용해하고 정확하게 압출 될 수있는 물질로 이루어진 희생 곰팡이의 생성을 포함한다. 블록 공중 합체 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 - 폴리 (프로필렌 글리콜) 67 - 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 (또한 플루로 닉 F127 또는 폴록 사머 407라고도 함) 이러한 요구 사항을 충족. 그것은 이미 우리의 지식, 액체 환경에서의 불안정성으로 인해 수정되지 않은 버전의 인쇄에 사용 된 적이 있으며, 압출 인쇄 1 수정 버전에서 사용되었지만. 폴록 사머 407도 반전 열 반응 문제 18 즉, 냉각시 보솔 겔에서이 변화를 보여줍니다. 가장 중요한 것은, 그것은 매우 높은 충실도 복잡한 임의의 곡선 구조로 인쇄 할 수 있습니다. 이렇게하면에서 구조화 된 하이드로 겔의 생성저점도 물질이 경우 느린 겔 아가, 인쇄 희생 금형에 솔루션을 피펫 있습니다. 높은 충실도와 주조 구조화 된 하이드로 젤로부터 빠른 용출 그것은 마스크 또는 자주 리소그래피 방법에서 요구되는 스탬프를 사용하지 않고 다른 형상으로 금형을 만들 수있는 빠르고 유연한 방법을 만들어 함께 희생 형 인쇄의 조합. 주조 구조화 된 하이드로 젤은 더욱 낮은 점도로 인해 압출 인쇄에 적합하지 않은 다른 물질로 채워질 수있다. 이것은 우리의 경우 저점도 알긴산 메타 크릴 레이트 솔루션입니다. 여기에 우리가 기둥 배열의 예제를 사용하여 하이드로 겔 패턴에 대한 thermoresponsive 역 희생 금형의 방법을 제시한다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poloxamer (Pluronic F127)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2443</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAD software</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>BioCAD</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alginate methacrylate</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F13191</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>50004</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioprinter</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>Biofactory</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Valve</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>300 &mu;m Nozzel Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>150 &mu;m Inner Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeiss Axioobserver with ApoTome</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Light Source</td>
 <td>UVP</td>
 <td>Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp</td>
 <td>100 W</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

printing thermoresponsive reverse molds for the creation of patterned two-component hydrogels for 3d cell culture

Bioprinting은 신속한 프로토 타입 산업에서 그 기원을 가지고 새로운 기술입니다. 다른 인쇄 공정은 접촉 bioprinting 1-4 (압출, 딥 펜과 소프트 리소그래피), 비접촉식 bioprinting 5-7 (레이저 앞으로 전송, 잉크 제트 증착)와 같은 두 개의 광자 광중합 8로 레이저 기반 기술로 나눌 수 있습니다. 그것은 등 다른 세포 유형 17의 공동 배양의 영향으로 기본적인 생물 학적 질문에 대답하는 등 조직 공학 9-13, 바이오 센서 미세 14-16로와 도구로 많은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 일반적인 포토 리소그래피 나 소프트 리소그래피 방법과는 달리, 압출 bioprinting은 별도의 마스크 나 스탬프를 필요로하지 않는 장점이 있습니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 구조의 설계를 신속하게 운영자의 요구 사항에 따라 변경 및 조정될 수있다. 이 리소그래피 기반의보다 유연 bioprinting합니다방법. 여기에 우리가 예를 들어 하이드로 겔 내에서 기둥의 배열을 사용하여 다중 소재 3D 구조를 만들려면 희생 금형의 출력을 보여줍니다. 이 기둥은 신경 가이드 도관 내의 혈관 네트워크 또는 튜브에 대한 중공 구조를 나타낼 수 있습니다. 희생 형을 위해 선택된 재료는 폴록 사머 407, 4에 액체 우수한 인쇄 특성을 가진 thermoresponsive 폴리머이었다 ° C 및 겔화 온도 이상으로 고체 ~ 20 ° C 24.5 % W / V 솔루션 18. 이 속성은 폴록 사머 기반의 희생 금형 수요에 용출 될 수 있으며, 특히 좁은 형상에 대한 고체 물질의 느린 분해에 장점이 있습니다. 폴록 사머를 희생 금형을 만들 현미경 유리 슬라이드에 인쇄되었다. 아가는 금형에 피펫 및 겔화 될 때까지 냉각 하였다. 얼음 냉수에있는 폴록 사머의 용출 한 후, 아가로 오스 금형 보이드 알지네이트 메타 크릴 레이트 SP로 가득 차 있었다FITC 표시 피브리노겐과 iked. 채워진 빈 공간은 다음 UV와 교차 연결되었고, 구조는 에피 형광 현미경으로 몇 군데 있었다.

대표 결과는 반전 형 기술은 (그림 2) 제 2 물질로 채워질 수 구조화 된 젤을 만드는 것을 보여줍니다. 모든 인쇄 과정의 시작 부분에 인쇄 매개 변수가 먼저 최적화되어 있습니다. 매개 변수의 단계적 조정은 그림 3과 하나의 선이 인쇄 그림 4에 나와 인쇄 다층 구조가 발생합니다. 층의 두께는 (하나의 인쇄 층 후 바늘) 이용하실 너무 낮은 경우, 하나는 바늘이...

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Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K 조회수.  Cartilage Engineering & Regeneration. bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

연구

면역학 및 감염병학

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...