Cette recherche a été financée par des fonds provenant de la Yale Climate and Energy Institute et la National Science Foundation américaine.

1. Grasshoppers élevage Under Stress et stress Conditions gratuits <ol><li> Utiliser 0,5 m 2 circulaire, mésocosmes fermées pour empêcher l&#39;émigration ou l&#39;immigration des espèces animales (Figure 1). Construire mésocosmes en utilisant 2,4 m de longueur de 1,5 m de hauteur ¼ &quot;barrière de treillis en aluminium comme un échafaudage. Couvrir la clôture de 2,5 m de longueur 1,75 m en aluminium moustiquaire haute replié sur le haut et le bas de la clôture et agrafées le long pli. Participez à la clôture extrémités pour former un cercle fermé et puis agrafer la fenêtre chevauchement dépistage de concert pour créer un joint. Réglez le mésocosme dans le sol dans le champ en creusant à 10 cm de profondeur de 4 cm large tranchée autour de la base du mesocosom, couler le mésocosme en la tranchée et tasser le gazon puis de la tranchée autour de la partie creuse de la mésocosme. Staple un morceau circulaire de store de fenêtre à la partie supérieure de la mésocosme. </li><li> Mésocosmes tableau reproduit dans une désignation expérimentale jumelén dans le domaine. Emplacements des parcelles doit être sélectionné en fonction de l&#39;identité des espèces végétales et de la couverture végétale par rapport. Sink cages de 10 cm dans le sol sur le site de parcelle. </li><li> L&#39;aide d&#39;un filet fauchoir, recueillir précoces (2 e) des stades nymphes de sauterelles et de les stocker dans les mésocosmes à des densités naturelles de terrain. </li><li> L&#39;aide d&#39;un filet fauchoir, capturer des individus de position dominante sit-and-wait chasse (non web tissage) araignée espèces prédatrices. Colle fermer la chélicères araignée (pièces buccales servant à maîtriser leurs proies) avec du ciment à séchage rapide à des effets de risque découplés de sélection favorisant la survie réelle sauterelles individuels avec de meilleures capacités d&#39;échapper à la prédation araignée. Stocker les araignées à des densités de terrain à l&#39;un mésocosme de chaque paire. Ce sera le traitement du stress. Mésocosmes sans araignées sera le traitement sans stress. </li><li> Laissez nymphes de sauterelles se développer à la fin (4 e et 5 e) étapes larvaires. Ramassez tous les individus des cages et randomly affecter des personnes de chaque cage à l&#39;un des trois groupes de dosage suivantes: (1) la validation de l&#39;état de stress physiologique, (2) la validation de changement de corps élémentaire stoechiométrie; décomposition microbienne (3). </li></ol> 2. Validation État de stress Grasshopper <ol><li> Mesurer le taux métabolique standard sauterelle (SMR), selon le taux d&#39;émission de dioxyde de carbone ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ) Dans un écoulement continu incurrent système respirométrie avec un débit d&#39;air de 200 ml / min. Enlever la vapeur d&#39;eau en faisant passer de l&#39;air s&#39;écoulant à travers un agent desséchant. </li><li> Suite à la privation de nourriture de 16 h (l&#39;eau doit être disponible), peser sauterelles individuels (± 0,1 mg), et les placer dans transparent de 50 ml (9,2 cm L x 2,0 cm P) chambres respiromètre et leur permettre de se remettre de la manipulation pendant au moins 10 min avant le début des mesures. </li><li> Sous moyenne constante température ambiante<html> température (température de ± 1% de variation de l&#39;erreur-type) dans la chambre respiromètre, analyser l&#39;air respiré à l&#39;aide d&#39;une infra-rouge analyseur de CO 2 (par exemple Qubit résolution ppm S151-1). Mesurer la moyenne minimale en régime permanent <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> pendant 10 min. </li><li> L&#39;analyseur fournit CO 2 concentration fractionnelle (parties par million), mais SMR doit être signalé comme un taux, donc il faut transformer les enregistrements comme <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> FR = i ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ) / {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - (1/RQ)]}, oùiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt; = concentration fractionnelle incurrent de CO 2; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = Concentration fractionnelle exhalant de CO 2; taux d&#39;écoulement FR = (ml min -1); QR = quotient respiratoire, supposé égal à 0,85 dans herbivores. </li></ol> 3. Maj valider en Stoechiométrie Élémental Corporel <ol><li> Évaluer carbone: azote (C: N) contenu d&#39;un échantillon de sauterelles recueillies auprès des mésocosmes sur le terrain. </li><li> Réduire les variations dans C: N due à la consommation alimentaire récente en supprimant le contenu des intestins sauterelles sous un microscope à dissection. </li><li> Lyophiliser l&#39;intestin vide et le corps pendant 48 heures, puis rectifier la carcasse individuelle et de l&#39;intestin pour obtenir une poudre homogène. </li><li> Mesurer C: teneurs en azote de la poudre à l&#39;aide d&#39;un auto-analyseur CNH. </li></ol> 4.La décomposition microbienne <ol><li> Lieu reproduit paires de colliers en PVC (15,4 cm de diamètre., Inséré ~ 4 cm dans le sol) dans le site d&#39;étude (figure 3C). Retirez toute la végétation en eux par l&#39;intermédiaire écrêtage à la surface du sol. Ces colliers sont utilisés pour des mesures de décomposition. En outre, établir un ensemble de colliers en PVC à travers le lieu de travail pour agir comme 13 C naturelle de l&#39;abondance des contrôles (voir ci-dessous), à laquelle ni les sauterelles, ni herbe litière sont ajoutés. </li><li> Pour un collier de chaque paire ajouter 2 intactes, lyophilisés carcasses de sauterelles (enregistrement de la biomasse dans l&#39;original) élevés avec des risques prédateur tel que décrit ci-dessus en utilisant le terrain cages. Pour l&#39;autre collier de chaque paire ajouter 2 intactes lyophilisés carcasses élevés sans risque prédateur. </li><li> Couvrir les colliers en PVC avec un écran pour empêcher le retrait sauterelle par les charognards des parcelles et de laisser les carcasses de sauterelles se décomposer pendant 40 jours. </li><li> Alors que les carcasses se décomposent étiquette, de l&#39;herbe-litter avec 13 C. <ol><li> Construire une chambre en plexiglas transparent (60 cm x 60 cm x 1,5 m) avec une entrée et une vanne de sortie (figure 3B). </li><li> Lavabo de 60 cm carrés x 60 cm Cadre en bois avec un joint en caoutchouc enduit de graisse silicone de 5 cm dans le sol (figure 3B). </li><li> Glisser la chambre au-dessus du cadre en bois de sorte que la chambre est fermée par le caoutchouc (Figure 3B). </li><li> Connectez les entrées de la chambre de bouteilles de gaz comprimé contenant 99% atomique 13 CO 2. Plantes à l&#39;intérieur de la chambre sera marqué par 13 C, où concentrations de CO 2 sont maintenus à des niveaux ambiants (parce que les concentrations de levage modifie la répartition du carbone végétal). Les niveaux ambiants sont maintenus que par pulsation marquée CO 2 pendant de courtes périodes de temps. En outre, les températures de la chambre sont surveillés et les chambres sont retirés si la température atteint 5 ° C parbove ambiante. </li><li> Une semaine après l&#39;étiquetage, comparer δ 13 C de l&#39;herbe-à litière avec des valeurs d&#39;abondance naturels recueillies auprès d&#39;un échantillon aléatoire d&#39;espèces de graminées identiques à l&#39;aide d&#39;un thermo DeltaPlus spectromètre de masse isotopique (Thermo, San Jose, CA, USA). </li></ol></li><li> Après 40 jours, ajouter 10 g de séchage à l&#39;air marqué au 13 C herbe litière pour chaque collier qui avait été modifié antérieurement par des carcasses de sauterelles. </li><li> Surveiller le taux de minéralisation de l&#39;herbe litière in situ dans 75 jours par plafonnement chaque collier et le suivi à la fois la respiration totale du sol et la respiration de 13 CO 2. Ceci est accompli en utilisant un flux continu technique de la chambre où des échantillons de gaz de chaque collier sont surveillés en temps réel, pendant 8 minutes chaque cavité ring-down utilisant la spectroscopie (CRDS; Picarro Inc, Santa Clara, CA, USA; Modèle: G1101 -i). CRDS permet de suivre simultanément total et δ 13 Cla respiration du sol. </li><li> Estimer la contribution de 13 C marqué l&#39;herbe litière à la respiration totale du sol en utilisant les équations de mélange d&#39;isotopes. La quantité d&#39;herbe litière dérivés de CO 2 est calculé comme suit: (. Δ 13 C respiration - δ 13 C nat.abn) C-herbe litière dérivée = C × totale / (δ 13 C herbe litière - δ 13 C nat . abn), où C total est la quantité totale de C respiré pendant une mesure donnée, δ 13 C respiration est le δ 13 C du respiré-C pour les colliers modifiée avec de la litière d&#39;herbe étiquetés, δ 13 C nat.abn. est la moyenne δ 13 C de C respiré dans les trois colliers abondance naturels (ceux qui n&#39;ont pas été modifiés avec de la litière), et δ 13 C herbe litière est le δ 13 C de la litière d&#39;herbe ajoutée à la coopérationllars. </li><li> Surveiller la température du sol et l&#39;humidité à travers l&#39;expérience en utilisant des sondes à main pour corriger les différences dans la respiration du sol dus aux différences de température et d&#39;humidité. </li><li> Bien que destiné à une utilisation terrain, l&#39;appareil de spectroscopie cavité ring-down (Picarro Inc, Santa Clara, CA, USA; Modèle: G1101-i) lectures sont sensibles au mouvement. Par conséquent, il convient de construire une station de mesure de base au centre de toutes les parcelles contenant des colliers en PVC, et brancher l&#39;instrument sur les colliers avec des longueurs de tuyau en PVC. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodical+cicadas+and+resource+pulses+in+North+American+forests.">Periodical cicadas and resource pulses in North American forests.</a> Science. 306, 1565 (2004).</li><li>Belovsky, G. E., Slade, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+herbivory+accelerates+nutrient+cycling+and+increases+plant+production.">Insect herbivory accelerates nutrient cycling and increases plant production.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14412 (2000).</li><li>Frost, C. J., Hunter, M. 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Nous n&#39;avons rien à déclarer.

La séquence des méthodes présentées ici devraient permettre une mesure systématique de la contrainte manière espèces comprenant les réseaux trophiques-dessus du sol peut prime communautés microbiennes du sol dans les chemins qui mènent à une altération de la décomposition subséquente de la litière végétale. Les méthodes sont idéales pour étudier les écosystèmes constitués de consommateurs arthropodes et les plantes herbacées, car les réseaux trophiques intacts peuvent être spatialement circonscrite et contenue dans les mésocosmes. La variabilité spatiale peut exister en raison de gradients d&#39;humidité du sol de fond, la température du sol, la teneur en éléments nutritifs des plantes, etc Le plan de l&#39;étude permet de mescosms tableau et des colliers en PVC pour bloquer le long de gradients environnementaux spatiales et ainsi tenir compte des variations de l&#39;environnement tels lors de l&#39;analyse des effets. Bien que destiné à une utilisation terrain, l&#39;appareil de spectroscopie cavité ring-down (Picarro Inc, Santa Clara, CA, USA; Modèle: G1101-i) sont des lectures soinsitive au mouvement. Par conséquent, il convient de construire une station de mesure de base au centre de toutes les parcelles contenant des colliers en PVC, et brancher l&#39;instrument sur les colliers avec des longueurs de tuyau en PVC. Décomposition de la litière du sol a toujours été mesurée en plaçant des quantités connues de litière dans des sacs en filet en fibre de verre, déposer les sacs sur la surface du sol sur le terrain et périodiquement re-mesurer les sacs à quantifier la vitesse de disparition de la litière (décomposition). La limitation de cette méthode est que l&#39;on n&#39;est pas en mesure de retracer le destin de la matière décomposée ou de déterminer la contribution du CO 2 minéralisation de l&#39;amendement du sol (litière ajoutée) à partir du sol CO fond 2 de la minéralisation. La méthode des traceurs marqués à l&#39;aide de CO 2 présentée ici permet d&#39;atténuer cette contrainte logistique. L&#39;écologie et biogéochimie des écosystèmes exploités dans le paradigme de travail que parce que des plantes non consommésLitière comprend la majorité des détritus, les processus des écosystèmes souterrains ne sont que marginalement influencé par les apports de la biomasse par rapport aux niveaux trophiques supérieurs dans la chaîne alimentaire hors sol, comme les herbivores eux-mêmes 6. Cependant, il existe des preuves de plus en plus que les espèces des niveaux trophiques supérieurs des écosystèmes peuvent avoir une profonde influence sur les processus de 1,4,5 souterraines. La méthode présentée ici est d&#39;améliorer la quantification de la contribution des niveaux trophiques supérieurs, soit directement par la biomasse de dépôt carcasse (par exemple 12, 13) ou de l&#39;excrétion et égestion (par exemple 14, 15), soit indirectement par l&#39;altération de la composition des communautés végétales (par exemple 9 ) sur le cycle des éléments nutritifs des écosystèmes. Cette quantification peut aider à révéler les mécanismes par lesquels les animaux contrôlent la dynamique des écosystèmes dans le cadre d&#39;un effort concerté pour améliorer et réviser le paradigme actuel de travail de contrôle biotique sur le fonctionnement des écosystèmes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Cavité en anneau vers le bas spectroscope </td><td> Picarro Inc, Santa Clara, Californie, USA </td><td> Modèle n ° G1101-i </td><td></td></tr><tr><td> CO2 respiromètre </td><td> Qubit Systems, Kingston, ON, Canada </td><td> Modèle # S151 </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Thermo, San Jose CA, USA </td><td> Modèle: Delta V Plus spectrophotomètre de masse isotopique </td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

La quantité et la qualité des détritus qui entrent dans le sol détermine la vitesse de décomposition par les communautés microbiennes ainsi que les taux de recyclage de l&#39;azote (N) et de 1,2 séquestration du carbone (C). Litière végétale comprend la majorité des détritus 3, et ainsi de suite, on suppose que la décomposition n&#39;est que marginalement influencé par les apports de biomasse provenant d&#39;animaux tels que les herbivores et les carnivores 4,5. Toutefois, les carnivores peuvent influencer la décomposition microbienne de la litière végétale par une chaîne d&#39;interactions dans lesquelles le risque de prédation modifie la physiologie de leurs proies herbivores qui à son tour modifie le fonctionnement microbienne du sol lorsque les carcasses d&#39;herbivores sont décomposés 6. Une réponse physiologique au stress par des herbivores au risque de prédation peut changer le répertoire C: N composition élémentaire de la biomasse herbivore 7,8,9 parce que le stress augmente le risque de prédation de la demande d&#39;énergie herbivores basales que dans les systèmes de forces en éléments nutritifs limitée herbivores à déplacer leur consommation de N-riches ressources pour soutenir la croissance et la reproduction à des ressources d&#39;hydrates de carbone C-riches pour soutenir le métabolisme accru 6. Les herbivores ont une capacité limitée pour stocker les nutriments en excès, tellement stressé herbivores excrètent N, car ils augmentent la consommation d&#39;hydrates de carbone C 7. En fin de compte, en proie souligné le risque de prédation augmentent leur corps C: N ratio 7,10, ce qui les rend plus pauvres des ressources de qualité pour la piscine microbienne du sol probablement due à une plus faible disponibilité de N labile pour la production de l&#39;enzyme microbienne 6. Ainsi, la décomposition des carcasses d&#39;herbivores stress a un effet d&#39;amorçage sur le fonctionnement des communautés microbiennes qui diminue la capacité ultérieure à des microbes pour décomposer 6,10,11 litière végétale. Nous présentons la méthodologie pour évaluer les liens entre les risques de prédation et de décomposition de la litière par les microbes du sol. Nous décrivons comment: induire un stress chez les herbivores du risque de prédation; meaque ces réactions de stress, et de mesurer les conséquences sur la décomposition microbienne. Nous utilisons un aperçu d&#39;un modèle d&#39;écosystème des prairies comprenant la chasse araignée prédateur (Pisuarina mira), un herbivore dominant sauterelle (Melanoplus femurrubrum), et une variété de plantes herbacées et graminées 9.

Une parcelle exemple de sauterelles standards taux métaboliques dans des conditions de stress et le stress libres sont présentés dans la figure 2. En raison des différences de masse corporelle chez les sauterelles individuels, et le fait que le taux métabolique varie en fonction de la masse corporelle, les parcelles devraient présenter des taux métaboliques par rapport à la masse corporelle sauterelle. Tendances parallèles pour les différents traitements indiquent que le taux métabolique augmente avec un multiple constant du taux métabolique standard (ie il n&#39;y a pas de masse corporelle x taux d&#39;interaction métabolique) pour tous les individus stressés. Grasshopper corps C et teneurs en azote élémentaire à des risques et des conditions libres sont présentés dans le tableau 1. Il est à noter qu&#39;il ya une très faible (4%) différence dans le corps ratios C: N entre les traitements. Néanmoins, ces petites différences peuvent se traduire par de grandes différences dans la décomposition des litières herbe près de la piscine microbienne du sol (figure 3). </p&gt; Ajoutant de la litière d&#39;herbe à des colliers en PVC modifiées précédemment avec des sauterelles stressées ou sans stress conduit à différents degrés de décomposition de la litière, comme en témoignent les courbes décrivant cumuler dégagement de CO 2 dans le sol en raison de la respiration microbienne (Figure 3). Les expériences doivent être surveillés jusqu&#39;à cumuler les courbes commencent à saturer. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Stress </td><td> Stress Free </td></tr><tr><td> Carbone (%) </td><td> 48,44 ± 0,32 </td><td> 44,73 ± 0,46 </td></tr><tr><td> Azote (%) </td><td> 12,11 ± 0,08 </td><td> 11,62 ± 0,12 </td></tr><tr><td> Carbone: azote </td><td> 4,00 ± 0,03 </td><td> 3,85 ± 0,04 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Comparaison de la composition chimique de la voiture herbivore sauterellecarcasses de conditions dans lesquelles ils sont confrontés risque de prédation (stress) et dans laquelle le risque de prédation était absent (sans stress). Les valeurs sont la moyenne ± 1 erreur standard. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Illustration de la conception du champ mésocosmes utilisés dans l&#39;expérience et l&#39;économie de l&#39;évaluation expérimentale des effets des risques sur la décomposition de la litière. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Une parcelle de taux métabolique herbivore-type par rapport à la masse corporelle des herbivores. Les données sont divisées en deux classes selon les traitements expérimentaux: sauterelles de mésocosmes contenant des prédateurs (prédation) pour induire le stress et mésocosmes sans prédateurs (contrôle) et donc pas de stress induit. Les données sont tirées D. Halwenaet Schmitz JO 2010, non publié. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> Figure 3. Courbes décrivant cumulatif dégagement de CO 2 près de la piscine tout en décomposition microbienne expérimentales apports de litière d&#39;herbe dans des colliers en PVC. Valeurs représentées sont la moyenne ± 1 erreur standard. Le graphique montre que les sols amorcée avec des carcasses de sauterelles stressés (prédateur) se traduisent par 19% de moins (ANOVA F = 1,6 9,06, P &lt;0,05) les taux de décomposition de la litière végétale que les sols amorcées avec des carcasses de stress sauterelles libres (contrôle). L&#39;encart représente le dispositif de collier de PVC dans le domaine. Figure reproduite à partir Hawlena et al. 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">Cick ici pour agrandir la figure</a> .

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Nous présentons les méthodes pour évaluer le risque de prédation peut altérer la qualité chimique des proies herbivores en induisant des changements alimentaires pour répondre aux besoins de stress accru, et comment la décomposition des carcasses de ces herbivores stress ralentit après décomposition de la litière végétale par les microbes du sol.

Lier le risque de prédation, stress physiologique et Herbivore décomposition microbienne de la litière végétale

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

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12.9K vues.  Yale University. Nous présentons les méthodes pour évaluer le risque de prédation peut altérer la qualité chimique des proies herbivores en induisant des changements alimentaires pour répondre aux besoins de stress accru, et comment la décomposition des carcasses de ces herbivores stress ralentit après décomposition de la litière végétale par les microbes du sol.

Vidéo: Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Test de la barrières physiologiques à la transmission virale chez les pucerons avec microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

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Biologie

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Surveillance des hormones végétales Durant les réponses au stress

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Profilage de masse Oligo (OLIMP) de polysaccharides extracellulaires

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block microcosmes pour la décomposition des tissus végétaux contrôlés par des champignons aérobie

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbivores induite Volatiles Blueberry et intra-usine de signalisation

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Combinaison de la microscopie de compensation et de fluorescence pour visualiser les changements dans l’expression génique et les réponses physiologiques à Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

Greffe de semis évolutive, flexible et rentable

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...