Cette étude a été soutenue par une carrière NSF Grant (MCB0954016) et une subvention de recherche du DOE des bioénergies (DEFG0208ER64694).

1. La culture cellulaire (figure 1) <ol><li> Cultiver des cellules dans un milieu minimal avec des oligo-éléments, sels, vitamines, et les substrats de carbone spécifiquement étiquetés qui sont les meilleurs pour enquête voie. Utilisez soit des flacons secouant ou bioréacteurs pour la culture cellulaire. Nutriments organiques, tels que l&#39;extrait de levure, peuvent interférer avec la mesure de l&#39;étiquetage des acides aminés et ne peuvent donc pas être présents dans le milieu de culture. </li><li> Surveiller la croissance cellulaire par la densité optique de la culture à une longueur d&#39;onde optimale (par exemple, OD 730 pour Cyanothece 51142) avec un spectrophotomètre UV / VIS. </li><li> Les cellules peuvent d&#39;abord être cultivées dans un milieu non-étiquetés. Les cellules du Moyen-log phase de croissance sont à utiliser de préférence pour l&#39;inoculation (3% (v / v) par rapport inoculation volume) de la moyenne étiquetés. La culture doit être étiqueté sous-cultivé (3% Ratio d&#39;inoculation v / v) dans le même milieu étiquetés pour éviter l&#39;introduction de la non-étiquetés de carbone de l&#39;inoculum initial. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. L&#39;extraction des acides aminés <ol><li> Récolte des sous-cultures de cellules (10 mL) en phase de croissance moyenne log par centrifugation (10 min, 8000 xg). </li><li> Reprendre le culot dans 1,5 ml de HCl 6M et le transférer sur un verre clair, vis-dessus du flacon GC. Cap les flacons et les placer dans un four à 100 ° C pendant 24 heures pour hydrolyser les protéines en acides aminés de la biomasse. L&#39;hydrolyse de la biomasse granulés peuvent produire 16 des 20 acides aminés communs (figure 2) 5. La cystéine et le tryptophane sont dégradées, et la glutamine et l&#39;asparagine sont convertis au glutamate et d&#39;aspartate, respectivement. </li><li> Centrifuger la solution d&#39;acide aminé à 20 000 × g pendant 5 min à l&#39;aide de 2 ml tubes Eppendorf, et de transférer les surnageants de nouveaux flacons GC. Cette étape élimine les particules solides dans la solution d&#39;hydrolyse. </li><li> Retirez le couvercle flacon GC et sécher les échantillons complètement sous un courant d&#39;air en utilisant un Thermo Scientific Reacti-Vap évaporateur (note: un lyophilisateur peut également être utilisé to échantillons secs). Cette étape peut être fait durant la nuit. </li></ol> 3. Dérivatisation des acides aminés et GC-MS des conditions L&#39;analyse des acides aminés ou chargé / hautement métabolites polaires par CG exige que ces métabolites être dérivé, de sorte que les acides aminés sont volatils et peuvent être séparés par chromatographie en phase gazeuse 2. <ol><li> Dissoudre les échantillons séchés avec 150 pi de tétrahydrofuranne (THF) et 150 pi de N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide réactif de dérivatisation. </li><li> Incuber tous les échantillons dans un four ou un bain d&#39;eau entre 65 et 80 ° C pendant 1 heure. Vortex occasionnellement pour s&#39;assurer les métabolites dans le flacon sont dissous. </li><li> Centrifuger les échantillons à 20 000 × g pendant 10 min, puis transférer le surnageant dans de nouveaux flacons GC. Le surnageant doit être une solution claire et jaunâtre. En raison de la saturation des détecteurs, la précision de mesure GC-MS peut être affectée par la haute concentration d&#39;injecter TBDMS dérivés des acides aminés (ces échantillons montre souvent de couleur brun foncé), par conséquent, nous devrions diluer ces échantillons en utilisant du THF avant la GC-MS de mesure 6. </li><li> Analyser les échantillons par GC-MS (utiliser une division de 1:5 ou de 1:10 injection de volume, 1 = pl, gaz vecteur hélium = 1,2 mL / min). Utilisez le programme de température suivant GC: maintenir à 150 ° C pendant 2 minutes, d&#39;augmenter de 3 ° C par minute à 280 ° C, augmenter à 20 ° C par minute à 300 ° C, puis maintenez pendant 5 minutes. Délai solvant peut être défini comme ~ 5 min (pour une colonne de 30 mètres de GC). La gamme de rapport masse sur charge (m / z) dans la SEP peut être réglée entre 60 et 500. </li></ol> 4. GC-MS analyse des données <ol><li> TBDMS de mesure dérivés d&#39;acides aminés peuvent également être touchés par la discrimination isotopique dans la séparation GC. Isotopes légers déplacer légèrement plus rapide que soulèvent les isotopes dans la colonne GC. Afin de réduire les biais de mesure potentiel, nous pouvons en moyenne le spectre de masse de l&#39;ensembleaminés large pic de l&#39;acide 6 </li><li> Le GC et MS spectres de métabolites dérivés TBDMS ont été signalés avant le 7. Le temps de rétention GC et l&#39;unique m / z des pics pour chaque acide aminé sont illustrés dans la Figure 3. </li><li> Dérivatisation des acides aminés ou des métabolites centrale introduit d&#39;importantes quantités d&#39;isotopes naturels étiquetés, y compris 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%), et 30 Si (3,09%). Le bruit de mesure des isotopes naturels dans le spectre de masse isotopomère premières peut être corrigé en utilisant le logiciel publié 5, 8. Les données finales de marquage isotopique sont déclarés en fractions de masse, par exemple, M 0, M 1, M 2, M 3 et M 4 (représentant des fragments contenant zéro à quatre carbones 13 C étiquetés). </li><li> Mesure des acides aminés peut fournir des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur cruciale: 2-oxo-glutarmangé, 3-P-glycérate, l&#39;acétyl-CoA, érythrose-4-P, l&#39;oxaloacétate, phosphoénolpyruvate, du pyruvate et le ribose-5-P. Les schémas d&#39;étiquetage de ces métabolites peuvent être utilisées pour identifier plusieurs voies métaboliques centrales (figure 2) 9. Le résultat des expériences d&#39;étiquetage peut être confirmée en utilisant des méthodes de biochimie d&#39;autres (par exemple, la RT-PCR). </li></ol> 5. L&#39;analyse des voies à l&#39;aide de données étiquetées acide aminé En examinant seulement quelques acides aminés clés produite à partir de 13 bien conçu expériences de traçage C, nous pouvons révéler plusieurs voies uniques ou des activités enzymatiques sans effectuer une analyse du flux sophistiqués 13 C-métabolique du métabolisme central entier. <ol><li> Entner-Doudoroff voie: [1 - 13 C] glucose peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l&#39;étiquetage sérine sera sensiblement inférieur à l&#39;étiquetage de l&#39;alanine 10. </li><li> Ramifiée cycle de Krebs: [1 - 13 C]pyruvate peut être utilisé comme source de carbone. Si le cycle de Krebs est cassé, l&#39;aspartate peut être marqué par deux carbones, tandis que le glutamate est étiqueté avec un seul carbone 11, 12. </li><li> Fixation du CO2 par Calvin-Benson-Bassham cycle dans un métabolisme mixotrophes: non étiquetés CO 2 et substrats marqués au carbone sont tous deux utilisés comme sources de carbone. Si le cycle de Calvin est fonctionnel, la sérine et l&#39;histidine étiquetage sera considérablement diluée, comparé à d&#39;autres acides aminés. Une telle méthode permet de déterminer le CO 2 relativement fixation lorsque les sources de carbone organique sont présents dans les 13 moyennes. </li><li> Oxydatif voie des pentoses phosphates: [1 - 13 C] glucose peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l&#39;alanine non étiqueté sera&gt; 50% 12. </li><li> Anaplerotic voie (par exemple, le PEP + CO oxaloacétate A 2): 13 CO 2 et non étiquetés de carbone substrats (par exemple, la glycérine, pyruvate) peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l&#39;étiquetage aspartate sera considérablement enrichi, en comparant à l&#39;alanine et la sérine 13. </li><li> Re citrate synthase: [1 - 13 C] pyruvate peut être utilisé comme source de carbone. Si l&#39;enzyme est active, le glutamate est étiqueté en β-carboxyle du groupe 3, 4. </li><li> Voie Citramalate: [1 - 13 C] pyruvate [2 - 13 C] glycérol, ou [1 - 13 C] acétate peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, les montants étiquetage leucine et l&#39;isoleucine sont identiques 14. </li><li> Serine-isocitrate lyase cycle de: [1 - 13 C] pyruvate ou [1 - 13 C] lactate peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, le carbone troisième position dans la sérine seront étiquetés 15. </li><li> L&#39;utilisation des nutriments (par exemple, acides aminés exogènes): un milieu de culture avec des substrats carbonés dûment étiquetés et non étiquetés acides aminéspeuvent être utilisés. Si les cellules de manière sélective utilisent ces nutriments complétées non étiquetés, nous allons voir une dilution significative étiquetage de ces acides aminés dans la biomasse. Cette méthode peut être utilisée pour étudier ce qui suppléments nutritifs sont préférés par la cellule 16. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Des études récentes ont relancé la bioénergie intérêt dans l&#39;utilisation de microorganismes phototrophes roman pour la production de bioénergie et de captage du CO 2. Dans les dernières années, un assez grand nombre 13C-métabolisme des analyses, y compris les analyses avancées de flux métaboliques 13C (13C-AMF), ont été appliquées pour enquêter sur les métabolismes central dans les bactéries phototrophes, car la connaissance biochimique des voies métaboliques central n&#39;est pas bien fondée dans ces organismes non-modèles 10, 11, 17-20. Ici, nous présentons un exemple de la découverte d&#39;une voie de remplacement dans l&#39;isoleucine Cyanothece 51142 21. Cyanothece 51142 ne contient pas les enzymes (EC 4.3.1.19, la thréonine ammonia-lyase), qui catalyse la conversion de la thréonine à 2-cétobutyrate dans la voie de synthèse de l&#39;isoleucine typique. Pour résoudre la voie isoleucine, nous grandissons Cyanothece 51142 (20 ml) en moyenne 22 ASP2 avec 54 mM de glycérol (2-13C,&gt; 98%). Cyanothece 51142 utilise 2 e position du glycérol étiquetés comme source de carbone principale. Nous observons que la thréonine et alanine ont une étiquette carbone, tandis que l&#39;isoleucine est étiqueté avec trois carbones. Par conséquent, la synthèse dans Cyanothece 51142 ne peut pas être dérivée de la route thréonine employé par la plupart des organismes (figure 4). D&#39;autre part, la leucine et l&#39;isoleucine ont des modes d&#39;étiquetage identique, basé sur des fragments (M-15) + et de fragment (M-159) +. Par exemple, les données isotopomère de [M-15] + (contenant des acides aminés non fragmentés) montrent étiquetage identique pour la leucine (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,21 M2, M3 = 00,69) et l&#39;isoleucine (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,24 M2, M3 = 0,67). Ainsi leucine et l&#39;isoleucine doivent être synthétisés à partir des mêmes précurseurs (à savoir, le pyruvate et l&#39;acétyl-CoA). Cette observation est cohérente avec la transition de carbone marqué dans la voie de synthèse citramalate isoleucine. Pour confirmer cette voie, on recherche le génome commun de bases de données Institut et de trouver la présence d&#39;une synthase citramalate Cima (cce_0248) dans Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Le 13 C-assistés étapes analyse des voies. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Les acides aminés utilisés pour acquérir le modèle d&#39;étiquetage de leurs précurseurs métaboliques. L&#39;APECA, l&#39;acétyl-CoA; AKG, α-cétoglutarate; C5P, le ribose 5-phosphate; CIT, le citrate; E4P, érythrose 4-phosphate; G6P, glucose-6-phosphate; OAA,<html> oxaloacétate; PEP, phosphoénolpyruvate; PGA, la 3-phosphoglycérate; PYR, pyruvate. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Pics CG pour 16 acides aminés. TBDMS dérivés des acides aminés sont fissurés par MS en deux fragments: (M-57) +, contenant l&#39;acide aminé ensemble, et (M-159) +, ce qui manque au groupe α carboxyle de l&#39;acide aminé. Pour la leucine et l&#39;isoleucine, la + (M-57) a été recouverte par d&#39;autres pics de masse. Nous vous suggérons d&#39;utiliser fragment (M-15) + d&#39;analyser le marquage des acides aminés ensemble. Le groupe (F302) + est détecté dans la plupart des acides aminés, qui ne contient que le premier (α-carboxyle du groupe) et les carbones secondes dans une épine dorsale d&#39;acide aminé. Parce que ce pic MS a souvent élevé de bruit-signal ratios (F302) + n&#39;est pas recommandé pour l&#39;analyse quantitative des flux métaboliques 7. igure 4 &quot;/&gt; Figure 4. Étiquetage des transitions dans les voies de l&#39;isoleucine en Cyanothece 51142 (modifié d&#39;après notre précédent article) 21.

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	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce protocole consiste à alimenter la cellule avec un substrat marqué et mesurer les tendances résultant de marquage isotopique dans les acides aminés via la GC-MS. Depuis de données MS (m / z ratios) donner juste la quantité globale de l&#39;étiquetage des ions MS, nous avons à évaluer les distributions isotopomère d&#39;acides aminés en examinant les rapports m / z de deux non fragmentés (M-57) + et fragmenté des acides aminés (ie, (M-159) + et (F302) +). Par ailleurs, nou...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Substrat de carbone marqué </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td><td> Dépendent de l&#39;exigence expérimentale </td><td> Site Web: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Chromatographe en phase gazeuse </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, modèle 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> Colonnes GC </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectromètre de masse </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-Vap EvaporAtor </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Pour le séchage des échantillons d&#39;acides aminés </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

Les microbes ont des voies métaboliques complexes qui peuvent être étudiés en utilisant des méthodes de biochimie et fonctionnelles en génomique. Une technique important d&#39;examiner le métabolisme des cellules centrales et de découvrir de nouvelles enzymes est de 13 C-analyse assistée par le métabolisme 1. Cette technique est basée sur le marquage isotopique, par lequel les microbes sont nourris avec un substrats C 13 étiquetés. En retraçant les chemins de transition entre les atomes de métabolites dans le réseau biochimique, nous pouvons déterminer les voies fonctionnelles et découvrir de nouvelles enzymes. Comme une méthode complémentaire à la transcriptomique et la protéomique, les approches de isotopomère analyse assistée par des voies métaboliques contiennent trois grandes étapes 2. Tout d&#39;abord, nous faisons pousser des cellules avec des substrats étiquetés C 13. Dans cette étape, la composition du milieu et la sélection des substrats marqués sont deux facteurs clés. Pour éviter les bruits de mesure à partir de carbone non-étiquetées dans les suppléments nutritifs, Un milieu minimal avec une seule source de carbone est nécessaire. En outre, le choix d&#39;un substrat marqué est basé sur l&#39;efficacité avec laquelle il élucider la voie en cours d&#39;analyse. Parce que de nouvelles enzymes impliquent souvent la stéréochimie réaction différente ou des produits intermédiaires, en général, substrats carbonés individuellement étiquetés sont plus informatifs pour la détection de nouvelles voies que celles marqué uniformément pour la détection de trois nouvelles voies, 4. Deuxièmement, nous analysons les modèles d&#39;étiquetage aminés acides par GC -SM. Les acides aminés sont abondants dans les protéines et peuvent ainsi être obtenus par hydrolyse de la biomasse. Les acides aminés peuvent être dérivés par la N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) avant la séparation GC. TBDMS dérivés des acides aminés peuvent être fragmentés par MS et aboutir à des tableaux différents de fragments. Basé sur la masse à charge (m / z) Le ratio des fragmentée et non fragmentés d&#39;acides aminés, on peut en déduire les motifs possibles de l&#39;étiquette centrale métabolites qui sontprécurseurs des acides aminés. Troisièmement, nous traçons les transitions de carbone 13C dans les voies proposées et, sur la base de données isotopomère, confirmer si ces voies sont deux actifs. Mesure des acides aminés fournit des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur crucial dans le métabolisme central. Ces nœuds métaboliques clés peuvent refléter les fonctions des associés voies centrales. 13 Analyse du métabolisme C-assistés par l&#39;intermédiaire protéinogènes acides aminés peuvent être largement utilisés pour la caractérisation fonctionnelle du métabolisme microbien mal caractérisé 1. Dans ce protocole, nous allons utiliser Cyanothece 51142 que la souche modèle pour démontrer l&#39;utilisation de substrats de carbone marqué pour la découverte de nouvelles fonctions enzymatiques.

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d&#39;étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.

Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K vues.  Washington University. 13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d'étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Recherche

Biologie

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

Une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Développement d&#39;inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l&#39;étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines