Dominic Mills a été soutenu par une Bloomsbury collèges PhD stagiaire (2007-2010). Les auteurs tiennent à remercier tous les deux Ozan Gundogdu et Abdi Elmi pour leur aide dans l&#39;élaboration du modèle VDC.

1. La croissance de monocouches CEI sur spéciaux 0.4 Filtres um <ol><li> Cellules Caco-2 Culture en milieu essentiel modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 1% (v / v) les acides aminés non essentiels dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO 2 et 95% d&#39;air. Seed 4 x 10 5 cellules Caco-2 par les IEC 0,4 um filtrent et poussent à la polarisation pendant 21 jours, en changeant les médias tous les 2-3 jours. </li><li> Mesurer la TEER pour confirmer l&#39;état de polarisation de la monocouche en utilisant un appareil de mesure de résistance Volt-Ohm. Dans nos études, le TEER de 21 jours Caco-2 des cellules cultivées dans ces filtres de 0,4 um est 700-800 Qcm2. </li></ol> 2. Préparation de C. jejuni et le milieu bactérien pour le test de co-culture <ol><li> 24 heures avant le point de départ souhaitée du test de co-culture VDC, préparer une plaque de gélose au sang frais de C. jejuni et incuber à 37 ° C dans des conditions microaérobies (85% de N 2, 5% de O 2, et 10% de CO 2) dans l&#39;atmosphère variables incubateur. </li><li> Dans le même temps, préincuber 30 ml de bouillon Brucella à 37 ° C dans des conditions microaérobies dans une atmosphère incubateur variable. </li></ol> 3. Préparation et stérilisation de la moitié Chambers VDC avant l&#39;essai <ol><li> Chambres immerger complètement VDC demi ainsi que les joints toriques et les bouchons dans la solution de stérilisation. </li><li> Utilisation d&#39;une seringue de 20 ml stérile, rincer la solution de stérilisation à travers les arrivées de gaz dans les deux demi-chambres. Ne pas le faire peut entraîner la contamination des échantillons au cours de co-culture. </li><li> Laisser tous les composants immergés dans la solution de stérilisation à&gt; 1 h. </li><li> Rincer tous les composants avec de l&#39;eau stérile frais, en utilisant une autre seringue de 20 ml stérile pour rincer les entrées de gaz. </li></ol> 4. Préparationde l&#39;inoculum bactérien <ol><li> Récolter un demi-plaque de C. croissance jejuni à partir de la plaque de gélose au sang préparé la veille dans 1 ml de bouillon de brucella préincubé. Ceci devrait vous donner ~ 10 10 UFC / ml. </li><li> Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à 600 nm à semiquantify unités formatrices de colonies bactériennes (UFC). </li><li> Régler la suspension bactérienne au niveau de l&#39;inoculum désiré dans 4 ml de bouillon de brucella préincubé. </li><li> Effectuer une dilution en série de cette suspension bactérienne finale suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l&#39;atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d&#39;UFC bactériennes présentes dans l&#39;inoculum. </li></ol> 5. Mise en place du VDC <ol><li> Placez la moitié inférieure de la chambre un appartement VDC sur le banc. Monter un joint torique sur la demi-chambre basse. </li><li> Détacher un filtre portant les IEC de til porte et laver trois fois avec 400 pi de PBS stérile. Placer le filtre sur la moitié chambre basse, en s&#39;assurant que le joint torique reste en place. </li><li> Abaissez doucement la demi-chambre supérieure en place. Une fois les deux demi-chambres sont assemblées, serrer ensemble à l&#39;aide des plaques de serre-joints. Placez le VDC horizontalement sur la paillasse, avec les deux ouvertures vers le haut. </li><li> Ajouter les 4 ml d&#39;inoculum bactérien dans la moitié apicale chambre. </li><li> Ajouter 4 ml de milieu de culture de cellules dans la demi-chambre basolatérale. </li><li> Placer les pièces d&#39;extrémité dans les ouvertures sur les deux demi-chambres. </li></ol> 6. Fixation du VDC pour le collecteur de gaz au sein de l&#39;incubateur d&#39;Atmosphere variable <ol><li> Placer le VCC dans l&#39;atmosphère variables incubateur à proximité du collecteur de gaz. </li><li> Ouvrir le régulateur d&#39;alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fixer le tube à partir du collecteur dans l&#39;entrée de gaz sur la demi-chambre basolatérale de la VDC. Fixez le gas tuyau de sortie menant hors de l&#39;atmosphère variables incubateur à l&#39;une des sorties de l&#39;embout sur la demi-chambre basolatérale. </li><li> Fermez l&#39;autre sortie dans l&#39;embout sur la demi-chambre basolatérale. Ouvrez le flux de gaz sur le collecteur de gaz, en prenant soin de l&#39;ouvrir très lentement pour éviter de surpression de gaz, car cela peut conduire à l&#39;expulsion du milieu basolatéral. </li><li> L&#39;objectif est un débit de gaz de 1 bulle toutes les 2-5 secondes. Vérifiez périodiquement le débit de gaz au cours de l&#39;expérience et de l&#39;ajuster si nécessaire. </li></ol> 7. Démontage de la VDC après Coculture <ol><li> Après la période de co-culture approprié, fermer le régulateur d&#39;alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fermez le flux de gaz dans le VDC au niveau du collecteur. Déconnecter l&#39;entrée de gaz, la sortie de gaz et le bouchon du VDC. </li><li> Retirez le VDC d&#39;une atmosphère incubateur variable. Retirer le surnageant apical et basolatéral et conserver à -80 ° C pour subsequenanalyse t. </li><li> Enlevez les colliers de serrage et de prendre doucement à la VDC. Retirez le filtre de la chambre de moitié et le transfert d&#39;une boîte de culture de cellules de 6 puits stérile. Laver les IECS trois fois avec 400 pi de PBS stérile. </li><li> Pour le dénombrement du nombre total de bactéries interagissent, ajouter 400 pi de PBS stérile contenant 0,1% (v / v) de Triton X-100 à les IEC et incuber pendant 20 min à température ambiante pour lyser la CEI. Effectuer une dilution en série de ce lysat cellulaire suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l&#39;atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d&#39;interagir UFC bactériennes. </li><li> Pour le dénombrement du nombre total de bactéries envahissent, ajouter 400 ul de milieu de culture cellulaire DMEM contenant 150 ug / ml de gentamicine pour les IEC et les incuber pendant 2 heures dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO 2 et 95% air pour tuer les bactéries extracellulaires,puis suivre comme pour l&#39;étape 7.4 ci-dessus. </li></ol> 8. Nettoyage de la VDC après Coculture Laver le VDC avec de l&#39;eau stérile et stocker pour la prochaine série d&#39;expériences.

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

L&#39;utilisation de méthodes de culture cellulaire in vitro pour étudier les interactions entre les pathogènes bactériens avec des cellules hôtes est une technique largement utilisée dans de nombreux laboratoires de recherche. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l&#39;environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. La largement...

Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. L&#39;utilisation de ces tests en culture cellulaire, l&#39;adhérence des bactéries aux cellules hôtes, l&#39;identification des récepteurs de la cellule hôte, la cellule hôte voies de signalisation et l&#39;invasion bactérienne des cellules hôtes ont tous été étudiés en détail, ce qui entraîne de nombreuses observations importantes. Cependant, ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies qui peuvent ne pas être représentatifs de l&#39;environnement in vivo. Une limite importante de modèles in vitro utilisés pour étudier les infections gastro-intestinales est que les conditions de culture, y compris des niveaux élevés d&#39;oxygène sont généralement favorables à la survie des cellules eucaryotes. Toutefois, les conditions dans la lumière intestinale seront presque anaérobie. Pathogènes entériques dans un environnement très pauvre en oxygène expriment des gènes de virulence dont l&#39;expression change dans des conditions aérobies 2. Ainsi, les données obtenues en utilisant la norme de culture cellulaire modèles may donner une indication inexacte des interactions bactériennes avec des cellules hôtes. Campylobacter jejuni est la principale agent causal de la gastro-entérite aiguë bactérienne dans le monde entier, avec des symptômes allant de la diarrhée légère à grave entérite inflammatoire. La majorité des C. jejuni infections suite à une gastro-entérite sans complication, cependant C. jejuni est également agent infectieux le plus souvent mentionné dans les neuropathies périphériques, y compris le syndrome de Guillain-Barré (SGB). Au Royaume-Uni, on estime qu&#39;il ya plus de 500.000 cas d&#39;entérite causées par C. jejuni chaque année avec un coût prévu de l&#39;économie britannique de 580 millions de livres sterling. Dans le monde en développement, C. jejuni est la principale cause de mortalité chez les enfants. Malgré l&#39;importance incontestable de l&#39;infection à Campylobacter et des décennies de recherche, y compris l&#39;analyse fondée sur la génomique complète, C. jejuni pathogénie est encore mal understood, contrairement à d&#39;autres pathogènes entériques tels que Salmonella, Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae. L&#39;absence d&#39;un modèle pratique des petits animaux est l&#39;une des principales raisons de cette 3. Aussi le largement utilisé dans les modèles d&#39;infection in vitro sont plus inapproprié pour étudier microaerophilic C. jejuni que pour d&#39;autres pathogènes entériques qui sont anaérobies facultatives. Alors que C. jejuni est reconnu comme un pathogène invasif, les mécanismes de C. jejuni invasion des cellules épithéliales intestinales (SAVA) sont encore peu claire 4,5. C. invasion jejuni a été montré pour être dépendant soit microfilaments, microtubules, une combinaison des deux, ou ni 5. La confusion dans ce domaine est très probablement dû à l&#39;utilisation d&#39;inapproprié dans des conditions d&#39;essai in vitro. Un certain nombre d&#39;essais de culture de cellules ont été utilisées pour étudier les interactions de C. jejuniavec des cellules hôtes. Caco-2 6 INT 407 7, 8 et T84 lignées cellulaires ont été utilisées pour étudier les capacités d&#39;adhérence et l&#39;invasion de différentes C. souches jejuni. Toutefois, les niveaux d&#39;adhérence bactérienne et l&#39;invasion de C. jejuni avec les IEC sont considérablement inférieurs à ceux des autres pathogènes entériques 9. La co-culture de C. jejuni avec les IEC est normalement effectuée dans un incubateur à CO 2 dans des conditions proches de la teneur en oxygène dans l&#39;atmosphère, nécessaire pour la survie des CEI. C. l&#39;expression du gène jejuni sera très différent dans l&#39;environnement pauvre en oxygène de la lumière intestinale par rapport aux conditions de l&#39;oxygène atmosphérique. L&#39;utilisation d&#39;un système de chambre de diffusion verticale (VDC) a été développé qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz 1,10,11 et moyennes. Ce système imite les conditions de vie dans l&#39;intestin humain où les bactéries seront nonder conditions de très faible d&#39;oxygène des tissus tout en seront alimentés en oxygène du sang. IEC monocouches polarisées cultivées dans des filtres de 0,4 um spéciaux ont été placés dans un VDC créant un compartiment apical et basolatéral, qui ont été remplis individuellement avec le bouillon bactérien et un milieu de culture de cellules, respectivement (figure 1). Le VCC a été placée dans l&#39;atmosphère variables incubateur contenant 85% de N 2, 5% de O 2, et 10% de CO2 à 37 ° C, ce qui représente les conditions optimales pour C. jejuni. Le compartiment apical a été laissée ouverte et exposée à l&#39;atmosphère microaérobies à l&#39;intérieur de l&#39;atmosphère variables incubateur, tandis que le compartiment basolatéral scellé a été alimenté avec de l&#39;oxygène par l&#39;administration constant de 5% de CO 2 / O mélange gazeux de 95% 2, avec un tube de sortie empêchant l&#39;accumulation de pression . Caco-2 survie cellulaire et l&#39;intégrité de la monocouche dans ces conditions ont été confirmées par le suivi élément transepithelialrésistance ctrical (TEER) à travers la monocouche de plus de 24 h de démontrer la survie des cellules Caco-2, la monocouche cellulaire et la séparation physique des compartiments basolatéral et apical dans des conditions pauvres en oxygène dans le compartiment apical. Le TEER de monocouches dans CDV entretenues dans l&#39;atmosphère incubateur variable (conditions microaérobies) et dans une culture cellulaire CO 2 incubateur standard (conditions aérobies) n&#39;a pas montré de différences significatives, ce qui indique l&#39;intégrité de la monocouche cellulaire sous différentes conditions atmosphériques 1. Dans des conditions microaérobies, jonctions serrées sont restés présents et répartis uniformément entre les bordures de cellules avec un motif de coloration occludine similaire à des cellules maintenues dans des conditions aérobies 1. Les interactions de C. jejuni avec Caco-2 et T84 cellules dans le VDC a été étudiée en évaluant l&#39;interaction bactérienne (adhésion et l&#39;invasion) et l&#39;invasion. Deux différente C. jejuni de type sauvage strains ont été utilisés 1. C. jejuni 11168H est un dérivé hypermotile de la souche de la séquence originale NCTC11168. La souche 11168H montre les niveaux de colonisation beaucoup plus élevées dans un modèle de colonisation de poussin et est donc considérée comme une souche appropriée à utiliser pour les études sur les interactions hôte-pathogène. 81-176 est d&#39;isoler un humain et est l&#39;une des souches de laboratoire largement étudiés les plus envahissantes. C. souches jejuni ont été ajoutés au compartiment apical d&#39;un VDC vertu soit des conditions micro-aérobies ou aérobie. Nous avons observé des taux plus élevés pour les deux interaction et l&#39;invasion ont été enregistrées pour C. jejuni dans des conditions microaérobies 1. L&#39;augmentation C. interactions jejuni n&#39;étaient pas dues à une augmentation du nombre de bactéries dans des conditions microaérobies 1. Ces données confirment notre hypothèse que l&#39;environnement faible en oxygène dans le compartiment apical de la VDC améliore les interactions bactéries-hôte et indique que les propriétés invasives de C. jejuni sont incrassouplies dans ces conditions. Ce fut le premier rapport de l&#39;utilisation du modèle VDC pour étudier une bactérie pathogène invasif et souligne l&#39;importance d&#39;effectuer des essais d&#39;infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la situation in vivo. Le modèle VDC pourrait être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène pour de nombreuses espèces bactériennes différentes.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l&#39;environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. Nous avons développé un modèle in vitro de l&#39;infection qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz moyenne et. La Chambre de diffusion verticale (VDC) modèle reproduit les conditions de vie dans l&#39;intestin humain où les bactéries seront dans des conditions de très faible teneur en oxygène des tissus, tout sera alimenté en oxygène du sang. Placer cellulaires monocouches épithéliales intestinales polarisées (IEC) cultivés dans des inserts Snapwell dans un VDC crée compartiments apical et basolatéral séparés. Le compartiment basolatéral est rempli avec un milieu de culture cellulaire, étanche et perfusé avec de l&#39;oxygène WHILST le compartiment apical est rempli avec du bouillon, maintenu ouvert et incubés dans des conditions micro-aérobies. Les deux Caco-2 et T84 les IEC peuvent être maintenus dans le VDC dans ces conditions, sans aucun effet nocif apparent sur la survie de la cellule ou à l&#39;intégrité de la monocouche. expériences de co-culture réalisées avec différents C. souches de type sauvage jejuni et les différentes lignes d&#39;IEC dans le modèle VDC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical résultent reproductible par une augmentation du nombre d&#39;interagir (près de 10 fois) et des bactéries intracellulaires (presque 100 fois) par rapport aux conditions de culture aérobies 1. L&#39;environnement créé dans le modèle VDC rapproche le plus de l&#39;environnement rencontrés par C. jejuni dans l&#39;intestin humain et souligne l&#39;importance d&#39;effectuer des essais d&#39;infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la réalité dans vivo. Nous proposons que l&#39;utilisation du modèle VDC permettra de nouvelles interprétations des interactions parierWeen bactéries pathogènes et des cellules hôtes.

expériences de co-culture effectuées avec un C. jejuni souche et les IEC dans le modèle VCC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical de type sauvage ont montré une augmentation du nombre d&#39;interaction (près de 10) et les bactéries intracellulaires (près de 100 fois) par rapport à des conditions de culture aérobies dans un temps une manière dépendante. Cette observation était reproductible en utilisant deux différents C. jejuni souches de type sauvage (1...

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Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Effectuer des essais de culture cellulaire pour étudier l&#39;adhésion bactérienne et l&#39;invasion dans des conditions aérobies est généralement représentatif de la<em&gt; In vivo</em&gt; Environnement. Un modèle de chambre de diffusion verticale permet d&#39;étudier les interactions de l&#39;agent pathogène humain<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Avec des cellules épithéliales intestinales moins plus<em&gt; In vivo</em&gt; Des conditions similaires, résultant en une meilleure invasion bactérienne.

Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Est considérablement améliorée en utilisant une chambre diffusion verticale du modèle

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

13.7K vues.  London School of Hygiene & Tropical Medicine. Effectuer des essais de culture cellulaire pour étudier l'adhésion bactérienne et l'invasion dans des conditions aérobies est généralement représentatif de la In vivo Environnement. Un modèle de chambre de diffusion verticale permet d'étudier les interactions de l'agent pathogène humain Campylobacter jejuni Avec des cellules épithéliales intestinales moins plus In vivo Des conditions similaires, rés...

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In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Analyse d&#39;immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...