Ce protocole décrit le premier modèle apical-out dans une boîte et constitue une amélioration critique par rapport aux modèles entéroïdes latéraux basaux dans une boîte lors de l’établissement de la modélisation in vitro de thérapies potentielles destinées à une administration orale. Cette méthode permet d’accéder à la surface apicale des entéroïdes. Les composés peuvent être ajoutés aux milieux cellulaires et les composés sont absorbés par voie apicale comme ils le seraient in vivo.
Les chercheurs intéressés par l’établissement d’un système in vitro d’inflammation intestinale pour tester des thérapies orales potentielles peuvent trouver cette technique particulièrement utile. Les tissus provenant de différents âges et espèces peuvent nécessiter une normalisation plus poussée. Ainsi, les patients tout en établissant des temps d’inversion de polarité peuvent être nécessaires.
Pour inverser la polarité des entéroïdes 3D, aspirez les milieux de chaque puits d’une plaque de 24 puits d’entéroïdes basolatéraux 3D établis. Ajoutez 500 microlitres de cinq millimolaires glacés, d’EDTA ou de PBS à chaque puits d’une plaque de 24 puits et perturbez doucement mécaniquement l’extrait de membrane basale ou le dôme de matrice extracellulaire en pipetant de haut en bas cinq à six fois avec une pipette P 200. Transférer le contenu de quatre puits dans un tube chronique de 15 millilitres.
Ajoutez ensuite huit millilitres de PBS glacé à l’EDTA dans le tube. Transférer les 20 puits restants de la même manière. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure sur une plate-forme rotative ou un agitateur à 330 tr / min.
Après incubation, centrifuger les tubes et jeter le surnageant de chaque tube. Mélanger et laver les granulés avec cinq millilitres de DMEM F12. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et retirez le surnageant avant d’ajouter 12 millilitres de milieu sans antibiotiques dans le tube en veillant à ce que les granulés cellulaires soient remis en suspension.
Pippet 500 microlitres de la suspension entéroïde dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à cinq jours ou jusqu’à ce que les entéroïdes aient inversé la polarité. Le premier jour, en vous abstenant, transférer le contenu de quatre puits d’une plaque de 24 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Répéter pour tous les puits souhaités avec chaque traitement dans un tube séparé. Centrifuger les tubes et remettre en suspension la pastille dans 300 microlitres de 4% de fixateur d’aldéhyde à température ambiante. Après 30 minutes, lavez les granulés avec 500 microlitres de PBS.
Ajouter 500 microlitres de 0,1% Triton X 100 aux tubes. Incuber les tubes pendant une heure à température ambiante. Ensuite, placez les tubes sur un rotateur ou un agitateur à 200 tr / min pendant 15 minutes à deux à huit degrés Celsius.
Après la dernière incubation, ajouter 500 microlitres de NDS à 10% dans du PBS T et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Pendant l’incubation, préparer la solution d’anticorps primaires. Le lendemain, ajoutez 250 à 500 microlitres de PBS T aux tubes en fonction de la taille de la pastille, et placez-les sur le rotateur ou le shaker à 200 tr / min pendant une heure à deux à huit degrés Celsius.
Ajouter 200 microlitres de la solution d’anticorps secondaire et incuber les tubes à deux à huit degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain, procédez au montage des entéroïdes apical colorés en faisant tourner les tubes et en retirant 100 microlitres de surnageant. Remettez les cellules en suspension dans les 100 microlitres de surnageant restants et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 500 microlitres.
Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 secondes. Retirez le surnageant et remettez les pastilles en suspension dans 100 microlitres de coloration d’acide nucléique rouge à température ambiante. Après 20 minutes d’incubation, centrifuger les cellules et remettre les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS.
Après le deuxième lavage et la centrifugation, retirez 70 microlitres du surnageant et remettez les granulés en suspension dans le volume restant de PBS. Ensuite, transférez la suspension cellulaire sur un couvercle étiqueté de 24 x 60 millimètres. Appliquez 75 microlitres de support directement sur l’échantillon et retirez les bulles avec un embout de pipette.
Après une nuit de durcissement dans l’obscurité, appliquez une fine couche de glycérol sur les feuillets de couverture, puis montez les feuillets de couvercle sur la lame de verre et appuyez doucement en place. Appuyez pour supprimer les bulles entre le bordereau de couverture et la glissière. Laissez le couvercle reposer à température ambiante dans l’obscurité pendant deux heures avant d’imager les entéroïdes à un grossissement de 20 fois avec un microscope confocal.
Pour les traitements entéroïdes, établir une entérocolite nécrosante apicale dans un modèle de plat pendant 24 heures, comme décrit dans le manuscrit du texte. Avant d’effectuer le test, retirez 100 microlitres de média de chaque puits en laissant les 400 microlitres restants. Ajoutez 400 microlitres de réactif d’essai de viabilité cellulaire à chaque puits.
Mélanger vigoureusement le contenu sur une plaque agitateur pendant cinq minutes à 200 RPM pour induire la lyse cellulaire. Ensuite, transférez 200 microlitres dans un seul puits d’une plaque à fond clair de 96 puits. Répétez pour les 600 microlitres restants en créant quatre réplications techniques par puits.
À l’aide d’un lecteur de plaques capable de luminescence, enregistrez les valeurs à 0,25 milliseconde d’intégration et comparez les valeurs relatives entre les traitements. La coloration représentative par immunofluorescence du contrôle a confirmé la localisation apicale des noyaux vers la lumière et la détection du méchant au bord externe de l’épithélium. Par rapport au contrôle, l’exposition au lipopolysaccharide, à la nécrose tumorale alpha ou à l’hypoxie seule n’a pas induit de changements manifestes dans la morphologie cellulaire globale E-cadhérine ou la localisation du méchant ou l’intensité fluorescente.
Le traitement par lipopolysaccharide ou nécrose tumorale alpha en combinaison avec l’hypoxie a perturbé l’architecture épithéliale et a démontré une perte significative de jonction d’adhérence et d’expression de la protéine de bordure de brosse révélée par la perte de l’audition ECA et la coloration du méchant. La viabilité de la cellule apicale a été déterminée dans des conditions normoxiques ou hypoxiques. Dans des conditions normoxiques, par rapport au lipo polysaccharide témoin ou à la nécrose tumorale, la nécrose alpha n’a pas affecté de manière significative la viabilité cellulaire des entéroïdes.
Cependant, des réductions significatives de la viabilité ont été observées dans le lipopolysaccharide ou la nécrose tumorale alpha en combinaison avec l’hypoxie par rapport à l’hypoxie seule. Tout en établissant un modèle apical dans un plat. N’oubliez pas de garder l’EDTA dans la suspension cellulaire glacée.
Cela améliorera l’inversion de polarité et garantira que tous les ECM sont correctement liquéfiés et retirés. D’autres applications en aval telles que QPCR, RNA-seq, Western blot ou évaluations fonctionnelles de la perméabilité de la barrière peuvent être effectuées davantage pour caractériser la réponse à la signalisation inflammatoire dans l’hypoxie.
