Nous remercions Angelika Berg à l&#39;aide de laboratoire. Ce travail a été soutenu et financé par la Société Max Planck et l&#39;École Jena for Microbial Communication (JSMC).

Une. Élevage des insectes <ol><li> Acheter ou obtenir des œufs griffes de Spodoptera littoralis partir de votre propre élevage. Les maintenir dans des plats de Pétri à température ambiante (TA) jusqu&#39;à l&#39;éclosion. </li><li> Préparer l&#39;alimentation artificielle pour les insectes d&#39;élevage comme suit: <ol><li> Faire tremper 500 g de haricots blancs au sol pendant la nuit dans 100 ml d&#39;eau. </li><li> Ajouter 9,0 g d&#39;acide ascorbique et 75 g d&#39;agar à 1 000 ml d&#39;eau distillée H 2 O et ensuite la faire bouillir. </li><li> Laisser le mélange refroidir et il se solidifie quand (à un mélange solide cireux blanc) stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Transférer les larves nouvellement écloses dans une boîte en plastique propre et les élever sur le régime artificiel à 23-25 ​​° C sous un régime de jours longs avec 16 h d&#39;éclairage et 8 heures d&#39;obscurité. Changer la nourriture tous les jours jusqu&#39;à ce que les larves passent par six stades larvaires. </li></ol> 2. 13 C-marquage de l&#39;ADN dans les bactéries intestinales métaboliquement actives <ol><li> Dissoudre 186,1 mg de glucose entièrement 13 C marqué avec de l&#39;eau distillée et déminéralisée (le trou DDH 2 O) et bien mélanger avec 100 g de nourriture artificielle pour l&#39;expérience de SIP. Assurer une concentration finale de 13 C-glucose 10 mM dans l&#39;alimentation artificielle. Cela imite la concentration en glucose in situ dans l&#39;intestin de S. littoralis larves qui se nourrissent sur ​​les plantes de coton selon Shao et al. (soumis). </li><li> Transfert 9-15 deuxième stade larvaire santé de la zone d&#39;élevage des boîtes de Petri en plastique stérile (une larve par boîte de Pétri) contenant frais 13 C-glucose dopés alimentation artificielle. Utilisation régime artificiel contenant la même quantité de glucose native (12 C-glucose), comme décrit, pour l&#39;alimentation du groupe de contrôle. </li><li> Renouveler le régime alimentaire artificiel fréquemment au cours de la période d&#39;incubation (1 jour). Utilisez conditions d&#39;élevage que dans l&#39;étape 1.3. </li><li> Recueillir neuf larves de chaque traitement pour un traitement ultérieur (de l&#39;extraction d&#39;ADN). Chaquereproduire est constitué par trois individus; faire au moins trois répétitions par traitement. </li></ol> 3. Insecte Dissection <ol><li> Nettoyer et désinfecter les outils de dissection au début du travail avec de l&#39;éthanol 70% (Outils = ciseaux Vannas, pinces et scalpel avec des lames jetables fines). </li><li> Prenez les insectes avec une pince doux et laver la peau avec de l&#39;eau distillée superficiellement. Placez-les sur de la glace pendant au moins 30 min pour les anesthésier. </li><li> Alors qu&#39;il était encore anesthésié les mettre à 0 ° C pendant 1 heure pour les tuer. Désinfecter les insectes morts superficiellement en les plongeant dans de l&#39;éthanol (70%) pour un couple de minutes. </li><li> Effectuer la dissection de l&#39;insecte dans un volume d&#39;environ 15 ml de PBS 1x déposée sur une boîte de Pétri stérile (NaCl 1XPBS = 137 mM, KCl 2,7, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM de KH 2 PO 4, ajuster le pH à 7,4 , autoclave). Assurez-vous d&#39;avoir tout le corps de l&#39;insecte complètement immergé dans la solution au cours de toute la période de dissection. </li><li> Commencez la dissection en faisant une incision dans la peau le long de la côté gauche de l&#39;insecte droite et commence à la tête et finir sur l&#39;anus. Retirez toute la peau, les tubes de Malpighi, et le corps de graisse. Changer de tampon frais avant de couper ouvert l&#39;intestin. Section de l&#39;intestin en avant, au milieu et à l&#39;intestin postérieur lorsque cela est nécessaire. Stocker le tissu dans le congélateur (-80 à -20 ° C) jusqu&#39;à ce que l&#39;extraction d&#39;ADN </li></ol> 4. Extraction de l&#39;ADN et l&#39;amplification <ol><li> Placer le tissu de l&#39;insecte dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml et sécher les échantillons à 45 ° C dans un dispositif de concentrateur sous vide. Écraser le tissu séché avec un pilon en plastique stérile. </li><li> Extraire l&#39;ADN génomique en utilisant un kit adapté pour l&#39;extraction de l&#39;ADN du sol. Transférer le tissu sec pour le tube de réaction de la trousse et suivez les instructions comme indiqué par le fabricant. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ADN élue finale à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li><li> VerifYa réussie extraction de l&#39;ADN metagénomique microbienne de l&#39;intestin de l&#39;insecte par la préparation d&#39;un essai de PCR de diagnostic en utilisant des amorces générales eubactéries 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) et 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Régler la réaction PCR comme suit: <ol><li> Régler un mélange réactionnel de 50 ul contenant du tampon 1x, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de quatre désoxynucléoside triphosphates (dNTP), 2,5 U de Taq DNA polymerase, 0,5 mM de chaque amorce et 60 ng de l&#39;ADN extrait comme matrice. </li><li> Exécuter les réactions de PCR en utilisant un thermocycleur de la manière suivante: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min, suivie de 35 cycles: 94 ° C pendant 45 s, hybridation à 55 ° C pendant 30 secondes, et extension à 72 ° C pendant 1 min . Utiliser une étape d&#39;extension finale à 72 ° C pendant 10 min. </li><li> Vérifiez l&#39;amplification par PCR avec succès dans un agarose à 1% électrophorèse bromure d&#39;éthidium (EB) de gel coloré (dissoudre 1 g d&#39;agarose dans 100 ml de tampon TAE 1X et tache avec 1 microlitre EB). Dépôt de 5 pi de ee produit PCR + 1 microlitre de 6x colorant de charge dans les poches de gel. (1x TAE = 40 mM de Tris-Base, 20 mM d&#39;acide acétique glacial, EDTA 1 mM, ajuster le pH à 8). </li><li> Exécutez le gel en utilisant un tampon 1xTAE à 300 V, 115 mA pour ca. 20 min dans une chambre d&#39;électrophorèse. En utilisant une chambre de documentation de gel (transilluminateur UV connecté à un appareil photo numérique et ordinateur) observer le gel et comparer la taille de votre produit final avec le marqueur de gène également chargé; la bonne taille des amplicons doit être d&#39;environ 1,5 kb. </li></ol></li><li> Stocker les produits de PCR dans des conditions de surgélation, de préférence -80 ° C, jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. Séparation ADN-CsCl ultracentrifugation en gradient <ol><li> Préparer les réactifs pour les gradients pour ultracentrifugation comme suit: <ol><li> Préparer un M de chlorure de césium (CsCl) solution 7.163 en dissolvant progressivement 603,0 g de CsCl dans le trou DDH 2 O et remplir jusqu&#39;à un volume final de 500 ml. </li><li> Précision déTermine la densité de la solution préparée en pesant CsCl une aliquote de 1,0 ml sur une balance à trois chiffres en triple exemplaire. Ceci est habituellement comprise entre 1,88 et 1,89 g / ml à température ambiante. </li><li> Préparer le tampon de gradient (Tris 100 mM, KCl 100 mM et EDTA 1 mM) en combinant 50 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml d&#39;EDTA 0,5 M (pH 8) et de 3,75 g de KCl dans un finale volume de 500 ml en utilisant le trou DDH 2 O. Filtre (0,22 um) et stériliser à l&#39;autoclave cette solution. </li></ol></li><li> ADN séparation <ol><li> Après avoir déterminé la concentration individuelle d&#39;ADN des insectes traités, mesurée au point 4.3, mettent en commun les insectes correspondant à une répétition ensemble et normaliser leur concentration d&#39;ADN pour s&#39;assurer que chacun, contribue également à la population échantillonnée. Une concentration finale de 500-5000 ng d&#39;ADN (mesurer à nouveau la concentration finale) est approprié pour le procédé d&#39;ultracentrifugation 21. </li><li> Pour mettre en place le milieu dégradé, combiner l&#39;ADN quantifié, un tampon gradientd 4,8 ml de solution 7,163 M CsCl ensemble pour un volume mixte de 6,0 ml dans un tube de 15 ml à bouchon à vis stérile (génération d&#39;un mélange moyen de l&#39;ADN dégradé). </li><li> Placez délicatement le mélange moyen de l&#39;ADN dégradé préparé dans un tube de 5,1 ml d&#39;ultracentrifugation (remplir jusqu&#39;à la base du col du tube) en utilisant une seringue et une aiguille. Éviter pompage ou de formation de bulles d&#39;air. Inclure au moins un gradient de vide (en utilisant le trou DDH 2 O à la place de l&#39;ADN) dans chaque cycle de centrifugation selon un gradient de référence. </li><li> tube de la balance des paires à l&#39;intérieur de 10 mg de poids après chaque support gradient requis est rempli dans le tube d&#39;ultracentrifugeuse respectif. Sceller le tube avec un &quot;Topper Tube&quot; et veiller à ce que le joint est sans fuite en inversant le tube et en appliquant une pression modérée à la main. </li><li> Utilisez un rotor vertical près de huit puits pour maintenir 5,1 ml tubes d&#39;ultracentrifugation pour l&#39;ultracentrifugation. Bien sceller les puits de rotor et charger le rotor dans le ultracentrifugation selon la males instructions tion du fabricant. Définir les conditions d&#39;ultracentrifugation: rotation à 50 000 tours par minute (environ 177 000 xg), la température à 20 ° C, et ultracentrifugation durée de 40 heures avec le vide. Sélectionnez une accélération maximale et la décélération sans frein. </li><li> Une fois terminé, retirez avec précaution les tubes du rotor de la centrifugeuse en utilisant une pince. Placez-les dans un rack sans perturber les gradients formés dans les tubes. Traiter les échantillons de fractionnement gradient dès que possible afin de minimiser toute diffusion. </li></ol></li><li> Récupération de l&#39;ADN de dégradés isopycnique séparées par fractionnement <ol><li> Utilisation d&#39;un système de pompe HPLC précis pour réaliser le fractionnement du gradient, qui sépare également les gradients formés par le haut méthode de déplacement du tube d&#39;ultracentrifugeuse. Raccordez la pompe HPLC (gradient de débit de 100%) à la bouteille remplie avec 1 L déplacement ddH 2 O et bien attacher le tuyau de pompe ouvert avec un 23 G 1 aiguille de la seringue. Ajouter suffisamment de bromophenol colorant bleu au trou DDH 2 O pour donner une couleur bleu foncé. Ceci facilite la visualisation de l&#39;interface entre le milieu de gradient et le déplacement du trou DDH 2 O. </li><li> Régler la pompe à un débit de 850 ul / min et l&#39;écoulement du système s&#39;équilibrer jusqu&#39;à ce qu&#39;une goutte de la couleur bleue trou DDH 2 O émerge hors de l&#39;aiguille de la seringue. </li><li> Fixez soigneusement le tube d&#39;ultracentrifugation à un support de fixation et percer le fond du tube avec une seringue 23 G 1 dans la longue aiguille. Raccorder la pompe au tube d&#39;ultracentrifugation en insérant l&#39;aiguille fixée à la tubulure de la pompe dans la partie supérieure du tube, et collecter des gouttes à partir du fond directement dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml stériles. Recueillir une fraction toutes les 30 secondes, un montant d&#39;environ 425 pi par fraction et un total de 12 fractions par gradient. Notez que la dernière fraction (fraction 12) contient habituellement le déplacement trou DDH 2 O et doit être jeté. </li><li> Après fractionnement, measure la densité de toutes les fractions séparées utilisant une balance analytique tel que mentionné à l&#39;étape 5.1.2. </li><li> Précipiter l&#39;ADN de chaque fraction (environ 425 ul) en ajoutant d&#39;abord 1 ul de glycogène (20 ug / ul dans le trou DDH 2 O, passé à l&#39;autoclave) en tant que support pour la précipitation de faible quantité d&#39;ADN. Mélangez bien par inversion. </li><li> Ajouter deux volumes (850 ul) et de polyéthylène glycol (PEG) solution (dissolution de 150 g de polyéthylène glycol 6000 et de 46,8 g de NaCl dans le trou DDH 2 O pour obtenir un volume total de 500 ml. Filtrer, stériliser et autoclave. La solution de PEG est de 30 % de PEG 6000 et 1,6 M de NaCl), et mélanger à nouveau en inversant dix fois. </li><li> Laisser les tubes à température ambiante pendant au moins deux heures (si nécessaire, pendant la nuit) pour précipiter l&#39;ADN. </li><li> Centrifuger les précipités à 13 000 xg pendant 30 min à température ambiante. Une pastille visible devrait former. </li><li> Retirez délicatement le surnageant avec une pipette et laver le culot avec 500 ul de 70% d&#39;éthanol. Centrifuger sous le mêmeconditions de 10 min à nouveau. </li><li> Prenez soin de le surnageant et sécher à l&#39;air le culot à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Reprendre le culot d&#39;ADN séché dans 30 pl de ddH 2 O et bien mélanger en tapotant doucement le tube. Quantifier l&#39;ADN dans chaque fraction gradient comme dans l&#39;étape 4.3 Stocker les échantillons sous -20 ou -80 ° C si le stockage à long terme est nécessaire. </li></ol></li></ol> 6. ADN Caractérisation par Pyroséquençage <ol><li> S&#39;assurer que l&#39;ADN natif non marqué (12 C) occupe la plage de densité de 1,705 g / ml à 1,720 g / ml, alors que 13 l&#39;ADN marqué au C a une masse volumique de 1,720 à 1,735 g environ / ml. Noter que les deux indigène et 13 ADN C marqué extrait à partir d&#39;échantillons environnementaux peut s&#39;étendre sur plusieurs fractions de gradient. Attendez-vous à l&#39;ADN de lumière pour être associé avec des fractions 9-11 et l&#39;ADN lourd pour être associé avec des fractions 4-6. </li><li> Combiner les fractions clés pour créer une seule &quot;compilé&quot; fraction ac représentantCording à l&#39;allocation spécifique de pointe de l&#39;ADN de la densité résolu. Alternativement, d&#39;autres moyens d&#39;examiner les fractions séparées en utilisant la spectrométrie isotopique rapport de masse (IRMS) 22 ou une méthode de prise d&#39;empreintes digitales, comme dénaturant gradient électrophorèse sur gel (DGGE) 23, peuvent aider à choisir fractions appropriées avant le séquençage. </li><li> Effectuer pyroséquençage de 16S ARNr bactériens amplifiés par PCR des gènes de fractions lourdes, moyennes et légères compilés de chaque individu gradient. En utilisant cette méthode, l&#39;identification de la lignée et l&#39;abondance relative des espèces de bactéries métaboliquement actives dans le SIP est incubé les échantillons possible. Effectuer pyroséquençage comme suit: <ol><li> Effectuer amplicon pyroséquençage l&#39;aide d&#39;un instrument Roche FLX 454 avec des réactifs de titane. </li><li> Préparer amplicons barres pour le multiplexage en utilisant l&#39;amorce de fusion mis Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) et Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 prolongé avec ee amorce respective, adaptateur A / B et identifiants multiplex spécifiques à l&#39;échantillon (MID). </li><li> Appliquer une PCR en une étape avec 30 cycles, en utilisant une polymerase Hot Start Taq, pour générer la bibliothèque de séquençage. </li><li> Séquencer les amplicons sur la base du protocole de fournisseur, et s&#39;étendent le lit de la direction avant (Gray28F) tel que décrit dans <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> . </li></ol></li></ol> 7. Pyroséquençage analyse de données <ol><li> Analyser la séquence premières lectures généré par le pyroséquençage 454 avec les «idées quantitatives en écologie microbienne&quot;, pipeline logiciel de QIIME 26. Effectuer le traitement comme suit: <ol><li> Initialement, convertir le fichier SFF 454-machine générée à FASTA, QUAL et fichiers Flowgram avec le script process_sff.py. </li><li> Valider le fichier de mappage (basé sur check_id_map.py) et attribuer multiplexé lit à sam biologiqueples avec le script split_libraries.py. Découpez le faible qualité se termine avec une taille de fenêtre glissante de 50 et un paramètre moyen de coupure de qualité de 25, éliminent également de courtes séquences ambiguës (la longueur &lt;200 pb) de l&#39;ensemble de données. </li><li> Débruiter les données en utilisant le 454 denoise_wrapper.py. </li><li> Ensuite, la grappe de haute qualité lit en unités taxonomiques opérationnelles (UTO) en utilisant la méthode du multiple OTU la cueillette (de pick_otus.py avec 97% de similarité de séquence seuils). </li><li> Choisissez une séquence représentant de chaque OTU utilisant pick_rep_set.py. </li><li> Affecter taxonomie à l&#39;ensemble de la séquence représentative fondée sur assign_taxonomy.py. Utiliser le classificateur projet de base de données ribosomique (RDP) avec un minimum de confiance pour enregistrer cession prévu à 0,80. </li><li> Aligner la séquence représentant ensemble contre les préalignée Greengenes base 16S séquences en utilisant l&#39;algorithme pynast (align_seqs.pyavec la séquence minimale identité pour cent ensemble à 75). </li><li> En outre, épuiser chimères d&#39;une analyse complémentaire en exécutant identify_chimeric_seqs.py. </li><li> Retirez toutes les positions (pas utiles pour l&#39;inférence phylogénétique) avec le modèle de lanemask (de filter_alignment.py) avant de construire un arbre phylogénétique (de make_phylogeny.py) de l&#39;écart. </li><li> Enfin, générer des tableaux UTO avec make_otu_table.py, décrivant l&#39;apparition de phylotypes bactériennes dans chaque échantillon. Utilisez le tableau OTU pour construire la carte thermique pour comparer l&#39;abondance et l&#39;activité bactérienne. </li><li> Si nécessaire, calculer l&#39;alpha et bêta de la diversité au sein de et entre les échantillons, respectivement. De la même manière, les courbes de raréfaction (graphiques de la diversité par rapport à la profondeur de séquençage) et principal Coordonnées analyse (PCoA) parcelles représentant les relations entre les communautés microbiennes peuvent également être préparés. </li></ol></li></ol>

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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;intestin de la plupart des insectes abrite une communauté microbienne riche et complexe; généralement 10 7 -10 9 cellules procaryotes déposer là, plus nombreux que les propres cellules de l&#39;hôte dans la plupart des cas. Ainsi, l&#39;intestin de l&#39;insecte est un &quot;point chaud&quot; pour les activités microbiennes différentes, représentant de multiples aspects des relations microbiennes, de la pathogenèse d&#39;obliger mutualisme 27. Bien que de nombreuses étud...

Associations symbiotiques insectes bactériennes sont connus pour un grand nombre d&#39;espèces d&#39;insectes 7. Dans ces associations symbiotiques, les micro-organismes jouent un rôle important dans la croissance et le développement des insectes. Les microbes ont été montrés pour contribuer à une reproduction des insectes, des phéromones biosynthèse 3, de la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, et la digestion de la nourriture inaccessible à l&#39;hôte. En dépit de la grande variété des associations intestinale bactérienne, on sait beaucoup moins sur le rôle fonctionnel qu&#39;ils jouent en faveur de l&#39;insecte. Seulement dans le cas des termites, la digestion symbiotique de la lignocellulose réalisé par les procaryotes, les protozoaires et les champignons, a été largement étudiée 8,9. Contrairement à cela, on sait peu sur l&#39;association symbiotique présente dans l&#39;intestin des insectes généralistes à savoir la noctuelle du coton Spodoptera littoralis. Par ailleurs, en raison de leur changement fréquent des plantes hôtes, généralist insectes et de leurs communautés bactériennes associées de l&#39;intestin sont exposés en permanence à de nouveaux défis liés à leurs habitudes alimentaires consommant des plantes avec une pléthore de composés phytochimiques. A côté de cela, l&#39;environnement de l&#39;intestin dans les lépidoptères, représente en soi un environnement difficile pour la croissance des bactéries en raison de l&#39;intestin pH élevé 10. En particulier dans le cas de S. littoralis, il varie de 10,5 dans l&#39;intestin antérieur, ca. 9 dans l&#39;intestin moyen de pH près de 7 dans l&#39;intestin postérieur 11. D&#39;autre part, la communauté bactérienne associée à l&#39;intestin de S. littoralis est simple. Tang, Freitak, et al 12. Ont rapporté un maximum de 36 phylotypes appartenant à un total de 7 espèces bactériennes différentes que les seuls membres de la communauté bactérienne associée à cet insecte. En outre, aucune procédure d&#39;élevage compliqué est nécessaire pour la croissance des insectes dans le laboratoire. En outre, ce et le cycle de vie court de l&#39;insecte faciliter multi-gétudes enerational, tournant cette espèce dans un système de modèle idéal pour étudier les interactions intestin-microbe. Avec l&#39;avènement des technologies de séquençage basées sur la PCR, le nombre d&#39;études traitant de l&#39;intestin biote de plusieurs organismes (par exemple les humains, les insectes ou les organismes marins) a augmenté. De plus, les résultats sont indépendants de l&#39;isolement et de culture des bactéries de l&#39;intestin hébergé comme par le passé. Près de 99% des bactéries ne sont pas cultivables et la simulation des conditions environnementales régnant dans l&#39;intestin est difficile 12. En utilisant la PCR, des fragments de gène d&#39;ARNr 16S (un marqueur de gène phylogénétique largement utilisé chez les bactéries) peuvent être amplifiés de manière sélective à partir d&#39;une matrice d&#39;ADN mixte des communautés bactériennes intestinales, séquencées, et clones. Avec cette information, l&#39;utilisateur est capable d&#39;identifier les espèces bactériennes après avoir récupéré les informations de séquence à partir de bases de données publiques 13,14. Néanmoins, le séquençage des approches pour décrire bactériennecommunautés restent insuffisants en raison du manque d&#39;informations sur la contribution métabolique intrinsèque de chacune des espèces au sein de la communauté. Isotopes stables de sondage (SIP) est une technique de culture libre-prometteur. Il est souvent utilisé en microbiologie environnementale à analyser phylogénies microbiennes liées à certaines activités métaboliques. Ce résultat est obtenu en suivant les isotopes stables, marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que des acides gras de phospholipides dérivés, l&#39;ADN et l&#39;ARN 5. Lorsque l&#39;on considère les acides nucléiques, la méthode est basée sur la séparation de l&#39;ADN 13 marqué au carbone ou de l&#39;ARN à partir de l&#39;ADN non marqué par ultracentrifugation en gradient de densité-6. En raison de cette connexion directe entre le marqueur d&#39;ADN et l&#39;activité métabolique, une analyse moléculaire en aval des acides nucléiques identifie les espèces et fournit des informations sur les activités métaboliques. En outre, la combinaison de l&#39;ADN-SIP et pyroséquençage appliquée parPilloni, von Netzer, et al. 15, permet une identification simple et sensible notamment des espèces bactériennes présentes dans la fraction lourde de 13 C-ADN marqué. Jusqu&#39;à présent, cette technique a été appliquée pour décrire les communautés bactériennes impliquées dans les processus biogéochimiques dans le sol sous aérobies et anaérobies 16,17 18,19 conditions. Outre l&#39;utilisation en sciences de l&#39;environnement, la technique a été appliquée dans les sciences médicales tel que rapporté par Reichardt, et al. 5, qui décrit les activités métaboliques des différents groupes phylogénétiques du microbiote intestinal humain en réponse à un glucide non digestible. Ici, nous utilisons 13 C-glucose de «label» de l&#39;ADN des espèces bactériennes métaboliquement actives dans l&#39;intestin. Le glucose est un sucre utilisé par la plupart des espèces bactériennes le long de la voie généralisée Entner-Doudoroff (ED), bien que des exceptions sont connues 20. Cejustifie l&#39;utilisation de 13 C-glucose comme sonde métabolique fiable qui fournit un lien entre les métabolites d&#39;intérêt et la source de carbone le long des voies établies. En fonction de la question scientifique, d&#39;autres substrats, à savoir 13 C-méthane, le 13 CO 2, ou de plantes obtenues sous une atmosphère de 13 CO 2, peut être utilisé pour traiter des activités métaboliques. À ce stade, nous présentons le protocole appliqué dans la caractérisation métabolique de la communauté bactérienne de l&#39;intestin d&#39;un insecte généraliste, à savoir S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). En outre, la technique a été couplé à pyroséquençage, qui à son tour permet l&#39;identification de la communauté bactérienne de l&#39;intestin des insectes avec une haute résolution et de précision. Comme le substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé au cours des expériences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Entrailles de la plupart des insectes sont habitées par des communautés complexes de bactéries non pathogènes symbiotiques. Dans ces communautés microbiennes, il est possible d&#39;identifier les espèces de bactéries commensales ou mutualistes. Ces derniers chers, ont été observées pour servir plusieurs fonctions à l&#39;insecte, à savoir aider à une reproduction des insectes, en stimulant la réponse immunitaire 2, la production de phéromone 3, ainsi que la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, entre autres. En raison de l&#39;importance de ces associations, de nombreux efforts ont été réalisés pour caractériser les communautés vers le bas pour les membres individuels. Cependant, la plupart de ces efforts ont été soit basées sur des méthodes de culture ou invoqué la génération de fragments de gènes ARNr 16S qui ont été séquences pour l&#39;identification finale. Malheureusement, ces approches ne identifié les espèces bactériennes présentes dans l&#39;intestin et n&#39;ont fourni aucune informations sur l&#39;activité métabolique des micro-organismes. Afin de caractériser l&#39;espèce bactérienne métaboliquement actives dans l&#39;intestin d&#39;un insecte, on a utilisé des isotopes stables de palpage (SIP) in vivo employant 13 C-glucose comme substrat universel. Il s&#39;agit d&#39;une technique de culture libre-prometteuse qui permet la liaison de la phylogénie microbiennes à leur activité métabolique particulier. Cela est possible en suivant, isotopes stables marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que l&#39;ADN et de l&#39;ARN 5. L&#39;incorporation d&#39;isotopes 13 C dans l&#39;ADN augmente la densité de l&#39;ADN marqué par rapport à la non marqué (12 C) une. En fin de compte, l&#39;ADN marqué au 13 C ou de l&#39;ARN est séparé par ultracentrifugation en gradient de densité à partir de la C-12 non marqué similaire une 6. Analyse moléculaire ultérieure des isotopomères d&#39;acides nucléiques séparés assure la liaison entre l&#39;activité métabolique et de l&#39;identité de l&#39;espèce. Ici, nous présentons le protocole utilisé pour caractériser les bactéries métaboliquement actives dans l&#39;intestin d&#39;un insecte généraliste (notre système de modèle), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L&#39;analyse phylogénétique de l&#39;ADN a été effectuée à l&#39;aide pyroséquençage, ce qui a permis une haute résolution et une précision dans l&#39;identification de la communauté bactérienne de l&#39;intestin des insectes. Comme substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé dans les expériences. Le substrat a été introduit dans les insectes en utilisant un régime artificiel.

Pour réaliser un étiquetage adéquat des bactéries métaboliquement actives présentes dans l&#39;intestin d&#39;insecte, l&#39;insecte doit être exposée sur le substrat 13 de C-riche pendant une période préalablement optimisé suffisante pour permettre la séparation de la fraction plus lourde marqué facilement à partir de l&#39;allumeur non marqué une. Dans notre cas, 13 C-glucose a été complétée dans le régime alimentaire artificiel à une concentration finale de 10 mM pendant 1 j...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

La communauté bactérienne active associée à l&#39;intestin de Spodoptera, a été déterminée par des isotopes stables-sondage (SIP) couplé à pyroséquençage. En utilisant cette méthodologie, l&#39;identification des espèces de bactéries métaboliquement actives au sein de la communauté a été fait avec une haute résolution et de précision.

Identification des bactéries métaboliquement actif dans l&#39;intestin du généraliste<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Par ADN isotopes stables de palpage Utilisation<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

15.2K vues.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  La communauté bactérienne active associée à l'intestin de Spodoptera, a été déterminée par des isotopes stables-sondage (SIP) couplé à pyroséquençage. En utilisant cette méthodologie, l'identification des espèces de bactéries métaboliquement actives au sein de la communauté a été fait avec une haute résolution et de précision. 

Vidéo: Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extraction d&#39;ADN de l&#39;microbes de l&#39;intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l&#39;intestin

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Recherche

Biologie

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

L&#39;ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualisation de la réplication de l&#39;ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d&#39;ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocole expérimental pour l’utilisation de drosophile comme un système modèle d’invertébrés pour les essais de toxicité en laboratoire

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques de la cavité buccale

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...