Notre protocole permet des aperçus uniques dans les mécanismes moléculaires et en vrac de niveau de tissu de vasculogenèse qui peuvent aider dans la vascularature fonctionnelle d’ingénierie pour la thérapie cardio-vasculaire de maladie dans la modélisation. Ce protocole permet la création de réseaux vasculaires robustes et tridimensionnels pour évaluer le potentiel vasculogénique de diverses plates-formes, et fournit également un pipeline informatique open source gratuit pour analyser la topologie finale du réseau. Commencez par ajouter 250 microlitres de solution de détachement cellulaire par puits de la culture cellulaire différenciée D5D6 pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, utilisez une pointe de pipette P1000 pour dissocier les cellules en suspensions à cellule unique. Mettre en commun les solutions cellulaires dans un seul tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Nous suspendons la pastille dans 200 microlitres de tampon de tri à froid glacé et étiqueter les cellules avec cinq microlitres d’anticorps CD34 conjugués à fluorescence concentrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les cellules en cinq mililitres de tampon de tri à froid glacé. Filtrer la suspension à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres, ou FACS. Avant d’exécuter l’échantillon, trier une fois 10e des quatrièmes cellules non étiquetées sur le fluocitomètre, en gébant une région à une intensité de fluorescence élevée qui ne contient aucune des cellules non étiquetées pour servir de contrôle négatif.
Trier ensuite l’échantillon étiqueté contient des progéniteurs endothéliales dérivés de cellules souches pluripotentes induites en fonction de leur forte expression CD34. À la fin du tri, transférer les cellules progénitrices endothéliales dans un tube de microcentrifugeuse pour centrifugation. Pour l’encapsulation d’hydrogel de collagène des cellules progénitrices, nous suspendons la pastille triée de cellules dans 200 microlitres du milieu de croissance endothélial 2, complétée par 10 micromiliter de l’inhibiteur de ROCHE Y-27632.
Ajouter les cellules à 400 microlitres de milieu d’ensemencement dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 mililiter sur la glace. Mélanger 350 microlitres de collagène dans la suspension cellulaire. La solution deviendra jaune pâle.
Ensuite, mélangez dix microlitres d’hydroxyde de sodium 1-Muller dans le collagène et la solution cellulaire. La solution va maintenant devenir rose vif. Pipette 56 microlitres de cette solution neutralisée de cellule de collagène dans les puits individuels d’une plaque de culture de cellules u-bas de fixation bien ultra-faible pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, examiner les puits au microscope à champ lumineux pour vérifier que les cellules ont été réparties uniformément. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu de croissance endothéliale 2 fraîchement préparé, complétés par inhibiteur rock et facteur vasculaire de croissance endothéliale à chaque puits et retournez la plaque à l’incubateur de 37 degrés Celsius. Après une semaine de culture, ajouter 250 microlitres de 4% de paraformaldéhyde à un puits d’une plaque de puits de 48 par hydrogel et retirer le milieu des hydrogels.
Ensuite, utilisez des pinces à pointe fine pour transférer les hydrogels vers le paraformaldéhyde contenant des puits. Après 10 minutes à température ambiante, laver rapidement les hydrogels avec du PBS et perméabiliser les cultures 3D avec 250 microlitres d’un surfactant non ionique de 0,5 % pendant cinq minutes à température ambiante. Laver les hydrogels avec deux lavages de cinq minutes à température ambiante avec 250 microlitres de PBS, complétés par 300 millilitres de glycine par lavage, suivi de l’immersion de chaque hydrogel dans 250 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.
Étiquetez les cellules avec les anticorps primaires appropriés dilués dans le tampon de blocage pendant la nuit à quatre degrés Celsius, suivis de deux lavages dans le réélificateur émulsifiant de 0,5% et du PBS de Dulbecco. Après le deuxième lavage, étiquetez les cellules avec l’anticorps secondaire spécifique à l’espèce approprié pendant deux heures à température ambiante à l’abri de la lumière, avant de laver les cultures 3D deux fois dans 0,5% émulsifiant réaccènement et PBS de Dulbecco, comme démontré. Pour visualiser les noyaux cellulaires, ajouter le DAPI, dilué à une concentration d’un à 10 000 dans PBS aux échantillons pendant une incubation de deux minutes à température ambiante, suivi de deux lavages dans un rééditant émulsifiant à 0,5 % et du PBS de Dulbecco.
Utilisez ensuite des pinces à pointe fine pour transférer chaque échantillon à un récipient d’observation approprié. Après différenciation, tri et encapsulation dans les hydrogels de collagène, les cellules resteront généralement arrondies pendant 24 heures, avant de commencer à migrer et à former des lumens initiaux. Après environ six jours de culture, un plexus capillaire primitif sera visible dans l’hydrogel lorsqu’il est vu avec une microscopie de champ lumineux.
Après avoir imagerie des hydrogels fixes, tachés et chargés de cellules sur un microscope confocal, les images pré-traitées sont converties en un squelette qui permet une analyse de la longueur globale et de la connectivité du réseau. Il est impératif d’ajouter des antibiotiques après facs, car la stérilisation de l’intérieur de cet instrument est difficile, et d’enlever les antibiotiques 24 heures après l’encapsulation cellulaire. En utilisant cette technique, nous avons pu déterminer quelles caractéristiques physiques et chimiques la matrice extracellulaire imitant les biomatériaux régissent le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliales dérivés de l’iPSC.
